생체 외 기계 관류 중 조절된 온열 요법에 의한 신장 보존/재관류 손상 감소
Mar 29, 2022
연락하다:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Thomas Minor1,*,† 및 Charlotte von Horn1,†
공여자 이식편의 분리된 생체외 기계 관류 동안 제어된 짧은 열충격 치료의 가능한 신장 보호 효과재관류1차 시험관 내 연구에서 조사해야 합니다.돼지신장(n=14) 기증자의 심장 정지 20분 후에 회수되었고 위스콘신 대학교 용액에서 20시간 정적 저온 저장을 받았습니다. 앞서서재관류, 신장35도까지 관류 온도를 점진적으로 증가시키면서 2시간 동안 기계 관류를 재조정했습니다. 절반에신장(n=7), 기계 관류 기간에 짧은 온열 자극(42도에서 10분 관류)을 구현했습니다. 이식편의 기능적 회복은 시험관 내 정상 온도 재관류시 관찰되었습니다. 온열 치료는 열 충격 단백질(HSP) 70 및 HSP 27 mRNA의 50% 증가를 가져왔고 대조군과 비교하여 재관류 시 나트륨 및 포도당의 세뇨관 재흡수의 약 50% 개선을 동반했습니다. 또한, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제의 신장 손실은 알부민 대 크레아티닌 비율로 평가되는 요단백 손실과 마찬가지로 대조군의 1/3로 유의하게 감소했습니다. 생체 외 열 충격 치료는 신장 자기 방어 기계를 강화하기 위해 쉽게 실행할 수 있고 유망한 옵션인 것으로 결론지어집니다.재관류부상보존 후 전임상 모델에서 추가 조사가 필요합니다.
연구 하이라이트
주제에 대한 현재 지식은 무엇입니까?
✔ 국부 조직에서 열 충격 단백질(HSP)의 유도는 환경 스트레스에 대한 잘 알려진 방어 메커니즘입니다. 이러한 분자 샤페론의 상향 조절은 후속 세포에 대한 복구 메커니즘과 내성을 유도합니다.부상. 객관적인신장이식은 허혈/재관류에 대한 감수성이 강화된 확장 기준 기증 기관의 사용에 점점 더 의존하고 있습니다.부상. 변연 기관 이식편의 생체 외 기계 관류는 이식편에 대한 특권적 접근과 열 충격 반응을 촉발하고 조직의 연속적인 악화에 유리하게 영향을 미치는 신호 경로를 발현하기 위해 격리된 장기에 고열 자극을 쉽고 제어된 적용을 위한 새로운 관점을 제공합니다. 부상 및 개선신장이식 후 회복.
이 연구에서는 어떤 질문을 다루었습니까?
✔ 우리는 생체 외 이식 전 동안 짧은 고열 자극의 잠재적인 보호 효과를 조사합니다.신장관류허혈 후 기능적 결과재관류.
이 연구는 우리의 지식에 무엇을 추가합니까?
✔ 이 연구는 생체 외 신장 기계 관류 동안 온열 치료가 미미하게 보존된 기능적 결과의 개선을 위한 가능한 새로운 도구로 작용한다는 몇 가지 징후를 제공합니다.신장허혈성 재관류시. 데이터는 세포 파괴 감소 및 이식 후 세뇨관 신장 기능 개선에서 HSP의 관련 역할을 뒷받침합니다.
이것이 임상 약품을 어떻게 변화시킬 수 있습니까?
OGY 또는 번역 과학?
✔ 확립된 정상 체온 기계 관류 프로토콜에 단기 제어 온열 요법을 추가하는 것은 임상 적용을 위해 쉽게 실행할 수 있는 방법이며 이식 후 개선된 장기 회복에 기여할 수 있습니다.
임상적 신장 이식은 회수 이전에 손상되었거나 최적이 아닐 가능성이 있는 확장된 기준 기증자 장기의 사용에 점점 더 의존하고 있습니다.
품질. 허혈성 보존 시 해로운 유발 요인에 대한 감수성이 강화된 장기의 비율이 증가함에 따라 1,2 조직 변경
허혈/재관류 손상과 관련된 문제는 재관류 시 세포 기능 장애를 유발하는 신장 이식에서 점차 증가하는 주요 문제를 나타냅니다.
세포 샤페론의 유도 및 보호 신호 표현형의 트리거(예: 아임계 열 스트레스에 의한)는 이후 스트레스 상황과 관련된 조직 변경을 줄이고 조직 항상성에 도전하는 잘 알려진 메커니즘입니다.3,4
한계 기증자 이식편의 허혈성 저온 저장에 대한 대안 또는 부속물로서 격리된 기계 관류의 출현은 열 충격 반응 및 방출 신호를 촉발하기 위해 격리된 장기에 고열 도전을 쉽고 제어된 적용에 대한 새로운 관점을 열었습니다. 조직 손상의 연속적인 악화에 유리하게 영향을 미치고 이식 후 신장 회복을 개선하는 경로.
열 충격 반응의 전제 조건 효과는 세포 저항의 일시적인 비정상적 증가와 관련이 있을 뿐만 아니라 2차 세포 복구 메커니즘의 향상을 통해 작동하는 것으로 실험적으로 입증되었습니다.6 보다 최근에는 유도가 열 충격 단백질(HSP)의 경우 조직에 대한 원래의 손상이 이미 발생한 후 조기에 유도된 경우에도 보호를 제공할 수 있습니다.7
격리된 장기에 대한 특권적 접근은 전신 가열에 대한 번거로운 요구 사항을 배제하고 기증자 또는 수용자 유기체에 불리한 부작용을 초래합니다.
따라서 이 연구는 허혈성 재관류 시 약간 보존된 신장의 기능적 결과를 개선하기 위한 가능한 새로운 도구로 작용하기 위해 생체외 신장 기계 관류 동안 고열 치료의 일차 증거를 조사하기 위한 파일럿 조사로 의도되었습니다.
행동 양식
모든 실험은 죽은 암컷 German Landrace 돼지(나이: 10-12주, 체중: 25 및 30kg)에서 회수한 신장에 대해 수행되었습니다. 동물 보호에 관한 연방법 및 실험 동물 관리 원칙(National Institutes of Health(NIH) 간행물 번호 85-23, 1985년 개정)을 따랐습니다. 동물은 규칙에 따라 지역 당국의 승인을 받은 후 처리되었습니다.
순환 정지 후 20분 후에 신장을 제거하고 유출물이 맑아질 때까지 위스콘신 대학교의 차가운(4도) 용액으로 100cm 중력에 의해 백 테이블에서 플러시했습니다. 어떤 경우에도 헤파린을 투여하지 않았습니다.
이식편은 이어서 위스콘신 대학교 용액으로 채워진 비이커에 18시간 동안 저장하고 저온 항온 장치에 의해 온도를 4도로 조절하였다.
대조군에서 신장은 40g/L의 소 혈청 알부민이 보충된 Aqix RS I 용액으로 2시간 동안 산소가 공급된(95% O2, 5% CO2) 정상 체온 기계 관류를 받았습니다. 앞서 제안한 바와 같이,8,9 저체온에서 관류가 시작된 후 프로그래밍 가능한 순환 저온 온도 조절 장치에 의해 제어되는 처음 60분 이내에 35도까지 점진적으로 증가했습니다.
실험군에서는 짧은 기간의 조절된 온열요법(CH)이 분리된 관류에 포함되었습니다.
소기관 이식편 및 폰 혼 프로토콜의 생체외 열충격 치료. 35도에 도달한 후, 나머지 2-시간 기간 동안 35도에서 관류를 계속하기 전에 관류액의 온도를 10분 동안 43도로 일시적으로 추가로 높였습니다(그림 1). 온도 상승의 시간과 높이는 일관된 효과를 얻기 위한 이전의 점진적 스크리닝 실험에서 파생되었습니다.
세 가지 실험에서 조직의 산소 분압은 온도 보상 광섬유 산소 측정기(Microx 4, PreSens Precision Sensing, 독일 Regensburg)에 연결된 극세사 바늘형 광학 산소 센서를 사용하여 제어했습니다. 서미스터 프로브를 사용하여 해당 온도를 기록했습니다.
고열의 관류 기간 동안에도 적절한 조직 산소 공급을 기록하기 위해 바늘을 신장의 내부 피질 영역에 배치했습니다.
분리된 신장 재관류 모델
보존/재관류 손상으로부터의 신장 회복은 이전에 설명한 대로 확립된 시험관 내 재관류 모델을 사용하여 평가되었습니다.10
간단히 말해서, 신장은 기계 재조정 기간이 끝날 때 100mL의 식염수 용액으로 냉각된 다음 생체 내 외과적 이식 동안 두 번째 따뜻한 허혈 기간을 시뮬레이션하기 위해 실온에서 20분 동안 유지되었습니다. 이 시간은 또한 재관류 시 소변 수집을 허용하기 위해 큰 튜브로 요관에 캐뉼러를 삽입하는 데 사용되었습니다.
신장을 자동 온도 조절식 플렉시글라스 챔버에 넣고 평균 박동압 90mmHg에서 신장 동맥을 통해 관류했습니다. 정맥 유출물은 저장소로 자유롭게 배출되었습니다. 관류액의 산소화는 열 제어식 중공사 산소화기를 사용하여 95% O2/5% CO2로 수행되었습니다. 동맥 관류 캐뉼라에 연결된 압력 변환기와 함께 서보 제어 롤러 펌프를 사용하여 동맥압을 유지했습니다. 저장소 외부로 안내된 요관에 삽입된 PE 튜브에서 소변을 수집했습니다. 수집된 소변 100mL마다 여과하고 저장소에 다시 주입합니다.
그림 1신장각 관류액 온도(실선)와 관련하여 생체 외 기계 관류 중 피질 조직 pO2(점선).
시간이 지남에 따라 관류액의 전해질 조성을 일정하게 유지합니다.
분석 절차
포도당 및 전해질의 산소 분압 및 관류액 농도는 pH-혈액 가스 분석기(ABL 815flex acid-base lab, Radiometer, Copenhagen)에서 측정되었습니다.
Aspartate aminotransferase(AST)의 효소 활성과 크레아티닌 농도는 Reflotron Plus 현장 진료 장치(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)에서 반사 광도계에 의해 일상적인 방식으로 결정되었습니다.
신장청소율은 각 간격에 대해 요 크레아티닌 × 소변 흐름/관류액 크레아티닌으로 계산되었습니다.
실험 종료시 소변 분획의 알부민 농도는 대학병원 연구실에서 bromocresol green을 이용한 염료결합법을 이용하여 측광법으로 측정하였고 단백질의 양은 소변의 알부민인 크레아티닌의 해당 농도에 대해 정규화하였다. 크레아티닌 비율.
여과된 나트륨(FL Na) 부하를 다음과 같이 계산했습니다.
플로리다=GFR × 나
FRNa=(FLNa − Na(소변) ×urineflow)∕FLNa
여과된 부하 및 포도당의 부분 재흡수가 이에 따라 계산되었습니다.
역전사 및 후속 중합효소 연쇄 반응
총 RNA는 외부 피질에서 스냅 동결된 조직 샘플에서 분리되고 이전에 설명한 대로 분석되었습니다.8
기준 값은 생체에서 채취한 조직 샘플에서 계산되었습니다.신장생체 외. 결과는 ΔΔCt 방법을 사용하여 정량화되었습니다. 표적 유전자는 내부 표준으로서 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소에 대해 정규화되었습니다. 기준선 값에 대해 정규화된 각 개별 샘플에 대해 배수 유전자 발현 값을 계산했습니다.
다음 프라이머(Qiagen GmbH, Hilden, Germany에서 구매)가 연구에 사용되었습니다. 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(PPS00192A), HSP72(PPS00074A), HSP27(PPS01262) 및 H2O{ {6}}(번호 PPS01191A).
웨스턴 블롯
단백질 면역 블로팅은 외부에서 전체 세포 용해물에서 수행되었습니다.신장소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 니트로셀룰로오스 막으로의 전기영동 전달에 의한 피질. 이전에 설명한 대로.8 염색은 단백질 로딩 및 전달의 균일성을 확인하기 위해 Ponceau S로 수행되었습니다.
1차 항체와의 인큐베이션은 4도(토끼 항-포스포 세포외 신호 조절 키나제(ERK, Thermo Fisher, #MA{4}}-1:500) 또는 항 HSP 72(StressMarq Bioscience, #SCM)에서 밤새 수행되었습니다. -100—1:300). 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 이차 항체(1:1,{14}})와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한 후 C-Digit Blot을 사용하여 향상된 화학 발광에 의해 단백질을 검출했습니다. 스캐너(Li-COR).
단백질 함량의 정량화는 총 ERK(Thermo Fisher, #MA5-15174) 또는 ß-액틴(Thermo Fisher)의 발현에 대해 정규화된 UN-SCAN-IT 겔 버전 6.1(Silk Scientific, Orem UT)을 사용하여 밀도계로 수행되었습니다. , #PA1-46296).
통계
모든 값은 그룹당 n {{0}} 동물에 대한 평균 ±SD로 표시되며 그룹 간의 차이는 달리 표시되지 않은 경우 이분산에 대한 Welch 보정을 사용하여 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정에 의해 테스트되었습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로="">
결과
기계 관류
기계 관류 이식편의 제어된 산소 재가온 동안 일시적인 고열로 인해 눈에 띄는 일시적인 감소가 나타났습니다.신장피질 조직 pO2(그림 1), 그럼에도 불구하고 항상 200mmHg 이상으로 유지되어 30-50mmHg로 보고된 정상 체온 관류 동안 생리학적 요구 사항을 분명히 준수했습니다.11,12
신장순환 관류액으로의 AST 방출은 대조군 조건(19.8 ± 12.1 대 33.3 ± 25.9 U/L, CH 대 대조군, 유의하지 않음)에서보다 온열 요법 그룹에서 약간 더 낮았습니다.
생체 외 기계 관류 중 일시적인 고열의 분자 판독
보존 및 재관류는 hemoxygenase 1, HSP 27의 mRNA 전사체의 ~2-배, 8-배, 심지어 100-배 증가가 있는 제어 조건에서도 HSP의 현저한 유도를 유도합니다. , 및 HSP 72, 각각.
그럼에도 불구하고, 기계 관류 동안 조절된 일시적인 온열 요법은 모든 경우에서 이러한 유전자 유도 증가를 약 50%까지 효과적으로 향상시켰습니다. 효과는 HSP 27 및 HSP 72에 대해 매우 유의미한 것으로 밝혀진 반면, 헴 옥시게나제 1의 유도와 관련하여 통계적 유의성이 입증될 수 없었습니다(그림 2).
ERK의 인산화는 HSP 72.13의 발현도 촉진할 수 있는 빠르고 반응성이 있는 보호 신호 이벤트를 나타냅니다.
열 스트레스가 단백질 수준에 미치는 초기 영향으로 조사되었습니다. Western blot 분석은 기계 관류 중 일시적인 온열 요법이 대조군과 비교할 때 조직에서 ERK 인산화의 양을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 3). 상응하게, HSP 72의 단백질 발현은 또한 기계 관류 동안 조절된 온열 요법 후에 대조군 값보다 유의하게 상승된 것으로 밝혀졌다.
일시적인 온열 요법이 개선됩니다.신장보존 후 회복
재관류 중 관류액의 흐름은 평균 300~400mL/분이며 둘 사이에는 차이가 없습니다.
여러 떼. 소변 생성도 897 ± 354 대 601 ± 280 mL/90분으로 두 그룹에서 유사했습니다(대조군 대 CH).
신장AST의 방출은 전체 세포 손상의 매개변수로 취해졌고 재관류 동안 따랐습니다(그림 4). 온열 치료는 재관류가 시작될 때 초기에 더 낮은 값을 초래하고 진행중인 관류 동안 점진적인 상승을 더욱 완화시키는 것으로 나타났습니다.
신장세뇨관 세포 기능은 초여과물로부터의 나트륨 및 포도당 재흡수 분석에 의해 평가되었습니다(그림 5). 에서 부분적인 재흡수율이 발견되었다.신장, 이전에 기계 관류 동안 통제된 온열 요법을 받은 그룹은 ~ 40%까지 통제 그룹의 것을 크게 능가했습니다.
통제 가능성을 배제하기 위해신장한외여과물에서 절대적으로 더 높은 나트륨 또는 포도당 부하로 충전되었을 수 있으며, 우리는 또한 두 물질의 총 여과 부하를 결정했지만 FL Na가 2.7 ± {{3 }}.7 및 2.5 ± 0.8 mmol/분 및 FL glu에서 24.8 ± 12.1 및 28.6 ± 9.4 mg/분(각각 대조군 대 CH).
사구체 여과율도 두 그룹에서 모호했습니다. 크레아티닌 제거 값은 {{0}}.25 ± 0.{6}}대조군에서 6mL/g/분, 0.24 ± 0.08mL/g/분에 이르렀습니다. CH 이후.
대조적으로, 요단백 누출은신장CH(그림 6)의 대상이 되었습니다.
논의
생체 외 기계 관류의 사용은 장기 이식 전에 이식편 보존 관리에서 진화하는 추세를 나타냅니다.
지난 10년 동안 저체온 기계 관류는 단순한 정적 냉장 보관에 비해 우수한 보존 방법으로 확립되었으며 14,15 고위험 및 확장 기준 장기의 보존에 널리 보급되었습니다.14-16
체외 기간 동안 맥박 구조의 맥동 자극과 산소의 존재는 유지되는 것으로 나타났습니다.신장항상성 및 개선기능의이식 후 결과.
최근의 기술 발전은 대사 항상성의 개선된 유지와 보존된 이식편을 평가할 보다 확실한 기회로 더 높은 비용을 보상하는 저체온 관류 기술에 대한 보다 생리학적 대안으로서 정상 체온 기계 관류에 대한 새로운 경향을 촉진했습니다. 이식 전.19,20
이 외에도, 정상체온 기계 관류는 선행 검색/보존 손상의 결과를 완화하거나 이식 시 재관류 및 두 번째 온열 허혈 후 나중 재관류 손상에 대한 전제 조건을 제공하는 것을 목표로 하는 컨디셔닝 목적을 제공할 수 있는 격리된 장기에 대한 치료 개입을 위한 이상적인 플랫폼을 나타냅니다.
cistanche 신장 위쿵
치료적 접근으로서 열충격 치료는 신장에서 매우 효과적인 보호 메커니즘을 촉진하고 단백질 구조와 세포 무결성을 안정화함으로써 특정 손상에 대한 내성을 유도하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 효과는 주로 신장에서 구성적으로 발현되고 다양한 스트레스 조건에 반응하여 고도로 상향조절될 수 있는 특정 HSP의 합성에 기반합니다.4
이 연구는 격리된 신장 관류 동안 짧은 온열 도전이 사전 전사 및 단백질 수준에서 입증된 바와 같이 분자 열 충격 반응을 효과적으로 유도하고 ERK 경로를 통해 생존 신호를 활성화한다는 것을 보여줍니다. 설명된 절차는 추가 산소 운반체 없이 격리된 관류에도 불구하고 명백한 조직 저산소증과 관련되지 않았습니다.
HSP의 유도는 < 1시간 이내에 시작될 수 있고 HSP 72의 발현은 이미 3시간 후에 다수로 증가한다는 것이 이미 확립되어 있습니다. 세포 자기 방어 기계의 증강에 의한 조직 보호의 역할.5
HSP 72는 단백질의 잘못된 접힘을 방지하고,5 손상된 단백질의 제거를 촉진하고,6 단백질 재접힘 및 복구에 참여합니다. 새로운 합성보다 훨씬 저렴한 세포 복구 프로세스를 지원합니다. 따라서 HSP 72는 세포 손상 후 재관류 시 중요한 상황에서 대사 요구를 감소시켜 도움이 됩니다.세포 회복모욕에서.
리소좀 막23의 안정화는 산 가수분해 효소에 의한 세포 손상과 세포 사멸의 연속적인 유도를 감소시킵니다. 분자 수준에서 초기 연구는 HSP 72가 MEK/Erk 경로를 활성화하고 관련 보호 효과가 Raf, MEK 및 Erk 인산화 및 세포 생존과 관련이 있음을 나타냅니다.24,25 따라서 우리 모델에서 CH는 상당한 일반적인 세포 손상의 매개변수로 간주되는 AST의 전체 방출 감소. 더욱이, 진행 중인 재관류 동안 AST의 점진적인 증가는 또한 치료에 의해 현저하게 약화되었다.
이와 함께 상당한 완화가 이루어졌습니다.신장 기능 장애관형 세포 재흡수 용량이 대조군 값보다 ~ 50% 증가한 것으로 밝혀졌습니다.
HSP 27은 저분자량 HSP로 신장의 보호 열충격 반응에서도 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다.4 쥐의 세뇨관 세포에 대한 연구에 따르면 근위 세뇨관 세포에 HSP 27이 축적되면 생존율 및 재생.26
현재 파일럿 연구의 결과를 기반으로, 생체 외 기계 관류 프로토콜에 대한 간단한 고온 도전의 구현은 세포 자기 방어의 향상에 의해 재관류 손상에 대한 회복력을 촉진하는 미미하게 보존된 신장 이식편을 조절하는 쉬운 방법인 것으로 보입니다. 기계. 기계 관류가 물류적 불편을 초래함에도 불구하고 이식편 조달 직후에 이루어져야 하는지, 또는 정적 저온 저장에 의한 장기 수송 후 짧은 허혈성 말기 관류 기간이 충분하고 더 쉽게 시행할 수 있는지에 대한 논란이 여전히 존재합니다. 임상 루틴.28,29 CH에 의한 이식편의 생체외 컨디셔닝은 두 방식 모두에서 가능합니다.
그러나 성급한 최종 결론에 대해서는 주의를 기울여야 합니다. IPK(격리 관류 신장)는 기능 선별 연구30에 유용한 도구이며 IPK 데이터와 임상 결과 사이의 상관 관계는 IPK 모델을 신장 기능 평가에 잠재적으로 유용한 도구로 만듭니다.17,31 그러나 모델의 상당히 일정한 기능 용량 몇 시간으로 제한되어 있어32 장기간 관찰이 불가능합니다.
HSP의 최대 발현은 이 시간 이후에도 계속 발생할 수 있으므로22 온열 치료의 보호 효과(예: 허혈성 손상 후 재생 개선 측면에서)의 잠재적 추가 증가는 파일럿 설정에서 설명되지 않습니다. 또한, HSP 27의 열 충격 치료 또는 렌티바이러스 유도 과발현이 손상된 표적 기관의 염증 반응성을 완화시킬 수 있다는 다른 모델의 초기 연구에서 잘 알려져 있습니다.
조직으로의 호중구 침윤의 상당한 감소와 함께.33,34
백혈구 침윤은 차례로 신장 허혈 및 생체 내 재관류 후 유해한 염증 반응을 유발하는 주요 급성 유형 현상으로 알려져 있습니다.
그러나 확장된 시험관 모델에서 피할 수 없는 인공 튜브 표면에 대한 혈액 세포 활성화의 부수적인 부작용을 배제하기 위해 자연 혈관 형태를 포함한 생리학적 조건에서 실제 이식 및 재관류가 세포를 정확하게 해결하는 데 필수적인 것으로 보입니다. 따라서 현재 파일럿 조사에서 다루지 않은 염증 효과.
마침내 최근의 연구 결과는 상당한성별 차이만성 신장 질환 또는 전염증성 유전자 모듈의 성 관련 격차를 반영할 수 있는 남성 대 여성의 근위 세뇨관 세포에서 발현된 전사체에서. 열 충격 반응. 반면에 남성 조직의 아마도 다른 행동은 다루어지지 않았으므로 이 연구에서 설명할 수 없습니다.
결론적으로, 우리의 데이터는 지금까지 짧은 고열 생체외 관류가 조기 재관류 시 실질 보호를 부여하고 관찰 시간이 연장된 생체내 이식 모델을 사용하여 추가 확인을 보증하는 격리된 신장 이식편에서 샤페론 유도에 대한 쉬운 방법임을 보여줍니다.
감사합니다. 저자는 Bastian과 Regina Lüer의 귀중한 기술적 도움에 감사하게 생각합니다.
자금 조달. 이 작업에 대한 자금 지원을 받지 않았습니다.
이해 상충. 저자는 이 작업에 대해 경쟁적인 이해 관계가 없다고 선언했습니다.
저자 기여. TM과 CvH가 원고를 작성했습니다. TM과 CvH가 연구를 설계했습니다. TM과 CvH가 연구를 수행했습니다. TM과 CvH는 데이터를 분석했습니다.
