정량적 Proteomics는 마우스 뇌 형성 사이의 중요한 차이점을 밝힙니다
Aug 23, 2022
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추상적인:노화는 인지 기능의 전반적인 감소와 관련이 있으며, 이는 시냅스 가소성의 조절에 관여하는 단백질 양의 변화로 인한 것으로 보입니다. 여기에서 우리는 총 단백질 접근법 기술을 사용하여 1개월 및 22개월 마우스의 세 가지 뇌 영역, 즉 해마, 대뇌 피질 및 소뇌에서 신경 전달에 관여하는 단백질의 정량적 분석을 제시합니다. 우리는 신경 전달 및 시냅스 가소성에 관련된 일부 단백질의 역가가 연구된 모든 뇌 형성에서 유사한 방식으로 노화에 의해 영향을 받지만 사실 각 형성이 고유한 노화 방식을 나타낸다는 것을 논증합니다. 일반적으로 해마 및 피질 단백질체는 소뇌 단백질체보다 일생 동안 훨씬 더 불안정합니다. 여기에 제시된 데이터는 생리적 노화가 시냅스 가소성에 미치는 영향에 대한 일반적인 그림을 제공하고 노화 방지 요법에 대한 잠재적인 약물 표적을 제안할 수 있습니다.
키워드:글루타메이트성 및 GABA성 전달; 캠2; 옥스포스; 세포외 기질; 총 단백질 접근; 해마; 피질; 소뇌
1. 소개
생리적 노화는 기억 형성 및 유지, 처리 속도 및 개념적 추론과 같은 인지 기능의 점진적인 저하와 관련이 있습니다[1]. 노화와 관련된 변화는 주로 신경 세포의 손실로 인해 발생한다는 것이 널리 받아들여지고 있습니다. 그러나 많은 연구에서 뉴런의 수보다 뉴런 네트워크 구조가 노화 동안 영향을 받는다고 제안했습니다[2-4]. 노화는 수상돌기의 단축과 그 수의 감소, 수지상 가시의 손실, 네트워크 내의 축삭 수의 감소, 수초화 수준 및 시냅스 손실과 관련이 있음이 입증되었습니다[5]. 또한, 글루타메이트성(LTP 및 LTD) 및 GABA성(iLTP 및 iLTD) 시냅스의 장기 강화 및 억제와 같은 뇌 가소성 현상의 기저에 있는 분자 메커니즘과 다양한 신경 조절 시스템의 효능이 나이가 들면서 감소하는 것으로 나타났습니다. 6,7]. 여러 연구에 따르면 노화와 관련된 인지 변화는 시냅스 전달 및 가소성에 관련된 단백질의 발현 및/또는 국소화의 변화를 수반합니다[6,8]. 설치류 뇌의 다양한 영역에서 단백질의 발현은 질량 분석 기반 단백질체 기술[9,10]과 마이크로어레이[11,12]에 의해 집중적으로 연구되었습니다.시스탄체 콜레스테롤그러나 Walter와 Mann의 연구[10]와 Duda et al.의 연구[8]를 제외하고 모든 연구는 연구된 샘플에서 단백질의 정확한 농도에 대한 정보를 제공하지 않는 반정량적 접근 방식을 사용했습니다.
최근에 우리는 어린(1-개월된) 및 성인(12-개월--) 쥐의 해마, 대뇌 피질 및 소뇌에서 신경 가소성과 관련된 단백질의 농도를 측정했습니다[8 ]. 우리는 평생 동안 단백질의 총량은 변하지 않았지만 신경 전달 및 신경 가소성 관련 단백질 역가는 어린 동물과 성인 동물 사이에 유의하게 차이가 있음을 발견하여 신호 전달 및 신경 가소성 약화의 증상이 중간에 관찰 될 수 있음을 나타냅니다. -단백체 수준에서 노화된 마우스 [8].
cistanche 캔 노화 방지
이 논문에서 우리는 어린(1-개월)과 노인(22-개월 ) 쥐, 주로 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린 및 모노아민 신호 전달에 관여하는 단백질 농도의 노화 관련 변화에 중점을 둡니다. 우리는 또한 신경 전달 물질 방출과 시냅스 연결의 형성에 관여하는 단백질 농도의 변화에 대해 논의합니다. 예를 들어, 시냅스 간 세포 접착 및 신경주위 그물 단백질과 같은 것입니다.
비표지 총 단백질 접근법(TPA) 방법을 사용하여 연구된 각 뇌 영역에서 7000개 이상의 단백질 역가를 측정했습니다[13]. 이 논문에서 우리는 지금까지 생쥐의 생리적 노화 동안 시냅스 가소성 관련 변화에 대한 가장 심층적인 정량적 단백질체 설명을 제시합니다. 우리가 아는 한, 이것은 지금까지 생쥐의 생리적 노화 동안 시냅스 가소성 관련 변화에 대한 가장 심층적인 정량적 단백질체 설명입니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 동물 및 조직 준비
뇌는 5마리의 암컷 C57BL/1{16}}P30(젊은) 마우스와 5마리의 22-개월령(나이 든) 마우스에서 분리되었습니다. 동물은 [8]에 설명된 대로 처리되었습니다. 간단히 말해서, 동물을 이소플루란으로 마취하고 참수하고 뇌를 얼음처럼 차가운 완충액(87mMNaCl,2.5mMKCl,1.25mMNaHNPO4,25mMNaHCO3,0.5mMCaClz,7mMMgSO, 25mM글루코스)에 이식했습니다. . 전체 뇌 영역: 각 동물의 오른쪽 해마, 오른쪽 반구의 전두엽 피질 및 소뇌의 오른쪽 반구가 정량적 단백질체학에 사용되었습니다.시스탄체 데저티콜라 부작용모든 절차는 지역 윤리 위원회(Wroclaw Ethical Committee, 허가 번호 10/2018)의 승인을 받았으며 실험에 사용되는 동물의 수를 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
2.2.조직 용해물의 준비
용해물은 [13]에 설명된 대로 얻었습니다. 분리된 구조를 용해 완충액(0.1 M Tris/HCl, 2% SDS, 5{7}} mM DTT, pH8.0)에서 균질화하고 99도에서 5분 동안 인큐베이션했습니다. 샘플을 보관했습니다. 단백질 분석까지{10}} 정도. 트립토판 형광은 샘플의 총 단백질 농도를 결정하기 위해 사용되었습니다[14].
2.3.다효소 분해 필터 보조 시료 전처리(MED FASP)
80 ug의 총 단백질을 함유하는 용해물은 시스테인의 알킬화 없이 MED FASP[15]에 사용되었습니다[16]. 단백질을 LysC로 밤새 절단한 다음 트립신으로 3시간 동안 소화시켰다. 효소 대 단백질 비율은 1:40이었습니다. 1mM DTI, pH 8.5를 첨가하여 50mM Tris-HCl에서 37도에서 소화를 수행하였다. [13] 8ug의 총 펩티드를 함유하는 분취량을 농축하고 질량 분석 분석까지 -20도에서 보관하였다.
2.4.액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법
펩티드 혼합물의 분석은 QExactive HF 질량 분석기(ThermoFisher Scientific, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 앞서 설명한 대로 수행되었습니다[13]. 데이터는 PRIDE 파트너 저장소[17]를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 기탁되었습니다. 데이터세트 식별자: PXD025978(사용자 이름: reviewer_pxd025978@ebi.ac.uk;password: QL3YI7nP).
2.5.단백질 데이터 분석
MS 데이터 분석에는 MaxQuant v1.2.6.20[18]이 사용되었습니다. UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스는 MS 및 MS/MS 펩타이드 데이터를 사용하여 단백질을 식별하는 데 사용되었습니다.
시스테인의 카르바미도메틸화는 고정된 변형으로 설정되었습니다.cistanche 복용량 레딧전구체 이온의 초기 허용 질량 편차는 최대 6ppm이었고 조각 질량의 경우 최대 20ppm이었습니다. 최대 거짓 펩티드 발견 비율은 0.01로 지정되었습니다. 총 단백질 접근 방법[19,20]은 개별 단백질의 양(c(i)이 강도(MSsignal(i))과 측정된 샘플의 allintensities(totalMSsignal)에 개별 단백질의 분자량(MW(i))을 곱합니다.
2.6.통계분석
데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 분산의 동등성은 Fisher F-검정을 사용하여 계산되었습니다. 두 실험 그룹 간의 차이를 결정하기 위해 스튜던트 t-검정이 사용되었습니다. 분석은 SigmaPlot 11 소프트웨어(Systat Software)를 사용하여 수행되었습니다.
3. 결과
전체 proteomic 데이터는 ProteomeXchange Consortium에 기탁되었으며 데이터세트 식별자 PXD0255978(username: reviewer_pxd025978@ebi.ac.uk;password: QL3YI7nP)로 사용할 수 있습니다. 허용되는 스펙트럼 분석 분석된 샘플에서 7547개 단백질의 정량화.시스탄체 추출물의 장점적어도 하나의 고유한 펩티드로 식별된 단백질이 분석에 사용되었습니다. 구체적으로 노령 동물의 해마, 피질, 소뇌 각각에서 7324,7088, 7343 단백질의 발현 데이터를 정량적으로 측정하여 PRIDE 파트너 저장소를 통해 ProteomeXchange Consortium에 기탁하였다. 어린 동물의 경우 해마, 피질 및 소뇌에 각각 7347, 7323 및 7526 단백질에 대한 데이터가 기탁되었습니다.
4. 글루타메이트 전달
뇌의 주요 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트는 이온성 및 대사성 수용체(mGluRs, Grm)를 통해 작용합니다. 이온성 수용체는 o-아미노-3-히드록시{2}}메틸{3}}이속사졸 프로피온산 수용체(AMPA 수용체, Gria), N-메틸-D-아스파테이트 수용체( NMDA 수용체, Grin), 카이네이트 수용체(Grik) 및 델타 수용체(Grid). 4.1.그리아
우리의 연구에 따르면 해마에서 가장 풍부한 글루타메이트 수용체는 Gria입니다. 그것들은 이종사량체 단백질(heterotetrameric protein)[21]이며, 우리는 Gria2 소단위가 젊고 나이든 쥐 해마 모두에서 가장 높은 역가로 발현된다는 것을 발견했습니다(그림 1A). 노화는 해마에서 Gria 수용체의 발현에 영향을 미치지 않았지만 Gria4는 노령 동물에서 현저히 감소했습니다. 그러나 Gria4의 역가는 Garcia 계열의 다른 구성원에 비해 일반적으로 매우 낮습니다.
대뇌 피질에서 Gria는 오래된 동물에서만 가장 보편적인 글루타메이트 이온성 수용체였습니다(그림 1B,D). 통계적으로, 피질에서 노화 동안 개별 Gria 소단위의 역가의 변화는 중요하지 않았지만 총 Gria 단백질 농도는 노령 동물에서 유의하게 증가했습니다(그림 1B).시스탄체 징기스칸해마와 유사하게 Gria2는 피질의 주요 동형체였습니다.
소뇌에서 가장 풍부한 글루타메이트 수용체는 Grial과 Gria2로 매우 유사한 수준으로 발현되었으며 노화는 농도에 영향을 미치지 않았습니다(그림 1C). 4.2.미소
NMDA 수용체는 시냅스 가소성에 중요한 칼슘 및 나트륨 이온에 대한 글루타메이트 의존성 이종사량체 채널이며[2] Grin isoform으로 구성됩니다[23]. 우리는 연구된 모든 뇌 구조에서 표현되는 Grin의 주요 형태가 Grin1이라는 것을 발견했습니다(그림 1A-C). 이 isoform의 농도는 해마와 소뇌의 노화에 영향을 받지 않았습니다. 그러나 피질에서 크게 감소했습니다(그림 1B). 전반적으로, Grin3a(노화의 영향을 받지 않고 다른 Grin 단백질에 비해 매우 낮은 수준으로 발현되는 수준)를 제외한 모든 NMDA 소단위의 총 농도는 노화된 피질에서 감소한 반면 소뇌에서는 변화가 없었습니다. 그림 1B,C). 해마에서 노화는 Grin 단백질의 총량과 Grin2b 및 Grin3a 동형의 통계적으로 유의한 감소에 의해 반영되었습니다.
4.3.그리드
Grid1과 Grid2는 소뇌에서 거의 독점적으로 발현되는 이온성 수용체이며 시냅스 가소성의 조절에 관여한다[24]. 우리는 소뇌에서 주요 동형이 Grid2이고 그 역가가 노화의 영향을 받지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 1C). 해마와 피질에서 각각 Grid1 및 Grid2의 농도는 노화된 동물에서 현저히 낮습니다. 그러나 이러한 수용체의 역가는 일반적으로 매우 낮습니다(그림 1A,B).
4.4.그릭
카이네이트 수용체는 이온성 및 대사성 전달을 매개하는 이종 나트륨 채널이다[25,26]. 우리의 분석은 Grik 단백질 패밀리의 거의 모든 구성원의 농도가 오래된 해마와 피질에서 감소한 것으로 나타났습니다(그림 1A,B). 대조적으로, Grik2 isoform을 제외한 Grik 단백질의 역가는 노화의 영향을 받지 않았습니다. 소뇌(그림 1C).
4.5.Grm
우리는 연구된 모든 뇌 형성에서 글루타메이트 의존성 대사성 수용체 Grm의 7개 구성원을 확인했습니다: Grml-7(그림 1A-C). 해마와 피질에서 Grm 단백질의 총 농도는 나이든 동물에서 감소했습니다( 그림 1A,B), 소뇌 Grms의 총 역가는 노화에 의해 크게 변하지 않았습니다(그림 1C).
상세한 분석에 따르면 해마에서 가장 풍부한 Grm 동형체(Grm2, Grm3 및 Grm5)의 수준이 늙은 생쥐에서 유의하게 감소한 반면(그림 1A), 피질에서는 가장 풍부한 동형체의 역가 변화가 나타났습니다. 크게 변경되지 않았습니다(그림 1B).
5.GABA성 전달
y-아미노부티르산은 뇌에서 가장 풍부한 억제성 신경전달물질이며 두 가지 유형의 수용체, 즉 염화물 채널인 이온성 GABAA 수용체와 대사성 GABAg 수용체와 상호작용할 수 있습니다. GABA 수용체는 다양한 소단위체∶ a(Gabra), (Gabrb), y(Gabrg) 및 δ(Gabrd)로 구성된 오량체성 단백질입니다.[27]GABAg는 Gabbrl 및 Gabbr2 소단위체에 의해 형성된 이종이량체 G 단백질 결합 수용체[28] . 6.GABAA-가브르
우리의 분석은 GABA 단백질의 총 농도가 늙은 쥐의 해마와 피질에서 크게 감소했지만 소뇌의 노화에 영향을 받지 않는다는 것을 보여주었습니다(그림 2A). 이러한 변화는 GABAA 수용체의 개별 소단위의 발현 변화에 의해 반영되었습니다(그림 2B-D). 6.1.Gabra(서브유닛 a)
우리는 Gabra 소단위의 전체 농도가 연구된 모든 뇌 형성에서 노화의 영향을 받지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 2B-D). 가장 풍부한 isoform은 Gabral이었습니다. a 소단위 내에서 Gabra3 및 Gabra5 발현만 노화의 영향을 받았습니다(그림 2B-D). 통계적으로 유의한 유일한 변화는 노화된 동물의 피질에서 역가가 감소한 Gabra4와 관련이 있었습니다(그림 2C). 6.2.Gabrb(서브유닛)
우리의 분석은 하위 단위가 젊고 오래된 동물(그림 2B-D) 모두에서 연구된 모든 뇌 구조에서 가장 보편적인 GABAA 하위 단위였으며, 하위 단위의 주요 동형은 Gabrb2(그림 2B-D)였습니다. Gabr2b는 소뇌에서 가장 높았고 해마와 피질에서는 역가가 비슷했습니다(그림 2B-D). 우리는 해마와 소뇌에 있는 소단위체의 동형 발현에서 노화와 관련된 중요한 변화를 관찰하지 못했습니다. 그러나 피질에서는 Gabrb의 총 역가가 크게 감소했으며 이는 Gabrb2 역가의 감소와 관련이 있습니다(그림 2C).
6.3.Gabrg(서브유닛)
GABAA 수용체의 y 소단위 중 Gabrg2는 피질과 소뇌에서 가장 높은 수준으로 발현되었으며(그림 2C,D), 해마에서 탐지할 수 있는 유일한 y 소단위였습니다(그림 2B).해마와 피질에서 총 Gabrg 이소폼 농도는 나이 든 동물보다 어린 동물에서 거의 2배 더 높았습니다(그림 2A,B). 한편, 총 y 소단위 농도는 소뇌의 노화에 영향을 받지 않았다(그림 2D). 6.4.Gabrd(subunitδ)
늙은 쥐에서 $ subunit은 주로 소뇌에서 발현되었다(그림 2B-D). 나이든 생쥐의 소뇌에서 Gabrd의 역가는 피질보다 약 10배, 해마보다 25배 이상 높았다(그림 2B-D). 노화는 해마와 소뇌에서 Gabrd 발현에 영향을 미치지 않았지만, 피질에서는 노화에 의해 수용체의 역가가 3배 이상 감소했습니다(그림 2C). 7.GABAb-가브르
Gabbr은 Gabbrl 및 Gabbr1 소단위체에 의해 형성된 이종이량체 대사성 수용체이며, 그 기능은 G 단백질의 활성화 및 아데닐산 사이클라제와 같은 다운스트림 이펙터의 활성 조절과 결합됩니다[29]. 우리는 대사성 수용체의 두 소단위의 발현이 나이든 동물의 해마에서 감소되었음을 발견했습니다(그림 2B).소뇌에서 Gabbr 양은 노화에 영향을 받지 않았습니다. 우리는 또한 피질에서 Gabbr 소단위 농도의 합에서 상당한 감소를 관찰할 수 있었지만, 별도로 소단위 역가의 변화는 통계적으로 유의하지 않았습니다(그림 2C). 8.갓
Gad는 GABA를 생성하기 위해 글루타메이트를 탈탄산시키는 효소입니다[30]. 우리의 데이터는 해마에서 Gad의 주요 동형인 Gad2의 발현이 노화의 영향을 받지 않는다는 것을 보여줍니다. 그러나 다른 Gad isoform인 Gad1의 수준은 상당히 높아졌습니다(그림 2B). 우리는 또한 나이든 동물의 소뇌에서 두 Gad isoforms의 역가가 크게 증가하는 것을 관찰할 수 있었지만(그림 2D), 늙은 쥐의 피질에서 Gad 발현에는 변화가 없었습니다(그림 2C).
9. 칼슘/칼모듈린 의존성 키나제
칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나아제(Camk)의 활성화는 칼슘 신호가 다양한 형태의 시냅스 가소성으로 전환되는 첫 번째 단계입니다(검토를 위해 [31,32] 참조). 9.1.캠1
우리가 분석에서 찾은 Camkl의 유일한 isoform은 Camkld였습니다. 우리는 또한 일부 Camkl 관련 펩타이드를 관찰했지만 선택된 Camkl 이소형에 정확하게 주석을 달 수 없었습니다(그들은 "Camkl", 그림 3A-C로 설명됨). 해마와 피질에서 Camk 그룹의 농도 변화(그림 3A,B). 한편, Camkl의 역가는 늙은 마우스의 소뇌에서 크게 증가했습니다(그림 3C).
9.2.캠2
Camk2는 모든 뇌 구조에서 가장 보편적인 단백질에 속합니다[8,3]. 우리는 Camk2 isoforms 중에서 Camk2a의 역가가 연구된 모든 뇌 구조에서 가장 높고(그림 3A-D) 해마와 피질에서의 농도가 두 번째로 풍부한 Camk2b의 역가보다 몇 배 더 높다는 것을 발견했습니다. Camk2의 isoform(그림 3A,B). 노화는 늙은 쥐의 해마에서 수준이 감소한 Camk2d를 제외하고 Camk2 이소폼의 농도에 영향을 미치지 않았습니다(그림 3A).
9.3.캠4
시냅스 가소성에서 Camk4의 분자적 역할은 Camk2와 다릅니다. 활성 Camk4는 세포핵에 위치하며 기억 형성의 후기 단계에 관여하는 유전자의 전사를 조절합니다[32].
우리의 연구는 Camk4의 농도가 늙은 동물의 분석된 모든 뇌 형성에서 거의 2배 크게 감소했음을 보여줍니다(그림 3A-D). 단백질 역가는 해마에서 가장 낮고 소뇌에서 가장 높았습니다(그림 3A-D).
9.4.캠크
칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 키나제(Camkk)는 Camk 단백질의 활성을 인산화하고 조절합니다. 우리의 분석은 Camkk의 총 농도가 해마와 피질의 노화에 의해 통계적으로 유의하게 영향을 받지 않는 것으로 나타났습니다(그림 3A,B,D). 소뇌에서 Camkkl isoform의 수준은 3-배 이상 증가했습니다 늙은 동물에서는 Camkk2 농도가 나이든 동물에서 2배 이상 낮았습니다(그림 3C).
10.Prka-cAMP 의존성 단백질 키나제(PKA)
Prka는 AMPA 및 NMDA 수용체의 다양한 소단위를 인산화하고 기능을 조절할 수 있는 넓은 분포와 상대적으로 낮은 특이성을 가진 보존된 세린 단백질 키나제입니다[34]. 10.1.PKA 촉매 소단위 - Prkac
우리의 분석은 해마에서 PKA의 가장 풍부한 촉매 소단위가 Prkaca와 Prkacb임을 입증했습니다(그림 4). 개별 소단위의 농도는 노화의 영향을 받지 않았습니다. 그러나 totalPrkac 단백질 농도는 나이 든 마우스에서 약간 그러나 통계적으로 유의하게 감소했습니다(그림 4A,D). 해마와 유사하게 피질과 소뇌에서 PKA의 가장 보편적인 촉매 소단위는 Prkaca와 Prkacb였습니다. 그러나 단백질의 농도는 젊고 오래된 동물 사이에 차이가 없었습니다(그림 4B,C). 10.2.PKA 조절 소단위--Prkar
우리는 Pekar isoforms의 전반적인 발현이 피질에서 가장 높았던 반면, 해마와 소뇌에서는 Prkar의 수준이 비슷하다는 것을 발견했습니다(그림 4A-D). 노화는 Prkar의 총 농도에 영향을 미치지 않았으며, 연령과 관련된 유일한 차이점은 늙은 쥐의 해마에서 감소된 수준의 Prkar2b였습니다(그림 4A).
11. 미토겐 활성화 단백질 키나제 - Mapk
마크 단백질은 신경 가소성과 관련된 광범위한 세포질 및 핵 과정을 조절합니다[35].
여기에 제시된 결과는 Mapk가 해마에서 가장 풍부한 Mapk임을 보여줍니다(그림 4A). 해마의 총 Mapk 농도는 노화의 영향을 받지 않았습니다(그림 4A,D). 그러나 Mapk3 발현은 노인에서 약 23% 더 높았습니다. 동물(그림 4A), Mapk15는 노화된 해마에서 거의 7배 증가했습니다(그림 4A).
피질과 소뇌 모두에서 총 Mapk 농도는 노화의 영향을 받지 않았으며 Mapk1은 두 개의 뇌 구조에서 발현된 주요 키나제였습니다(그림 4B,C).
이 기사는 Cells 2021, 10, 2021에서 발췌했습니다. https://doi.org/10.3390/cells10082021 https://www.mdpi.com/journal/cells
