허혈-재관류 손상에 대한 벨루가 렌틸 전처리의 신장 보호 효과

이승욱,¹ 소영춘,²이은혜,²김보미,²윤보현,² 외

배경 및 목표. 급성으로 인한 허혈/재관류(I/R) 손상신장손상, 조직 병리학 적 변화, 세뇨관 세포 사멸, 염증, 산화 및 신장 기능 상실을 유발합니다. 우리는 벨루가 렌틸 전처리의 I/R 손상에 대한 보호 효과를 평가했습니다. 재료 및 방법. 마우스를 4개의 그룹으로 나누었습니다: 정상, 미처리, 저용량(2mg) 및 고용량(8mg) 벨루가 렌틸 처리 그룹. 벨루가 렌틸콩을 2주간 경구 투여한 후 양측 신장 허혈을 20분간, 재관류를 30분간 하였다. 혈액 샘플 및신장신장 기능, 조직 병리학, 상피 및 내피 세포를 조사하기 위해 조직을 수집하고 분석했습니다.손상, 세포 사멸, 산화 스트레스 및 염증 반응. 결과. 전처리 그룹은 다른 그룹에 비해 혈액 요소 질소(BUN)와 크레아티닌 수치가 현저히 낮아 신기능을 유지했습니다. 조직병리학적 분석에서는 근위세뇨관 손상이 감소하고 손상 관련 분자가 감소하는 것으로 나타났습니다(신장다른 그룹과 비교하여 전처리 그룹에서 손상 분자 1(KIM-1) 및 호중구 젤라티나제 관련 리포칼린(NGAL) 분비. 말단 deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling-(TUNEL-) 양성 세포와 apoptosis 관련 분자(Fas와 caspase 3)의 분비는 다른 군에 비해 전처리군에서 유의하게 감소하였다. 전처리된 그룹은 양성 미세혈관 관련 유전자(분화 클러스터(CD31)) 발현 및 음성 접착 분자(세포내 접착 분자 1(ICAM{11}})) 발현을 나타냈습니다. malonaldehyde(MDA) 발현 감소와 항산화 효소(superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione(GSH), glutathione peroxidase(GPx)) 분비 증가와 함께 전처리군에서 항산화 효과가 관찰되었습니다. 전처리군에서 F4/80 + 대식세포 및 CD4 + T 세포 침윤이 억제되었고 전염증성 사이토카인(인터류킨-(IL-) 1 , IL{18}} 및 종양 괴사 인자-(TNF-)) 수준이 감소했습니다. 그러나 항염증성 사이토카인(전환 성장 인자-(TGF-), IL{24}} 및 IL{25}})의 수준은 증가했습니다. 결론. 벨루가 렌틸콩 전처리는 항아폽토시스, 항염증 및 항산화 활성을 통해 I/R 유발 신장 손상에 대한 보호 효과를 입증했습니다.

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1. 소개

부분 신절제술 또는 신장 이식 중 허혈/재관류(I/R) 손상은 급성신장손상 [1, 2] 및 신장 기능의 비가역적 악화 [3]를 초래할 수 있습니다. 허혈은 신세뇨관 상피세포에서 세포자멸사를 유발하여 간질세포의 염증반응을 증폭시킨다. 재관류는 내피 세포 표면의 부착 인자 발현을 통해 염증 세포 이동을 촉진하는 미세혈관 손상을 유도한다[4-8]. I/R 손상은 또한 산화 스트레스를 유발하여 활성 산소 종(ROS)을 증가시키고 항산화 효소 활성을 감소시켜 [9] 염증 유발 인자의 생성 증가 [10], 카스파제 경로 활성화 및 세포 사멸 증가를 초래합니다. 결국 신장 기능의 손실을 초래합니다[11]. I/R로 인한 신손상을 예방하기 위해 항염 및 항세포자멸 기능을 가진 항산화제의 사용이 제안되었다[10-14].

렌즈콩 품종(녹색, 적색, 프랑스식 또는 벨루가)에는 다양한 생리 활성 화합물, 특히 항산화제가 포함되어 있습니다[15]. 이들의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 27.30-30.30mg(탄닌산 등가물)/g에서 13.14-16.29mg(퀘르세틴 등가물)/g 범위입니다[16]. 벨루가 렌틸콩은 상당히 높은 폴리페놀 함량과 ROS 소거 효과가 있는 것으로 입증되었습니다[16]. 우리 팀은 시험관 내 간 세포주 실험을 사용하여 렌즈콩의 항산화 효과를 보고했습니다[16]. 벨루가 렌틸콩은 다른 렌틸콩 품종에 비해 AML{13}} 세포에서 알코올 유발 세포독성에 대해 상당한 보호 효과를 보였습니다. 벨루가 렌틸콩의 항염 효과는 지질다당류 처리된 RAW264.7 세포에서도 관찰되었습니다[17]. 벨루가 렌틸콩 처리는 핵 인자 E2-관련 인자{20}}(Nrf{21}}) 매개 헴의 상향 조절을 통해 산화질소(NO) 생성 및 유도성 NO 합성효소(iNOS) 발현을 유의하게 감소시켰습니다. 옥시게나제-1(HO{23}}) 경로. 이러한 시험관 내 실험은 벨루가 렌틸콩의 항산화 및 항염 효과를 시사했습니다.

벨루가 렌틸콩의 적용을 확대하기 위해 신장 I/R 손상 마우스 모델에 적용하고 신장 보호 효과를 평가했습니다. 본 실험에서는 벨루가 렌틸콩을 전처치로 2주간 투여한 후 허혈 20분, 재관류 30분을 하였다. 벨루가 렌틸콩 전처리의 신장 보호 효과는 신장 기능, 조직 병리학, 상피 및 내피 세포 손상, 세포 사멸, 산화 스트레스 및 염증 반응을 분석하여 검증되었습니다. 우리는 벨루가 렌틸콩으로 전처리하면 항산화, 항염, 항세포자멸 활동을 통해 I/R로 인한 신장 손상을 예방할 수 있다고 가정했습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 동물 그룹 및 치료 조건.

모든 절차는 영남대학교 동물병원 동물관리위원회(AEC{0}})에서 승인한 동물 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. 마우스(ICR, 8주령, 수컷, 23–25g, Orient, Seongnam, Korea)를 다음 4개 그룹(그룹당 n =7)으로 무작위로 나누었습니다. (1) 정상, 정상 대조군; (2) 미처리, 식염수 처리군; (3) 저용량(2mg/100μL 생리식염수/-BioMed Research International 마우스), 14-벨루가 렌틸콩 전처리 그룹; 및 (4) 고용량, 고용량(8mg/100μL 식염수/마우스), 14-벨루가 렌틸콩을 1일 경구 투여, 전처리 그룹. 벨루가 렌틸콩은 이승욱 교수(계명대학교, 대구, 한국)에 의해 제공되었으며, 추출물 제조 및 생리활성 화합물 분석은 이전 연구에서 보고되었다[16]. 치료 후 동물을 엎드린 자세로 마취하고 등쪽 절개를 하였다[1]. 두 신장의 신동맥과 정맥은 이전에 기술된 프로토콜에 따라 20분 동안 혈관 클램프로 폐색된 후 30분 동안 재관류되었습니다[18, 19]. 심장 천자로 혈액을 채취하고 신장을 적출했습니다. 신장은 인산완충식염수로 씻었다. 한 신장은 RNA 및 단백질 추출에 사용되었고 다른 신장은 조직학적 분석에 사용되었습니다.

2.2. 조직병리학적 및 면역조직화학(IHC) 분석.

헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 이용하여 조직병리학적 검사를 시행하였고, 내강 내로 떨어지는 세뇨관 세포의 존재, 박리된 세포의 핵 손실, 내강 파편, 붕괴된 내강 공간 및 면역 세포 침윤의 요인에 따라 손상을 평가하였다. . 점수는 병리학 전문가에 의해 달성되었습니다. 점수 0, 관상 손상 없음; 점수 1,<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">세뇨관의 75%가 손상되었습니다. IHC 분석을 위해 신장은 4% 파라포름알데히드로 고정되었고 파라 포매 샘플은 5μm 섹션으로 절단되었습니다. 일상적인 과정에 따라 H&E 및 IHC 염색을 수행했습니다. 면역 세포(F4/80 및 분화 클러스터 8(CD8), Abcam, Cambridge, UK) 및 내피 세포(CD31 및 세포내 접착 분자 1(ICAM{10}}), Abcam) 마커에 대한 1차 항체를 섹션에 적용했습니다. , 4도에서 24시간 동안(희석 1:200), 이어서 2차 항체(Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, USA), 실온에서 1시간, 및 4',{18}}diamidino{18}}diamidino{18} {19}}페닐인돌(DAPI)을 사용하여 핵을 염색했습니다.

2.3. 단백질 분석.

신장 기능 분석을 위해 항응고제 없이 혈청을 분리하고 Creatinine Colorimetric Assay Kit 및 QuantiChrom Urea Assay Kit(BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, USA)를 사용하여 혈청 크레아티닌 및 혈액 요소 질소(BUN) 농도를 검출했습니다. ), 각각. 세뇨관/혈관 손상, 산화 스트레스, 항산화 효소 및 세포 사멸을 평가하기 위해 신장 조직을 각각의 완충액으로 균질화했습니다. 신장 세뇨관 상피 세포 손상을 분석하기 위해 신장 손상 분자-1(KIM-1) 및 호중구 젤라티나제 관련 리포칼린(NGAL) 농도를 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 평가했습니다(USCN Life Science Inc. ., 중국 우한). 세포 사멸을 분석하기 위해 Fas 및 caspase 3 농도를 각각의 ELISA 키트(Abcam)를 사용하여 측정하였다. 산화 스트레스를 평가하기 위해 MDA 분석 키트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute, Nanjing, China)를 사용하여 말론알데히드(MDA) 수치를 측정했습니다. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라제(CAT), 글루타티온(GSH) 및 글루타티온 퍼옥시다제(GPx)를 포함한 항산화 효소는 종합 SOD 분석 키트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), CAT 분석 키트( Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), 각각 GSH 형광 분석 키트 및 GPx 분석 키트(BioVision Inc.). 모든 키트는 제조업체의 지침에 따라 사용되었습니다.

2.4. 유전자 발현 분석.

TRIzol Reagent로 total RNA를 추출하고 cDNA 합성 키트(Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 사용하여 20ug total RNA로부터 cDNA를 합성하였다. Real-Time PCR 조건은 95도 10분, 95도 10초, 60도 50초, 72도 20초로 40회 반복하였다. 유전자 증폭은 SYBR green을 이용하여 검출하였고, 2-ΔΔCt 방법을 이용하여 발현을 분석하였다. 실험은 인터루킨-(IL-) 1 , 5'-gcccatcctctgagactcat{17}}' 및 5'-aggccacagg-tattttgtcg{21}}' 프라이머 시퀀스를 사용하여 세 번 수행되었습니다. IL-6, 5′-agttgccttcttgggactga-3′ 및 5′ -tccacgatttcccagagaac-3′; 종양 괴사 인자-(TNF-), 5'-agcccccagtctgtatcctt-3' 및 5'-ctccctttgcagaactcagg-3'; 변형 성장 인자-(TGF-), 5'-tggttgtagaggg-caaggac-3' 및 5'-ttgcttcagctccacagaga-3'; IL-10, 5′ -acctggtagaagtgatgccc-3′ 및 5′-agggtcttcagcttctcacc-3′; IL- 22, 5′-tccaacttccagcagccata-3′ 및 5′-tagcactgactcctcggaac- 3′; 및 글리세르알데히드 3'-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3' 및 5'-cctgcttcac-caccttcttga-3'.

2.5. TUNEL 분석.

아폽토시스를 평가하기 위해 제조사의 지시에 따라 아폽토시스 검출 키트(Chemicon, Bedford, MA, USA)를 사용하여 TdT 매개 dUTP nick-end labeling(TUNEL) 분석을 수행했습니다. 간단히 탈파라핀화되고 재수화된 슬라이드를 37도에서 15시간 동안 2{6}}ug/mL 단백질분해효소 K로 분해하여 단백질을 제거하고 3.0% 과산화수소로 처리하여 내인성 과산화효소를 켄칭했습니다. 슬라이드를 1x TdT 평형 완충액에 담그고 TdT 효소의 작용력을 37도에서 1시간 동안 첨가하였다. 3'-OH DNA 말단에 anti-digoxigenin conjugate를 30분간 적용하고 peroxidase 기질을 이용하여 3분간 발색하였다. DAPI 처리 후 슬라이드를 장착했습니다. TUNEL 양성 핵은 200x 배율에서 각 조직 샘플의 모든 시야에서 계산되었습니다.

2.6. 통계 분석.

모든 값은 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. I/R 신장 손상 그룹과 beluga lentil-I/R 전처리 그룹의 유의한 차이는 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences v. 9.{{ 2}}, 미국 일리노이주 시카고). p 값 < 0.05는="" 유의미한="" 것으로="">

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3. 결과

3.1. 벨루가 렌틸 전처리가 신장 기능에 미치는 영향.

전처리된 그룹은 모두 I/R 손상에 대해 상당한 보호 효과를 보였습니다(그림 1). 무처리군의 평균 BUN 및 혈청 크레아티닌 농도는 각각 89:92 ± 7:29mg/dL 및 0:48 ± 0:16mg/dL였습니다. 전처리군은 BUN(낮음: 22:6±3:67mg/dL, 높음: 21:6±3:17mg/dL)과 혈청 크레아티닌(낮음: 0:25 ± {{19} }:04mg/dL, 높음: 0:23 ± 0:04mg/dL) 농도가 미처리 그룹과 비교됨(p<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">

3.2. 벨루가 렌틸 전처리가 관상 상피 세포 손상 및 세포 사멸에 미치는 영향.

세뇨관 손상, 특히 상피 세포의 위축은 외부 신장 수질에서 자주 관찰되었으며 박리 된 세포 핵 손실, 신장 세뇨관의 내강 파편, 붕괴 된 내강 공간 및 간질 호중구 침윤이 때때로 신장에서 확인되었습니다. 처리되지 않은 그룹(그림 2(a)). 대조적으로, 전처리된 그룹의 신장은 거의 정상적인 세포 형태를 보였고, 세뇨관 손상은 저용량 그룹보다 고용량 그룹에서 덜 자주 관찰되었습니다. 손상을 단위 면적당 백분율로 표시한 경우 손상 점수는 전처리 그룹에서 감소했습니다(낮음: 2:0±0:93, 높음: 1:5± {{ 11}}:53) 처리하지 않은 그룹(2:87 ± 1:25)과 비교했습니다(그림 2(b)). KIM{18}} 및 NGAL 분비를 검사할 때(그림 2(c)), ELISA 결과는 KIM{20}} 함량이 전처리군에서 감소함을 보여주었습니다(낮음: 1, 922:83 ± 199:42 pg/ mg, 높음: 1,827:83 ± 278:26pg/mg)을 비처리군(1,977:83 ± 184:49pg/mg)과 비교했습니다. NGAL 발현은 고용량 그룹(489:34 ± 19:95pg/mg)에서 저용량(527:36 ± 15: 19pg/mL) 및 무처리 그룹(537:05 ± 15: 70pg/mg) 그룹 (p<>

그런 다음, 관상 상피 세포 손상이 세포자멸사를 일으켰는지 여부를 분석했습니다. TUNEL 분석을 사용하여 단편화 된 염색체 DNA를 검출함으로써 세포 사멸을 평가했습니다 (그림 2 (d)). TUNEL 양성 세포는 전처리군에서 거의 관찰되지 않았다(낮음: 5:00 ± 1:22, 높음: 2:25 ± 1:09). 대조적으로, 무처리군은 외측 수질 영역에서 상대적으로 증가된 TUNEL-양성 세포의 수를 나타내었다(47:50 ± 16:77)(p<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">

I/R에 의해 유도된 관형 상피 세포 사멸.

3.3. 벨루가 렌틸 전처리가 내피세포 손상에 미치는 영향.

내피 세포에 대한 벨루가 렌틸 전처리의 효과는 CD31 항체를 사용하여 IHC에 의해 확인되었습니다(그림 3(a)). 정상군에서는 CD{3}}양성 혈관이 확인되었지만 무처리군에서는 CD{4}}양성 세포가 확인되지 않아 I/R에 의한 혈관 파괴를 나타냅니다. 고용량 전처리 그룹은 세뇨관 주변 모세혈관에서 CD{7}}양성 세포를 보여 고용량 벨루가 렌틸콩 전처리의 혈관 보호 효과를 나타냅니다. 유착 분자인 ICAM{10}}을 검출하여 내피 세포를 검사했으며, 양성 세포는 전처리군(46:4±41:7 세포/슬라이드)에 비해 관형 영역에서 더 자주 식별되었습니다( 낮음: 5:77 ± 1:01 셀/슬라이드, 높음: 3:72 ± 1:05 셀/슬라이드)(그림 3(b)). 이러한 결과는 벨루가 렌틸 전처리가 모세혈관을 보존하고 내피 세포 표면의 부착 분자 활성화를 억제함을 나타냅니다.

3.4. 벨루가 렌틸 전처리가 산화 스트레스에 미치는 영향.

To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{20}}}}:05), SOD의 경우(낮음: 360:21 ± 56:42U/mL, 높음: 362:7{{ 36}} ± 70:32U/mL, 미처리: 333:52 ± 41:58U/mL), CAT(낮음: 3:64 ± 1:09nmol/g, 높음: 3:21 ± 0:76nmol/g, 및 미처리: 3:18 ± 0:40 nmol/g), GSH(낮음: 4:13 ± 0:53 nmol/mg, 높음: 4:56 ± 0:69nmol/mg, 미처리: 3:59 ± 0 :53nmol/mg) 및 GPx(낮음: 198:89 ± 48:43U/ug, 높음: 219:61 ± 138:08U/ug, 미처리: 165:14 ± 34:73U/ug). 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았지만, 이러한 결과는 벨루가 렌틸 전처리가 신장의 항산화 효능을 향상시켜 I/R 유발 신장 산화 스트레스를 예방했음을 시사했습니다.

3.5. 벨루가 렌틸콩 전처리가 면역 세포 침투, 사이토카인 및 염증에 미치는 영향. 대식세포(F4/80 plus) 및 T 세포(CD4 plus) 침윤 및 전염증성 사이토카인(IL-1, IL{7}} 및 TNF-) 방출을 분석하여 세포사멸 유도 염증을 평가했습니다. IHC 분석에 의해 평가된 바와 같이, 처리되지 않은 그룹보다 전처리된 그룹에서 더 적은 F4/80 플러스 및 CD4 플러스 침투성 면역 세포가 관찰되었습니다(그림 5(a)). Real-Time PCR 분석에서 전 염증성 사이토카인(IL{15}} , TNF- 및 IL 6) 수준의 신장 mRNA 수준이 처리되지 않은 그룹에 비해 전처리 그룹에서 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 5(b) )). 그러나 항염증성 사이토카인(TGF- 및 IL{22}})의 mRNA 수준은 IL-10을 제외하고 전처리군에서 무처리군에 비해 증가하였다(그림 5(c)). 이러한 결과는 IL-10이 영향을 받지는 않았지만 항염 효과로 인해 벨루가 렌틸콩 전처리에 의해 신장에서 I/R 유발 염증 손상을 예방할 수 있음을 나타냅니다.

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4. 토론

I/R에 의해 유발된 신장 손상은 전통적으로 빠르게 감소하는 신장 기능을 특징으로 합니다[20]. 신장 기능은 사구체 여과 기능을 나타내는 질소 대사 최종 산물인 BUN과 혈청 크레아티닌 값을 사용하여 추정할 수 있습니다[21]. 무치료군은 기능적 신부전을 나타내는 BUN(89:92 ± 7:29mg/dL) 및 크레아티닌(0:48 ± {{20}}:16mg/dL) 값이 유의하게 증가했습니다. I/R에 의해 유도됩니다. 그러나 벨루가 렌틸콩 전처리군은 BUN(낮음: 22:6±3:67mg/dL, 높음: 21:6±3:17mg/dL)과 혈청 크레아티닌(낮음: 0)이 유의하게 감소했습니다. 25 ± 0:04mg/dL, 높음: 0:23 ± 0:04mg/dL) 값(p<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">

감소된 신기능은 I/R에 의해 가장 심하게 손상된 부위를 나타내는 세뇨관 상피를 가로질러 사구체 여과액의 역류로 인한 사구체 여과 문제를 나타냅니다[23]. I/R은 박리된 세포 핵 손실, 신세뇨관의 관강 파편 및 관 상피 세포의 붕괴된 관강 공간을 초래했습니다. 전처리된 그룹은 용량 의존적 방식으로 조직병리학적 세뇨관 손상이 감소된 것으로 나타났습니다. 관찰된 조직병리학적 세뇨관 손상은 분자 마커인 KIM{2}} 및 NGAL을 평가하여 확인되었습니다[24]. KIM-1은 apoptotic 세포 인식 분자로 작용하는 phosphatidylserine 수용체로 손상된 세포를 apoptotic/necrotic cell phagocytosis, apoptotic 찌꺼기 제거 및 proinflamatory response 제한을 위해 lysosome으로 전달합니다[25]. NGAL은 인간 호중구에서 유래한 젤라티나제에 결합하는 작은 siderophores 단백질입니다. NGAL은 정상 신장에서는 거의 발현되지 않지만 급성, 허혈성 또는 독성 신장 손상은 근위/원위 세뇨관의 상피 세포에서 NGAL을 분비하여 소변과 혈액의 NGAL 농도를 증가시킵니다. 따라서 NGAL은 I/R 유발 급성 신부전의 새로운 초기 바이오마커로 사용될 수 있습니다[26]. 전처치군은 KIM{8}}과 NGAL 분비가 감소하였고 고용량 전처치군은 미처치군에 비해 NGAL 분비가 유의하게 감소하였다. 세관 손상과 KIM{10}} 및 NGAL 단백질 분비의 관찰된 감소는 벨루가 렌틸 전처리가 I/R에 의해 유도된 세관 상피 세포 손상에 대한 보호 효과를 발휘했음을 나타냅니다.

I/R 손상이 심할 때 손상된 세포는 병태생리학적 세포 사멸 메커니즘인 세포 사멸 경로를 통해 제거됩니다[27]. Apoptosis-specific DNA 손상은 TUNEL 분석을 통해 감지할 수 있습니다.

TUNEL 양성 세포는 무처리군에서 자주 관찰된 반면, 벨루가 렌틸 전처리군은 투여량 의존적으로 TUNEL 양성 세포수가 현저히 감소하였다. 이러한 세포사멸의 조직학적 증거는 Fas 및 caspase 3 발현을 조사함으로써 확인되었다. Fas는 세포 사멸 수용체에 결합하는 리간드이며 프로그램된 세포 사멸 동안 처음에 관찰됩니다[28]. Caspase 3는 apoptotic cell-death pathway의 세포내 실행 효소로, apoptotic body 형성을 유발한다[29]. Fas 및 caspase 3 단백질 합성은 처리되지 않은 그룹에 비해 처리된 그룹에서 유의하게 감소하여 벨루가 렌틸 전처리가 I/R 손상 후 세포 사멸 신호 전달을 억제할 수 있음을 확인했습니다.

I/R 손상은 또한 신장 미세혈관의 손실을 유도하여[30], 내피 세포의 병리조직학적 변화를 초래합니다[20]. 신장 미세혈관 손상은 내피 세포 표지자인 CD31에 대한 항체를 사용하여 검출되었다[30]. CD31 발현은 치료되지 않은 그룹에서 검출되지 않았으며, 이는 신장 미세혈관의 손실을 나타냅니다. 그러나 고용량 전처리군에서는 정상군과 유사한 혈관 밀도로 CD31 발현이 양성으로 나타났으며, 이는 벨루가 렌틸 전처리제가 고용량에서 내피 세포 보존에 보호 효과를 발휘했음을 나타냅니다. 손상된 내피 세포는 ICAM-1[31]과 같은 내피-백혈구 접착 분자를 발현합니다. 증가된 부착 분자는 백혈구 활성화, 모세관 폐쇄, 사이토카인 생성 및 염증 유발 반응을 유발할 수 있습니다[32]. 처리되지 않은 그룹은 양성 ICAM{13}} 발현을 보여 내피 세포 손상에 의해 유도된 접착 분자 발현이 향상되었음을 나타냅니다. 그러나 고용량 전처리군은 음성 ICAM{15}} 발현을 나타내어 벨루가 렌틸 전처리가 기능적으로나 생리적으로 내피 세포 유지에 대한 보호 효과를 나타냅니다. 유지된 혈관 구조는 일관된 혈류를 제공하여 I/R에 의해 손상된 조직과 세포에 산소와 영양소를 전달하여 신장의 기능적 및 조직학적 회복을 돕습니다.

재관류는 손상된 세포에 산소 공급을 회복시켜 산소를 ROS로 전환시키는 산화 스트레스 관련 효소의 발현을 유발할 수 있습니다[33]. ROS는 불안정하고 반응성이 높은 산물로 세포의 단백질, 지질 및 핵산의 변화를 통해 DNA 손상, 세포 사멸 및 괴사를 일으키는 자유 라디칼을 생성합니다. 자유 라디칼은 세포막의 불포화 지방산을 손상시켜 지질 과산화를 유발합니다[34]. 그런 다음 지질 과산화물은 MDA로 분해되어 SOD, GPx, GSH 및 CAT와 같은 항산화 효소 활성을 감소시킵니다[35]. SOD는 과산화물을 CAT에 의해 더 분해되는 산소와 과산화수소로의 불균일화를 촉매합니다. GPx는 GSH를 사용하여 과산화물을 제거하는 주요 항산화 효소입니다. GSH는 GPx와 함께 다양한 산화 제품을 해독할 수 있습니다. MDA와 항산화 효소 수준은 ELISA 분석에서 역의 관계를 보여주었습니다. 전처리군에서 MDA의 발현은 상대적으로 낮았으나 항산화효소는 무처리군에 비해 높게 발현되었다.

이러한 결과는 벨루가 렌틸 전처리가 막 지질 과산화의 억제 및 항산화 효소의 활성화를 통해 산화 스트레스 경로를 차단함으로써 I/R에 의한 신장 손상을 감소시킬 수 있음을 나타냅니다.

재관류는 또한 혈관 내피 세포 활성화를 유발하여 세포 표면에서 ICAM{0}} 발현을 유발합니다. 발현된 ICAM{1}}은 림프구 기능 관련 항원-1(LFA{4}})을 통해 호중구와 연결되어 호중구가 내피 세포에 부착되고 호중구 침윤 및 염증성 분비물이 분비됩니다. 호중구에 의한 사이토카인 [36]. 손상된 부위에 호중구가 나타난 후 F4/80과 대식세포의 침투가 일어난다. 대식세포는 시간과 주변 환경에 따라 전염성 M1 표현형과 항염증성 M2 표현형으로 구분됩니다. M1 대식세포는 I/R 유발 신장 손상과 관련된 염증성 사이토카인(IL{12}}, TNF- 및 IL{14}})을 분비하는 반면, M2 대식세포는 항염증성 사이토카인(TGF-, IL{ {19}} 및 IL{20}}) [37, 38]. 대식세포는 또한 CD4와 T 세포 활성화를 자극합니다. 활성화된 T 세포는 M1 대식세포 활성화를 통해 면역 반응을 증폭시키는 인터페론-(IFN-)을 합성합니다[39]. 이 연구에서 벨루가 렌틸콩 전처리군은 F4/80 + 대식세포 및 CD4 + T 세포가 신피질 영역으로 침투하는 것을 억제하여 IL{31}} , IL{32}}, 및 TNF-mRNA 및 TGF-, IL{35}} 및 IL{36}} mRNA의 향상된 발현. 이러한 결과는 벨루가 렌틸콩 전처리가 면역 세포 침투를 억제하고 염증성 사이토카인 발현을 감소시켜 염증 반응을 감소시킬 수 있음을 나타냅니다.

5. 결론

요약하면, 벨루가 렌틸 전처리군은 근위세뇨관 손상 감소, 손상 관련 분자 분비 감소, TUNEL-양성 세포 감소, 세포자멸 관련 분자 분비 감소, 미세혈관 발현 양성, 접착 마커 음성 발현, 항산화 효과, 염증 억제 억제를 보였다. 응답. 따라서 벨루가 렌틸콩 전처리는 항아폽토시스, 항염증 및 항산화 활성을 통해 I/R 유발 신장 손상에 대한 보호 효과를 발휘했습니다. 이 연구의 결과를 바탕으로 부분 신장 절제술과 같은 I/R 손상과 관련된 임상 상황에서 벨루가 렌틸 치료를 사용하여 신장 기능을 보존할 수 있습니다.

신장의 플라보노이드 보충제

데이터 가용성

데이터는 요청 시 제공됩니다.

폭로

제72회 대한비뇨기과학회 정기총회에서 원고 초록이 보고되었습니다.

이해 상충

이해 상충이 없습니다.

저자의 기여

이승욱과 천소영이 이 작업에 동등하게 기여했다.

감사의 말

본 연구는 경북대학교병원 의생명연구원 연구비 지원(2019).

1대구 42601 계명대학교 식품공학과

2대구 41940 경북대학교병원 의생명연구원

3대구 42415 영남대학교병원 실험동물연구지원팀과

4영남대학교 의과대학 내과학교실

5경북대학교 의과대학 비뇨기과학교실

6경북대학교 의과대학 병리학교실

7영남대학교 의과대학 비뇨기과학교실

참고문헌

[1] 전성훈, 김동수, 김지스 외, "신장조직 재생을 위한 비허혈성 부분신장절제법을 이용한 마우스 모델의 새로운 지느러미 슬릿 접근," 조직공학 및 재생의학, vol. 15, 아니. 4, pp. 453–466,2018.

[2] M. Agrawal 및 R. Swartz, "급성 신부전", American Family Physician, vol. 61, 아니. 7, pp. 2077–2088, 2000.

[3] KR Tuttle, "허혈성 신장병증," 신장 및 고혈압에 대한 Current Opinion in Nephrology and Hypertension, vol. 10, 아니. 2, pp. 167–173,2001.

[4] K. Singbartl 및 K. Ley, "E-selectin을 차단하여 허혈 재관류 유발 중증 급성 신부전으로부터 보호", Critical Care Medicine, vol. 28, 아니. 7, pp. 2507–2514, 2000.

[5] M. Takada, KC Nadeau, GD Shaw, KA Marquette 및 NL Tilney, "쥐 신장의 허혈/재관류 손상에서 사이토카인 접착 분자 캐스케이드. 가용성 P-셀렉틴 리간드에 의한 억제", The Journal of 임상 조사, vol. 99, 아니. 11, pp. 2682–2890, 1997.

[6] J. Niu, J. Wu, X. Li, F. Zhang, " 급성 허혈/재관류 후 마우스 신장에서 엔도텔린{1}}/엔도텔린 수용체 A와 염증 사이의 연관성," Molecular Medicine Reports, vol . 11, 아니. 5, pp. 3981–3987, 2015.

[7] L. Wang, X. Liu, H. Chen et al., "쥐의 신장 허혈/재관류 손상에 의해 유도된 세포자멸사에 대한 과산화물 II의 효과" Experimental and Therapeutic Medicine, vol. 9, 아니. 3, pp. 817–822, 2015.

[8] B. Dong, H. Zhou, C. Han 등, "허혈/재관류 유발 절단 발현은 세포자멸사를 촉진하고 신장 기능 회복을 손상시킨다: 산증 및 Gpr4의 역할", PLoS One, vol. 9, 아니. 10, 기사 e110944, 2014.

[9] DL Cruthirds, L. Novak, KM Akhi, PW Sanders, JA Thompson 및 LA MacMillan-Crow, "신장 허혈/재관류 중 산화 스트레스의 미토콘드리아 표적", Archives of biochemistry and biophysics, vol. 412, 아닙니다. 1, 27–33페이지, 2003.

[10] B. Yang, S. Jain, IZ Pawluczyk, et al., "장기간 신장 허혈/재관류 손상 및 면역억제 쥐의 염증 및 카스파제 활성화", Kidney International, vol. 68, 아니. 5, 2050–2067 페이지, 2005.

[11] HH Wu, TY Hsiao, CT Chien 및 MK Lai, "짧은 재관류에 의한 허혈성 조절은 쥐의 신장 허혈/재관류 유발 세포자멸사 및 자가포식을 약화시킵니다." Journal of biomedical science, vol. 16, 아니. 2009년 1월 1일.

[12] EM El Morsy, MA Ahmed 및 AA Ahmed, "쥐 모델에서 açai 추출물 전처리에 의한 신장 허혈/재관류 손상의 감쇠", Life sciences, vol. 123, pp. 35–42, 2015.

[13] H. Ilhan, M. Eroglu, V. Inal, et al., "고압 산소 요법은 쥐의 신장 허혈/재관류 손상에서 산화 스트레스와 조직 손상을 완화", Renal Failure, vol. 34, 아니. 10, pp. 1305–1308, 2012.

[14] H. Chen, B. Xing, X. Liu, et al., "Ozone oxidative preconditioning inhibitors inflammation and apoptosis in a rat model ofrenal ischemia/reperfusion injury", European Journal of pharmacology, vol. 581, 아닙니다. 3, pp. 306–314, 2008.

[15] BJ Xu, SH Yuan, SK Chang, "냉각기 콩과식물 및 기타 선별된 식품 콩과 식물의 페놀 성분, 항산화 능력, 색상의 비교 분석" Journal of Food Science, vol. 72, 아니. 2, pp. S167–S177, 2007.

[16] 이소, 이성, "품종별 렌즈콩 추출물의 폴리페놀 함량 및 항산화 활성," 한국식품영양학회지, vol. 45, 아니. 7, 973–979페이지, 2016.

[17] SO Lee 및 SH Lee, 2018 KFN 국제 심포지엄 및 연례 회의, pp. 7}}, 부산, 한국, 2018.

[18] EE Hesketh, A. Czopek, M. Clay, et al., "신장 허혈-재관류 손상: 손상 및 재생의 마우스 모델", JoVE(Journal of Visualized Experiments), no. 88, p. 2014년 8월 8일.

[19] Q. Wei 및 Z. Dong, "허혈성 급성 신장 손상의 마우스 모델: 기술 정보 및 트릭," American Journal of Physiology-신장 생리학, vol. 303, 아닙니다. 11, pp. F1487–F1494, 2012.

[20] JV Bonventre 및 L. Yang, "허혈성 급성 신장 손상의 세포 병태생리학," Journal of Clinical Investigation, vol. 121, 아닙니다. 11, pp. 4210–4221, 2011.