케르세틴은 쥐의 산화철 나노입자에 의해 유도된 뇌 산화적 변화를 약화시킵니다
Mar 11, 2022
연락하다:tina.xiang@wecistanche.com자세한 내용은
추상적인: IONP(산화철 나노입자) 요법은 다양한 건강상의 이점이 있지만 고용량 또는 장기간의 요법은 특히 뇌에서 산화성 세포 손상을 유발할 수 있습니다. 따라서 우리는 현재 연구를 수행하여 보호 역할을 조사했습니다.케르세틴IONP로 인해 쥐의 뇌에서 유도된 산화적 변화에 대한 보충. 40마리의 성인 수컷 흰둥이 쥐를 동일한 5개 그룹으로 할당했습니다. 대조군은 정상적인 기초 식이를 받았고, IONP 그룹은 50mg/kg 체중(BW)의 IONP를 복강 내 주사했으며 케르세틴 처리 그룹은 IONP + Q25, IONP + Q50, IONP + Q100을 케르세틴으로 경구 대체했습니다. 30일 동안 동일한 용량의 IONP와 함께 매일 25, 50 및 100mg 케르세틴/kg BW를 투여합니다. IONP는 말론디알데히드(MDA)의 상당한 증가를 유도하고 환원된 글루타티온(GSH)과 산화된 글루타티온(GSSG)을 유의하게 감소시켰습니다. 결과적으로, IONP는 뇌 크레아틴 포스포키나제(CPK) 및 아세틸콜린에스테라제(AChE)의 상당한 증가와 함께 산화적 변화를 초래하는 철 침착으로 인해 심각한 뇌 조직 손상을 유의하게 유도했습니다. 또한 IONP는 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체-감마 보조 활성인자 1-알파(PGC{12}}a) 및 미토콘드리아 전사 인자 A(mtTFA)mRNA의 하향 조절로 뇌 에피네프린, 세로토닌 및 멜라토닌의 상당한 감소를 유도했습니다. 표현. IONP는 카스파제 3의 증가와 B 세포 림프종 2(Bcl2) 발현 수준의 감소에 의해 모니터링되는 뇌에서 세포자멸사를 유도했습니다. 케르세틴 보충은 특히 뇌를 패배산화 손상용량 의존적 방식으로. 따라서 IONP 동안 케르세틴 보충은 건강 위험이 적은 IONP의 이점을 얻기 위해 적극 권장됩니다.
키워드: 산화철 나노입자; 산화 스트레스; 케르세틴; 항산화
1. 소개
산화철 나노입자(IONP)는 약물 표적화, 유전자 전달, 세포 표지, 자기 공명 영상의 조영제 및 온열 요법에 사용됩니다[1]. 또한 폐수 처리, 가스 감지 및 반도체 흡착제 윤활, 안료 및 코팅 [3]의 수많은 산업 용도 외에도 철분 강화 음료 및 인간 소비를 위한 곡물의 식품 첨가물로 사용됩니다[3]. 그러나 IONP의 다양한 사용은 철분 과부하를 유발하고 이에 따라 다양한 기관에서 산화 스트레스가 시작됩니다[4]. 섭취, 흡입 및 피부 침투는 IONP가 유입되는 주요 경로입니다[5]. 혈류에서 IONP는 혈장 단백질에 결합되어 다른 신체에 분포됩니다.
간, 비장, 신장, 폐, 심장 등의 장기에 영향을 미치고 혈액뇌장벽(BBB)을 관통하여 산화적 손상을 유발한다[6,7]. 활성산소(ROS) 생성을 유발하는 IONP에서 방출된 철은 지질, 단백질 및 DNA에 심각한 산화적 변화를 일으킵니다[8,9].
케르세틴(3,3',4',5,7-펜타하이드록시플라본)은플라보노이드많은 씨앗, 메밀, 견과류, 꽃, 나무 껍질, 녹차 및 올리브 오일 외에 과일(사과, 딸기, 체리, 적포도) 및 야채(양파 및 브로콜리)에 존재합니다[10]. 케르세틴은 항염증, 항산화, 항돌연변이, 항허혈, 항바이러스 및 항노화 효과를 포함하는 풍부하고 귀중한 효과를 가지고 있습니다[11-17]. 케르세틴은 친유성이고 혈액뇌장벽(BBB)을 통과할 수 있습니다[18]. 또한, 케르세틴은 환원 글루타티온(GSH)의 향상과 구리-아연 과산화물 디스뮤타제(SOD1)의 상향 조절에 의해 잠재적인 항산화 역할을 나타냅니다[17]. 케르세틴은 철을 킬레이트화하여 Fenton의 반응을 억제하고 ROS 생성을 억제할 수 있습니다[19]. 결과적으로 케르세틴은 여러 신경 퇴행성 질환 및 신경 손상에 대한 잠재적 치료제입니다[20]. 그만큼항산화케르세틴의 잠재력은 뇌 조직에서 IONP에 의해 유도된 산화적 변화에 대한 케르세틴의 보호 가능성을 조사하기 위해 본 연구를 수행하도록 장려했습니다.
2. 결과
2.1.IONP의 크기와 전하
그림 1과 같이 IONP의 SEM 이미지는 평균 크기가 16.{2}}.88 nm인 구형 모양을 나타내면서 양의 제타 전위 값에 22.8 mV를 더한 값을 보유했습니다(그림 2).
2.2. 뇌 산화 스트레스 및 항산화 상태
지질 과산화 생성물 malondialdehyde(MDA)의 수준은 IONP 그룹에서 유의하게 증가했습니다(p<0.05) while="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps="" +="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" (figure="" 3a).mda="" levels="" in="" ionps+="" q25=""><0.01), ionps+=""><0.01) and=""><0.01) were="" significantly="" decreased="" compared="" with="">
뇌 균질액의 GSH 수준은 IONP에서 유의하게 감소했습니다(p<0.001), ionps+=""><0.001),ionps+o50><0.001) and="" ionps+="" o100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.in="" ionps+q100,="" the="" gshlevels="" were="" significantly="" increased="" than=""><0.001) and="" ionps+="" q25(p=""><0.01), as="" represented="" in="" figure="">
산화 글루타티온(GSSG) 수치는 IONP에서 유의하게 증가했습니다(p<0.001), ionps+q25=""><0.001),><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="">
GSH와 GSSG의 데이터에 따르면, GSH/GSSG 비율 값은 IONP에서 유의하게 감소했습니다(p<0.001), ionps+="" q25,ionps+="" q50="" and="" ionps+="" o100="" compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 3d).="" in="" ionps+="" q100,="" gsh/gssg="" ratio="" values="" were="" significantly="" increased="" in="" comparison="" with=""><0.01)and ionps+q25=""><>
2.3.Brain Creatine Phosphokinase(CPK) 및 Acetylcholinesterase(AChE) 활성
CPK 활동은 IONP에서 유의하게 증가했습니다(p<0.001), ionps="" +="" q25=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" in="" comparison="" with="" the="" ionp="" groups,="" cpk="" activities="" were="" significantly="" decreased="" in=""><0.01),><0.01) and="" ionps+q100=""><0.001)(figure>
그림 4B에서 AChE 활동은 IONP에서 유의하게 증가했습니다(p<0.001), ionps=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps+q25=""><0.01), ionps+q50=""><0.001)and ionps+q100(p=""><0.001) than="" ionps.in="" addition,="" ache="" activities="" were="" significantly="" decreased=""><0.001) in="" ionps+="" q100="" compared="" with="" ionps+="">
2.4.뇌 에피네프린, 세로토닌, 멜라토닌 호르몬
뇌 균질액의 에피네프린 수치는 IONP에서 유의하게 감소했습니다(p<0.001), ionps+="" q25=""><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group(figure="" 4c).in="" the="" ionps+="" q25=""><0.05),ionps+><0.001)and ionps+q100=""><0.001)groups, the="" epinephrine="" levels="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" ionps.="" furthermore,="" the="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps="" +="">
그림 4D에서 볼 수 있듯이 세로토닌 수치는 IONP에서 유의하게 감소했습니다(p<><0.001),><0.01) and=""><0.05)compared with="" the="" control="" group.="" in="" ionps+="" q100,="" the="" levels="" significantly="" increased=""><0.05) than="" ionps="" +="">
뇌 균질액의 멜라토닌 수치는 IONP에서 유의하게 감소했습니다(p<0.001), ionps+=""><0.001) and="" ionps+="" q50=""><0.01) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 4e).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" levels="" in="" the=""><0.01) and="" ionps="" +=""><0.001)groups were="" significantly="" increased.="" it="" significantly="" increased=""><0.001)in ionps="" +="" q100="" compared="" with="" ionps="" +="">
2.5. 뇌 PGC-1a 및 mtTFA mRNA 발현
Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha(PGC{2}}a) mRNA 발현 배수 변화는 IONPs(p<0.001) and="" ionps+q25=""><0.05) and="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q100=""><0.001)compared with="" the="" control="" group="" (figure="" 5a).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" pgc-1a="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q50=""><0.05) and="" ionps+q100=""><0.001).in addition,="" pgc-1a="" expression="" levels="" in="" ionps+="" o100="" were="" significantly="" increased="" (p=""><0.001)compared with="" the="" ionps="" +="" q25="" and="" ionps="" +="" q50="">
IONP(p<0.001), ionps+="" q25="" (p=""><0.001)and ionps+=""><0.05), the="" mrna="" expression="" levels="" of="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a="" (mttfa)="" were="" significantly="" decreased="" than="" in="" the="" control="" group="" while="" they="" significantly="" increased="" in="" ionps+q50=""><0.01) and="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps+="" q25.mttfa="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased=""><0.05) in="" ionps+o100="" in="" comparison="" with="" ionps+q50="" (figure="">
2.6.Hematoxylin(H) 및 Eosin(E) 뇌 섹션의 염색 평가
뇌 조직의 조직학적 평가는 대조군이 소뇌층의 정상적인 조직학적 구조를 보여주었다는 것을 보여주었습니다(그림 6A). IONPs로 인한 층은 용량 의존적 방식으로 IONPs + Q25(그림 6C), IONPs + Q50(그림 6D), IONPs + Q100(그림 6E) 그룹에서 완화되었습니다.
대조군의 쥐는 뇌막과 대뇌 피질의 정상적인 조직학적 구조를 보였고(도식 1A), IONP를 처리한 쥐의 수막은 뇌막하 혈관의 울혈을 보였다(도식 1B). IONP군에서 뇌의 대뇌 랫트는 맥락총의 울혈(도식 1F) 외에 위성증, 신경포식증(도식 1C), 신경교증(도식 1D) 및 해면체증(도식 1E)을 보였다.
Scheme iF에서 볼 수 있는 바와 같이, IONP + Q25 그룹의 쥐의 뇌는 스폰지증(짧은 화살표)과 뇌막하 혈관의 울혈을 보여주었습니다. 더욱이, IONPs + Q50 그룹에 있는 쥐의 대뇌는 경미한 스폰지증과 혈관 울혈을 나타냈다(도식 1H). IONP와 Q100 그룹의 쥐의 뇌는 뇌척수막과 대뇌피질의 조직학적 구조가 비교적 정상적이었습니다(Scheme 1I).
2.7. 뇌 섹션의 프러시안 블루 염색 평가
대조군의 뇌 절편은 음성 프러시안 블루 염색을 보였다(그림 7A). IONP 그룹에서 프러시안 블루 염색 반점이 뇌 섹션에서 인식되었습니다(그림 7B). 반대로, IONPs 그룹 섹션의 Prussian blue 염색 반점의 강도는 IONPs + Q25(그림 7C), IONPs + Q50(그림 7D) 및 IONPs + Q100(그림 7E) 그룹에서 케르세틴에 의해 감쇠되었습니다. 용량 의존적 방식.
2.8. 뇌 섹션의 카스파제 3 및 Bcl2 단백질 수준
대조군은 카스파제 3 단백질 수준의 음성 발현(도 8A)을 보인 반면, IONP에서는 고도로 발현되었다(도 8B).케르세틴 처리그룹(그림 8C-E)은 IONP와 비교하여 카스파제 3의 낮은 발현을 보여주었습니다. 반대로, Bcl2는 IONP(그림 9B) 및 대조군(그림 9A)과 비교하여 IONP + Q25(그림 9C), IONP + Q50(그림 9D) 및 IONP + Q100(그림 9E)에서 유의하게 발현되었습니다.
3. 토론
IONP에 노출되면 철과 그 침착이 연조직, 특히 뇌에 침착됩니다[21]. 현재 연구에서 우리는 H 및 E 염색 평가에 의해 모니터링되는 프러시안 블루 염색 및 형태 변경에 의해 입증된 뇌의 철 침착을 인식했습니다. Dhakshinamorthy et al. [22]는 대조군에 비해 IONP 처리군의 뇌 조직에서 철 함량이 유의하게 증가함을 보여주었다. 이것은 뇌 영역의 프러시안 블루 염색으로 평가되었으며 전두엽 피질, 해마 및 소뇌의 파란색 반점으로 입증되었습니다. El-Sayed et al. [23] 또한 쥐에서 IONP 투여로 인해 뇌 조직에서 철 수치가 크게 증가한다고 언급했습니다.
IONP는 다른 장기 세포보다 BBB를 관통하고 뇌 세포 손상을 유도하는 능력이 더 높을 수 있습니다[24,25]. 또 다른 설명은 철분 수치가 증가했다는 것입니다.
뇌에서 철과 트랜스페린의 결합으로 인해 뇌에서 철 수용체의 상향 조절이 촉발되고 결과적으로 BBB를 통해 철을 수송합니다[26].
Fenton 반응 과정에서 자유 Fe이온은 H2O2와 반응하여 ROS를 생성합니다[27]. 상승된 ROS는 미토콘드리아 외막의 투과성을 증가시키고, 지질 과산화, 단백질 손상 및 DNA 사슬 끊어짐을 증가시켰다[28]. 그만큼산화 스트레스ROS의 증가는 IONP 처리 쥐에 대한 현재 연구에서 언급된 바와 같이 지질 과산화 산물인 MDA의 뇌 수준을 증가시켰습니다. 유사하게, Dhakshinamorthy 등[22]은 IONP 처리된 마우스의 뇌 조직에서 MDA 수준의 상당한 증가를 보고했습니다. 레디 외.[26] 또한 MDA 수준은 고용량에서 뇌 조직에서 유의하게 증가했지만 IONP로 처리된 쥐에서 저용량에서는 유의하지 않은 증가가 있다고 밝혔습니다. Gaharwar와 Paulraj[5]는 MDA 수치가 IONP로 처리된 쥐에서 유의하게 상승했음을 밝혔습니다. 유사하게, IONP는 높은 MDA 생산과 감소된 GSH 농도에 의해 모니터링되는 심근세포의 산화적 손상을 유도했습니다[29].
여러 연구의 저자는 Echinacea purpurea [30] 및 Antlriscus sulvetris [31] 추출물을 포함한 IONP와 관련된 부작용에 대한 천연 제품 또는 추출물의 보호 효과를 조사했습니다. 현재 연구에서 우리는 쥐의 뇌에서 IONP의 독성에 대한 케르세틴의 보호 역할을 조사했습니다. IONP 처리된 쥐에 대한 퀘르세틴 보충은 뇌 조직의 MDA 수준을 감소시켰고 우리의 결과는 Dong et al. 그는 케르세틴이 쥐의 뇌 조직에서 MDA 수준을 낮추어 지질 과산화를 감소시켰다고 말했습니다. 이는 케르세틴이 ROS를 감소시켜 지질 과산화를 억제하고 MDA의 형성을 방지하는 능력으로 설명될 수 있습니다[33]. 이것은 최적의 자유 라디칼 소거를 갖는 catechol 그룹(B ring)과 A 및 C ring의 3번 위치에 있는 OH 그룹에 기인합니다[17].
GSH는 ROS 및 기타 반응성 종과 직접 반응하는 세포 항산화 방어의 필수 부분입니다[34]. 본 연구에서 뇌의 GSH 수치는 IONP를 처리한 쥐에서 유의하게 감소했지만 GSSG 수치는 유의하게 증가했습니다. Reddy et al.[26]은 IONP로 처리된 쥐의 뇌 조직에서 GSH 수준의 고갈을 언급했으며 해독 메커니즘의 일부로 접합 반응에서 GSH의 활용이 증가하여 GSH가 감소하고 GSSG가 산화되기 때문일 수 있다고 제안했습니다. 증가했다. IONP 처리된 쥐와 케르세틴을 함께 투여하면 뇌 조직에서 GSH를 증가시키고 GSSG 수준을 감소시켜 이를 회복했습니다. 이러한 결과는 Singh et al. [35] 케르세틴의 항산화 잠재력을 나타내는 뇌 조직의 GSH 수치 상승을 보고했습니다. Donget al. [32] 또한 케르세틴이 핵인자 적혈구계 2-관련 인자 2(Nrf2) 유전자 발현을 변화시키는 것으로 밝혀졌습니다. 결과적으로 Nrf2는 뇌 조직에서 항산화 효소 생산을 자극했습니다.
본 연구에서 CPK는 IONP 처리된 쥐의 뇌 조직에서 유의하게 증가했습니다. 세포 에너지 완충 및 에너지 전달에서 CPK/포스포크레아틴은 특히 뉴런과 같이 에너지 요구량이 높고 변동이 심한 세포에서 중요한 역할을 합니다[36]. 따라서 CPK/phosphocreatine 시스템의 활성화와 CPK 발현 변화는 산화 스트레스로 인한 에너지 생산 감소에 대한 보상으로서 세포의 산화 및 생체 에너지 스트레스의 초기 지표가 될 수 있습니다. IONP 처리된 쥐와 케르세틴의 공동 투여는 뇌 조직의 CPK를 감소시켰습니다. Lemmens et al. 케르세틴 보충으로 인한 CPK 활성 감소를 입증했습니다.
신경 조직의 AChE 활성은 시냅스 및 신경근 접합부에서 아세틸콜린(Ach)을 콜린으로 가수분해하는 역할을 합니다[39]. 본 연구에서 AChE는 IONP 처리된 쥐에서 유의하게 증가했으며 이 결과는 Dhakshinamorthy et al. IONP에 의한 철 축적이 콜린성 시스템을 변화시킨 IONP 처리된 쥐의 뇌 조직에서 AChE 활성의 유의한 증가를 확인했습니다.
신경 전달 물질은 뉴런이 몸 전체에 통신할 수 있도록 하는 내인성 화학 물질입니다. 그것들은 뇌가 화학적 시냅스 전달에서 다른 기능을 수행할 수 있도록 합니다[40]. 현재 연구에서 뇌 조직의 에피네프린, 세로토닌 및 멜라토닌 농도는 IONP 처리된 쥐에서 유의하게 감소했습니다.
Yousefet al. [41]은 세로토닌과 도파민 수치가 IONP 처리된 쥐의 뇌 조직에서 유의하게 감소했다고 보고했습니다. 대조적으로, 케르세틴은 IONP에 비해 뇌 조직에서 에피네프린, 세로토닌 및 멜라토닌 농도를 증가시켰습니다. Singh et al. [35l] 케르세틴은 세로토닌, 노르에피네프린, 도파민을 증가시켰다고 밝혔습니다.
미토콘드리아 생합성은 신경 세포의 세포 생리학적 요구를 충족시키기 위해 미토콘드리아 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다[42]. PGC{1}}a는 미토콘드리아 생합성을 유도하고 mtTFA의 발현을 촉진하는 동시 전사 조절 인자입니다[43]. 본 연구에서 PGC{4}}a와 mtTFA의 발현 수준은 IONP 처리 쥐의 뇌 조직에서 유의하게 감소했습니다. 우리의 결과는 Yousef et al. [44]. 그들은 PGC-1a 및 mtTFA로 대표되는 미토콘드리아 생합성이 IONP에 노출된 쥐의 뇌 조직에서 발현을 유의하게 감소시켰으며 이는 미토콘드리아 기능 장애로 이어질 수 있는 미토콘드리아 생합성 및 mtDNA 복제 및 전사의 감소를 나타냅니다. IONP 처리 쥐와 케르세틴을 함께 투여하면 뇌 조직에서 PGC{11}a 및 mtTFA 발현이 모두 증가하여 이러한 감소가 회복되었으며 우리의 결과는 Sharma et al.[45]과 일치했습니다. 누가 케르세틴이 PGC{13}}a, NRF{14}}, NRF{15}} 및 mtTFA의 발현을 증가시킨다고 보고했습니다. 그들은 케르세틴으로 유도된 PGC에 의한 ROS 감소로 인해{17 }}상승으로 인해 NRF{18}}가 활성화되고 NRF{19}}는 mtTFA 발현을 자극했습니다.
케르세틴은 caspase 3의 현저한 감소와 뇌 면역조직화학 섹션의 Bcl2 발현 수준의 증가를 통해 IONP의 세포자멸사 효과를 약화시켰습니다. 이 발견은항산화케르세틴의 가능성. 유사하게, 케르세틴 처리는 쥐의 허혈성 뇌 손상에서 카스파제 3의 증가를 약화시키고[46,47], 지질다당류 처리된 쥐의 경우 Bcl2의 증가를 약화시켰습니다[48].
4. 재료 및 방법
4.1.시약 및 화학물질
산화철 나노입자 분말은 Sigma-Aldrich(Louis, MO, USA)로부터 입수하였으며, 이를 탈이온수에 용해시킨 후 사용하였다. 케르세틴은 분말 형태로 Sigma-Aldrich에서 구입하여 DMSO(디메틸설폭사이드)와 증류수에 각각 1:20의 비율로 용해한 후 사용합니다. DMSO 99.6% 이상은 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 다른 화학 물질과 탈이온수는 알렉산드리아 대학의 대학원 연구 및 연구 센터에서 구입했습니다.
4.2. 윤리 선언문
이 연구는 이집트 알렉산드리아 대학교 수의학 윤리위원회 학부의 "실험실 동물 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드"의 지침에 따라 승인되었습니다.
4.3. INP의 특성화
주사전자현미경(SEM)을 이용하여 IONP의 형태와 입자크기를 조사하였다. 입자의 전하는 또한 ZetaSizer Nano ZS(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 제타 전위에 의해 결정되었습니다.
4.4.동물, 주택 및 실험 설계
체중 150±20 체중(BW)의 건강한 성인 수컷 알비노 쥐 40마리를 이집트 알렉산드리아 대학 의학 연구소 동물 사육부에서 구입했습니다. 동물은 최적의 온도(23±2), 습도(55±5), 명암 주기(12시간) 및 기본 사료에 대한 자유로운 접근이 있는 통제된 환경 조건에서 금속 케이지에 보관되었습니다(표 1). 그리고 식수. 모든 동물은 적응을 위해 실험 전 2주 동안 수용되었습니다. 쥐를 무작위로 5개 그룹(각각 8마리)에 할당했습니다. 대조군은 정상적인 기초 식이와 물을 임의로 제공받았고, IONP군은 IONP 50mg/kg BW를 주 3회 복강내 주사하였고[49], IONP군과 Q25mg군은 동일한 용량으로 투여하였다.
IONPs 및 25mg quercetin/kg BW로 위관영양을 받은 IONPs + Q50 그룹은 동일한 용량의 IONP와 매일 50mg quercetin/kg BW로 위관영양되었으며 IONPs + Q100group은 동일한 용량의 IONP와 gavaged 매일 100mg 케르세틴/kg BW로 [17]. 모든 처리는 30일 동안 유지되었습니다.
4.5. 견본 추출
실험이 끝나면 쥐를 12시간 동안 금식시키고 케타민/자일라진(100 mg/kg/10 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취한 다음 안락사시키고 뇌를 즉시 해부했습니다. 식힌 생리 식염수 0.9%로 헹구고 세 부분으로 나눕니다. 첫 번째 것은 생화학적 분석에 사용되었습니다. 두 번째 부분은 mRNA 추출 및 RT-PCR 평가를 위해 -80도로 유지되었고 마지막 부분은 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 세척하고 PBS에 용해된 4% 파라포름알데히드에 48시간 동안 고정했습니다. 샘플 고정.
4.6. 생화학적 분석
각 쥐 뇌의 일부를 차가운 인산완충식염수(PBS)에서 균질화하고 1435xg에서 4도에서 10분 동안 원심분리했습니다. Malondialdehyde(MDA), GSH, Oxided glutathione(GSSG), creatine phosphokinase(CPK)는 Biodiagnostic Co.(Giza, Egypt)의 상용 키트를 사용하여 측정했습니다. 뇌 균질액에서 아세틸콜린에스테라제(AChE) 효소 활성은 비색 분석 키트(BioVision Co., Milpitas, CA, USA)에 의해 결정되었습니다. 뇌 균질액의 에피네프린, 세로토닌 및 멜라토닌 수준도 ELISA 키트(BioVision Co., Milpitas, CA, USA)를 사용하여 측정했습니다.
4.7.mRNA 추출 및 RT-PCR
제조사의 easy-RED Total RNA Extraction Kits(iNtRON Biotechnology, Inc., 경기도, 대한민국)를 사용하여 샘플에서 Total RNA를 추출했습니다. 첫 번째 가닥 cDNA는 HiSen Script cDNA(iNtRON Biotechnology, Inc.) 패키지를 사용하여 얻어졌습니다. 특정 프라이머를 사용하여 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)를 안정적인 하우스키핑 유전자로 사용하여 선택된 유전자를 증폭했습니다(표 2). mRNA 발현은 실시간 Strata 유전자 MX3005P PCR(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 및 TOP real TM PreMIX SYBR Green qPCR 마스터 블렌드(cat. RT 500, Enzynomics, Daejeon, South Korea)를 제조업체의 지침에 따라 처리했습니다. 상대 유전자 발현 농도는 Pfaffl[50]에 의해 설명된 2-AAct 방법을 사용하여 평가되었습니다.
4.8. 조직병리학적 검사
전통적인 파라핀 혼입 기술을 사용하여 고정된 표본을 에탄올의 상승도에 의해 탈수하고 3개의 자일렌 이동으로 제거하고 65℃에서 파라핀 포매로 마무리했습니다. 4 um 두께의 섹션을 헤마톡실린 및 에오신(H 및 E)으로 염색했습니다. [51].
뇌 절편은 일련의 알코올 농도 감소를 통해 수화되었고 30분 동안 20% HCl 용액과 함께 20% 페로시안화칼륨 용액에 두었다. 슬라이드를 세척하고, 탈수하고, 자일렌으로 청소하고, 현미경으로 철 함량 또는 청색 염색을 관찰했습니다[52].
4.9.면역조직화학 검사
표준 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 면역조직화학 기술을 파라핀 조직 절편의 양전하 슬라이드에 적용했습니다. 제조사 지침에 따라 토끼 항쥐 카스파제 3(Lab Vision, Fremont, CA, USA) 및 Bcl2(DAKO, Glostrup, Denmark)를 사용하였다. 대뇌, 소뇌, 척수 및 좌골 신경의 5um 두께 섹션을 탈랍하고 재수화하고 3% 과산화수소(H2O2)로 전처리하여 내인성 과산화효소 활성을 차단했습니다. 항원 검색은 슬라이드를 10mM 시트르산나트륨 완충액(pH6.0)에서 1분 동안 마이크로웨이브에 넣어 수행했습니다. 슬라이드를 1차 항체와 함께 배양한 다음 Tris-완충 식염수와 2차 항체로 헹구었습니다. 슬라이드를 3,3/-디아미노벤지딘(DAB) 기질 발색원 용액과 함께 배양한 다음 Mayer's hematoxylin으로 대조염색했습니다. 10개의 서로 다른 필드의 이미지를 400배의 배율로 이미지화했습니다.
4.10. 통계 분석
Tukey의 사후 다중 범위 테스트가 포함된 일원 ANOVA는 2021년 3월 10일에 액세스한 GraphPad Prism v.5https://www.graphpad.com/(GraphPad, San Diego, CA, USA)를 사용한 데이터 분석에 사용되었습니다. . 모든 의미 선언은 p에 의존<0.05. 5.="">
50 mg/kg BW의 용량으로 복강 내 주입된 산화철 나노입자(IONP)는 뇌에서 산화적 변화를 유도하는 반면, 25, 50 및 100 mg/kg의 용량으로 퀘르세틴은 IONP에 의해 유도된 뇌 산화 손상을 완화했습니다. 따라서 케르세틴은 IONP 요법과 함께 유망한 사료 보충제입니다.
참고문헌
1. Mazdeh, M.; 라히미네자드, ME; Nili-Ahmadabadi, A.; Ranjbar, A. 신경 장애 및 산화 독성 스트레스: 금속 나노 입자의 역할. 준디샤푸르 J. Nat. 제약 찌르다. 2016, 11, e27628. [교차 참조]
2. 피들러, MC; Walczyk, T.; 데이비슨, 엘.; Zeder, C.; 사카구치, N.; 준자, LR; Hurrell, RF 사람의 생체 이용률이 높은 미분화된 분산성 피로인산 제2철. 브르. J. Nutr. 2004, 91, 107–112. [교차 참조]
3. 라미모가담, D.; Bagheri, S.; Hamid, SBA 자성 산화철 나노입자의 전기화학적 합성 진행. J. Magn. 매그. 메이터. 2014, 368, 207–229. [교차 참조]
4. 미국 가하와르 Kumar, S.; Rajamani, P. 산화철 나노입자 유도 쥐의 조혈 및 면역학적 반응. RSC 어드밴스 2020, 10, 35753–35764. [교차 참조]
5. 미국 가하와르 Paulraj, R. 산화철 나노입자는 쥐의 말초 혈액 세포에서 산화적 손상을 유발했습니다. J. 바이오메드. 과학. 영어 2015, 8, 274–286. [교차 참조]
6. Feng, Q.; 리우, Y.; 황, J.; 첸, 케이.; 황, J.; Xiao, K. 다양한 크기와 코팅을 가진 산화철 나노입자의 흡수, 분포, 제거 및 독성. 과학. 의원 2018, 8, 1–13. [교차 참조] [PubMed]
7. 미국 가하와르 미나, R.; Rajamani, P. 수컷 Wistar 쥐에서 정맥 내 투여된 산화철 나노 입자의 생체 분포, 제거 및 형태학적 변경. 국제 J. 나노메드. 2019, 14, 9677–9692. [교차 참조] [PubMed]
8. Palmieri, B.; Sbleendorio, V. 산화 스트레스 테스트: 신뢰성 및 사용에 대한 개요, 파트 II. 유로 메드 목사 파마콜. 과학. 2007, 11, 383–399.
9. Naqvi, S.; Samim, M.; 압딘, MZ; 아메드, FJ; 마이트라, AN; 프라샨트, CK; Dinda, AK 증가된 산화 스트레스에 의해 매개되는 산화철 나노입자의 농도 의존적 독성. 국제 J. 나노메드. 2010, 5, 983–989. [교차 참조]
10. 데이비드, AVA; Arulmoli, R.; Parasuraman, S. 케르세틴의 생물학적 중요성에 대한 개요: 생리 활성 플라보노이드. 파마코그. 개정판 2016, 10, 84–89.
11. 우, W.; 리, R.; 리, X.; 그, J.; 장, S.; Liu, S.; 항바이러스제로서의 Yang, J. Quercetin은 인플루엔자 A 바이러스(IAV) 진입을 억제합니다. 바이러스 2015, 8, 6. [교차 참조]
12. Akdemir, FNE; Gülcin, ˙I.; Karagöz, B.; Soslu, R. Quercetin은 허혈 재관류 손상으로부터 쥐의 골격근을 보호합니다. J. 효소. 억제 메드. 화학 2016, 31, 162–166. [교차 참조] [PubMed]
