마우스에서 Cistanche Phenylethanol glycosides의 항우울제 효과 및 메커니즘에 대한 연구
Dec 17, 2024
추상적인:
이 연구는 치료 효과와 메커니즘을 조사하는 것을 목표로합니다.Cistanche Phenylethanol Glycosides(CPHGS) 마우스에서 만성 예측할 수없는 가벼운 스트레스 (CUMS)에 의해 유도 된 우울증과 같은 행동에. 마우스를 대조군, 모델 그룹, 고용량 CPHG 그룹 (700 mg/kg), 중간 용량 CPHGS 그룹 (350 mg/kg), 저용량 CPHG 그룹 (175 mg/kg) 및 플루옥세틴 그룹 (15 mg/kg)으로 무작위로 분할 하였다. 4 주간의 상응하는 약물 중재 후, 신경 행동 검사가 수행되었다; 효소-연결된 면역 흡착제 분석을 사용하여 혈청에서 신경 전달 물질의 수준을 검출하고, 해마 조직에서의 염증 인자 및 매개체의 함량을 검출 하였다. 해마 조직에서 병리학 적 변화를 관찰하기 위해 헤 마톡 실린-에오신 및 NISSL 염색을 사용 하였다. 면역 조직 화학 및 면역 형광 방법을 사용하여 마우스의 해마 조직에서 성상 세포 및 미세 아교 세포의 밀도를 분석하고, 톨-유사 수용체 4/핵 인자 κB/NOD- 유사 수용체 단백질 3 (TLR4/NF-κB/NLRP3)의 발현 수준을 분석 하였다. 결과는 CPHG가 마우스에서 우울증과 유사한 행동을 개선하고, 달콤한 물에 대한 선호도를 증가시키고, 부동 시간을 줄이고, 마우스 혈청에서 세로토닌 및 도파민 수치를 크게 향상시키는 동시에 해마에서 염증성 매개체 및 인자의 발현을 억제 할 수 있음을 보여 주었다. 면역 조직 화학적 분석은 CPHG가 해마에서 성상 세포의 밀도를 증가시키고, 미세 아교 세포의 활성화를 감소시키고, NLRP3 염증 관련 단백질의 발현을 억제 할 수 있음을 나타냈다. 면역 형광 실험은 CPHG가 염증성 형성을 감소시키는 메커니즘이 해마 조직에서 TLR4/NF-κB 신호 전달 경로의 활성화를 감소시킴으로써임을 입증 하였다. 요약하면, CPHG는 상당한 항우울제 효과를 나타낸다행동과 같은 Cums에 의한 우울증, 잠재적으로 신경 전달 물질 수준의 조절 및 신경 염증 반응의 억제를 통해 우울증 치료에서의 적용에 대한 실험적 증거를 제공한다.
핵심 단어 : Cistanche Phenylethanol Glycosides; 우울증; 신경 염증 반응; 성상 세포; TLR4/NFκB/NLRP3 경로
우울증은 기분이 낮고 무시대, 느린 사고 및 생리적 기능 장애와 같은 증상이 특징 인 일반적이고 복잡한 정서적 정신 장애입니다. 심각한 경우 자살 경향이 발생할 수도 있습니다 [1]. "중국 거주자의 영양 및 만성 질환 상태에 관한 보고서 (2020)"에 따르면, 우리 나라의 우울증 유병률은 2.1%에 도달했으며 세계 보건기구 (WHO)에 의해 세계에서 장애가 가장 높은 질병 중 하나로 상장되었습니다 [2]. 우울증의 발병 기전은 매우 복잡하기 때문에 특정 메커니즘은 현재까지 불분명하여 치료에 큰 도전을 제기합니다. 최근 몇 년 동안 국내 및 외국 학자들은 우울증이 면역 염증 활성화와 밀접한 관련이있을 수 있음을 발견했습니다. 중추 신경계에서의 염증 반응 활성화 과정에서, 해마 염증 세포의 활성화는 그 특징적인 증상이다. 지속적으로 활성화 된 해마 염증 세포는 다수의 염증성 사이토 카인의 방출을 유도하여 염증성 사이토 카인 "캐스케이드 효과"를 형성하여 우울증과 같은 정신 질환의 병인 및 병리학 적 과정에 참여한다 [3]. 현재,이 질환의 치료는 주로 플루옥세틴, 벤라 팩신, 둘록세틴 등과 같은 서양 의학에 의존합니다. 그러나 임상 치료율이 낮고, 두드러진 잔류 증상, 높은 재발률, 장기 기능 장애를 유발할 수있는 것과 같은 단점이 있습니다. 이는 임상 적용을 제한합니다 [4]. 전통적인 한약은 감정적 질병 치료에 더 많은 목표와 부작용이 적으며 우울증 치료와 그 합병증에 대한 광범위한 적용 전망이 있습니다 [5].
Cistanche DeserticolaCistanche Deserticola ycma의 인 잎과 Cistanche tubulosa (Schenk) 와이트의 인 잎이있는 말린 다육 줄기는 오로 차이아 세 가족의 식물입니다. 좋은 음식 및 의약품입니다. 현대의 약리학 적 연구에 따르면 Cistanche Deserticola는 신경 보호 효과가 있음을 확인했습니다 (알츠하이머 병, 파킨슨 병 등을 억제 할 수 있습니다). Cistanche Deserticola의 페닐 에탄올 글리코 사이드로 구성된 "Cistanche Total Glycosides"캡슐은 신경계 질환의 치료에 널리 사용됩니다 [6]. 페닐 에탄올 글리코 사이드 (CPHG)는 시스 치치 총 글리코 사이드에서 중요한 활성 성분이다. 그들은 항 종양, 면역 조절 및 항산화 제와 같은 여러 생물학적 기능을 가지고 있으며 좋은 적용 전망을 보여줍니다 [7]. 이전의 연구는 CPHG가 모노 아민의 효과를 보호하고 striatum에서 실질 Nigra 및 도파민 (DA)의 함량을 증가시킴으로써 모노 아민의 효과를 보호하고 우울 증상을 완화시킬 수 있음을 보여 주었다 [8]; 또한 뇌의 모노 아민 신경 전달 물질의 수준을 개선함으로써 주변 종족 증후군으로 마우스의 우울한 행동을 조정할 수있다 [9]. 그러나, 만성적 인 예측할 수없는 경미한 스트레스 (CUMS)-유도 된 마우스 우울증 모델을 치료하는 데 사용되는 것에 대한보고는 없으며, 그 작용 메커니즘은 여전히 설명되어야한다. 이전의 연구를 기반으로하고 항산화 스트레스에서 CPHG의 현재 전위와 결합하여 신경 염증을 조절하고 신경 염증을 조절하고 신경 아 pop 토 시스를 억제하는이 연구는 CPHGS에 의한 마우스 우울증 모델을 사용하여 CPHGS의 항우울제 효과 및 TLR4/NF-날/NLRP3 경로의 작용 메커니즘을 연구하고, 신경 플래핑을 위해 추가로 표현하고, Explamental Matheral, Explational Matheral, Explating Explormational, Explating Explermatement, Explermational of Explermation, Explermental of Explermation, Explormational of Absion의 메커니즘을 연구했습니다. CPHG의 항우울제 효과, 임상 적용을 확장하고, 건강 식품으로 개발하고 활용합니다.
1 재료 및 방법
1.1 재료 및 기기
CPHGS 추출물 (추출물에서 페닐 에탄올 글리코 시드에서 85%이상 또는 동일한 85%, 40%이상 또는 동일, 16%보다 큰 베르 바스코 시드; 배치 수 : 20231221, Xinjiang Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd.); 플루옥세틴 히드로 클로라이드 캡슐 (Fluoxetine, FLX) (배치 번호 : 8533C, Patheon France Pharmaceutical Company, 프랑스); 5- Hydroxytryptamine (5- ht), DA 탐지 키트 (배치 번호 : 20240305, 20240305, Shanghai Future Industrial Co., Ltd.); 유도 성 산화 질소 신타 제 (INOS), Cyclooxygenase -2 (Cyclooxygenase -2, cox -2), 프로스타글란딘 E2 (프로스타글란딘 E2, PGE2), 종양 네크로스 인자 알파 (Tumor Necrosis Alpha, Tnnf-kin 1). (interleukin -1, il -1), il {-18 (interleukin -18, il -18), il -6 (Interleukin 6, il {{24}), interferon-(interferon-) 효소-연결 면역 흡착제 분석 키트 (배치 번호 : ER050A332132, ER035PD09812, ER048H753146, ER10X6398452, ER051H648219, ER09X2865471, ER049H746823, ER049H7463, ER049H7463, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); 이온화 된 칼슘-결합 어댑터 분자 1 (이온화 된 칼슘-결합 어댑터 분자 1, IBA -1) 단일 클론 항체, 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 모노클로 날 항체, NOD NOD- 유사 수용체 단백질 3 (NLRP3) 모노 클론 항체 (Batch No. {53)} gr 3379124-30, gr 3285067-28, Abcam, UK); 톨-유사 수용체 4 (TLR4) 모노클로 날 항체, 인산화 된 핵 인자 -κB P65 (포스 포-핵 인자 -κB P65, P-NF-κB P65) 모노클로 날 항체 (Batch No. 10032512, 00128965, Wuhan Sanying Biotechnology Co., Ltd.); 4% Paraformaldehyde, 면역 형광 염색 키트 (Batch No. 20240106, 20240315, Shanghai Bio-Technology Co., Ltd.); 헤 마톡 실린 및 에오신 (헥사) 에오신, HE) 염색 키트, NISSL 염색 키트 (배치 번호 : 20240401, 20240402, 리아온 링 Meilun 생물학); 면역 조직 화학 범용 키트 (배치 번호 : 43731A, 베이징 곤 산 Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.).
me2 0 4e 1/10, 000 전자 균형 (Mettler Toledo, USA); Milli-Q 실험실 Pure Water System (Merck, Germany); Spectramax ID3 다기능 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Devices, USA); LEICADM 2000 형광 업 똑바로 현미경 (Leica, Germany); 63008 Open Field, 63010 Extated Plus Maze, 63022 강제 수영, DB001 Morris Water Maze, Smart 3.0 동물 행동 비디오 분석 시스템 (Shenzhen Ruiwode Life Science Technology Co., Ltd.).
60 SPF C57BL/6 마우스, 무게는 18-22 g, Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. (Beijing) 2020-0033, 실험 동물 사용 면허 번호 Syxk (Beijing) {5})에서 구입했습니다.
마우스를 SPF 환경에 보관하고, 주변 온도가 (21 ± 2) 정도로 제어되고 습도는 60% ± 10%로 유지되었고 12 시간 경고 주기로 유지되었다. 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수 있었고, 실험은 1 주간의 적응 형 공급 후에 시작되었습니다. 실험 동물은 Shaanxi University of Chinese Medicine의 실험 동물 센터에 보관되었습니다. 이 연구의 모든 마우스 실험 절차는 Shaanxi University of Hinese Medicine (SucMDL20231015003)의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1.2 실험 방법
1.2.1 그룹화, 모델링 및 약국
7- 7- 주령 SPF C57BL/6 마우스의 1 주일 후, 후속 실험의 요구 사항을 충족시키는 비 탄성 마우스를 설탕 물 선호도 테스트를 통해 스크리닝하고, 대조군 (CON), 모델 그룹 (CPHGS) (700 MG/KG), 중간 CPH/KG)로 무작위로 나뉘어졌다. (CPHGS-M; 350 mg/kg), 저용량 CPHG 그룹 (CPHGSL; 175 mg/kg) 및 플루옥세틴 그룹 (FLX; 15 mg/kg), 각 그룹에서 10 마리의 마우스를 갖는 (Flx; 15 mg/kg). CON을 제외하고, 다른 그룹의 마우스는 4 주 동안 CUMS 스트레스를 받기 시작했다 [10]. 구속 (1 시간), 흔들림 (1 시간), 꼬리 서스펜션 (1 시간), 45-도 케이지 틸트 (24 시간), 습식 침구 (24 시간), 빈 케이지 (24 시간), 야간 조명 (12 시간), 5 분 동안 41도 뜨거운 물 수영, 5 분 동안 4도에 수영을하는 등 총 10 개의 스트레스 요인이 사용되었습니다. 두 개의 자극이 매일 무작위로 선택되었으며, 동일한 자극은 2 일 연속으로 나타나지 않았습니다. 4 주간의 모델링 후, CPHGS-H, CPHGS-M 및 CPHGS-L 마우스를 체중에 따라 GAVAGE에 의해 상응하는 CPHGS 용량을 제공하고, FLX 마우스는 GAVAGE (10 mg/kg)에 의해 플루옥세틴을 제공 하였다. 마우스에서 CPHGS-M 및 FLX의 용량은 성인과 마우스 사이의 동등한 신체 표면적 계수에 따라 전환되었고, 2 배의 변동은 저용량 및 고용량의 CPHG였다. CON 및 MOD 마우스에 위관에 의해 동일한 부피의 탈 이온수를 제공 하였다. 마우스를 하루에 한 번 4 주 동안 동행 하였다. 신경 행동 검사는 8 주일에 수행되었습니다.
1.2.2 신경 행동 실험
1.2.2.1 설탕 물 선호도 실험
자당 선호 테스트 (SPT) 전에 마우스는 단일 케이지에 보관 한 다음 3 일 동안 설탕 물에 적응해야합니다. 첫날, 1%의 자당 물 2 병이 24 시간 동안 주어졌으며, 둘째 날에는 설탕 물 한 병과 탈 이온수 한 병을 24 시간 동안 주었다. 셋째 날, 설탕 물과 순수한 물의 위치는 24 시간 동안 교환되었고, 실험은 24 시간 후에 끝났다. 넷째 날, 마우스를 금식하고 24 시간 동안 물을 박탈 당했다. 다섯째 날, 무게의 한 병과 1 병의 순수한 물 한 병이 주어졌고, 12 시간 후에 위치를 교환했습니다. 24 시간 후, 두 병을 꺼내고 다시 무게를 측정하고 설탕 물 소비 속도를 계산했습니다 (설탕 물 소비율=설탕 물 소비/(설탕 물 소비 + 물 소비) × 100%).
1.2.2.2 열린 현장 테스트
개방형 필드 테스트 (OFT)는 50cm × 50cm × 50cm 큐브 오픈 박스로 수행되었습니다. 상자의 중앙은 측면 길이가 25cm 인 사각형으로 정의되었습니다. 마우스를 상자의 중앙에 놓고 5 분 동안 적응시켰다. 마우스의 운동 궤적을 지난 5 분 동안 분석 하였다. 평가 지표에는 개방형 필드에서 마우스의 총 이동 거리, 개방형 필드 중심의 활동 시간 및 중심에 입력 한 횟수가 포함되었습니다. 1.2.2.3 테일 서스펜션 테스트 테일 서스펜션 테스트 (TST)는 꼬리로 마우스를 매달아 머리가지면에서 일정 거리에 있도록해야합니다. 6 분 이내에 마우스의 투쟁을 기록하고, 지난 4 분 동안 마우스의 부동성 시간을 분석 하였다.
1.2.2.4 강제 수영 시험
강제 수영 시험 (FST)은 마우스를 (25 ± 2) 정도의 물로 채워진 투명한 원통형 배럴 (직경 50cm 높이)에 배치하고 수위는 20cm에 도달하는 것입니다. 6 분 이내에 물에서 마우스의 고군분투를 기록하고, 지난 4 분 동안 마우스의 부동 시간을 분석 하였다.
1.2.3 샘플 수집
8 주가 끝날 무렵, 펜토 바르 비탈 나트륨 (3%, 10 mL/kg)의 복강 내 주사에 의해 마우스를 깊이 마취시켰다. 마취 후, 마취 상태는 느린 호흡, 근육 이완 및 수술 수술에 대한 반응을 관찰함으로써 확인되었다. 이어서, 마우스의 혈액을 눈 제거에 의해 수집하고, 자궁 경부 탈구에 의해 생쥐를 죽였다. 심장은 식염수로 관류 한 다음 뇌가 빨리 열리고 온전한 뇌가 제거되었습니다. 그것은 사전 냉각 식염수로 헹구고, 그 중 절반은 4% 파라 포름 알데히드로 72 시간 동안 고정시켰다; 나머지 절반의 해마 조직을 얼음상에서 분리하고 나중에 사용하기 위해 액체 질소에 저장 하였다. 10mg의 마우스 해마 조직 샘플을 복용하고, 사전 냉각 된 생리 식염수를 질량-볼륨 비율로 1 : 9의 질량 비율로 첨가하고, 얼음수 욕조에서 기계적으로 균질화하십시오. 균질화 후, 4 000 r/min에서 원심 분리기 (원심 분리 반경 4.5 cm), 상청액을 수집하여 검출.
1.2.4 신경 전달 물질 지수의 결정
적절한 양의 마우스 혈청 및 해마 조직 균질 물 상청액을 복용하고 키트 작동 방법에 따라 5- HT 및 DA 함량의 함량을 감지하십시오.
1.2.5 해마 조직 생화학 지수의 결정
해마 조직 균질 물의 상청액을 가져 와서 BCA 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오. 키트 지침에 따르면, 염증 매개체 (INOS, COX -2 및 PGE2) 및 염증 인자 (TNF, IL -1, IL -18, IL {4}}, Ifn- homegate의 감독자가 HIPPCAMPAL OCOMEGE의 감독 적으로 결정합니다. 마커 및 각 물질의 함량을 계산하고 데이터를 기록하고 통계적으로 분석합니다.
1.2.6 그는 해마 조직의 염색
72 시간 이상 고정 된 전체 뇌 조직 샘플을 취하고 파라핀 섹션을 4 μm의 두께로 만들었다. 자일 렌으로 이완 된 후, 샘플을 구배 에탄올로 수화시켰다 (각각 5 분 동안 100% 에탄올 I 및 II에 2 분 동안 95%, 90%, 80% 및 70% 에탄올에 2 분 동안 2 분 동안 3 회 세척하고, 5 분 동안 에오신으로 스테이 팅 된 5 분 동안 탭으로 헹구었다. 2 초 동안의 산 에탄올 및 수돗물에서 10 분 동안 헹구었다. 구배 에탄올 (2 분 동안 80% 에탄올, 2 분 동안 95% 에탄올, 에탄올 I 및 100% 에탄올 II 및 100% 에탄올 II를 각각 5 분 동안 탈수 시켰으며, 자일 렌으로 투명하고, 중성 껌으로 밀봉하고 공기 건조시켰다. 각 마우스 그룹에서 해마 조직 세포의 형태 학적 변화는 현미경하에 관찰되었다.
1.2.7 해마 조직의 NISSL 염색
"1.2.5"하에서 제조 된 파라핀 섹션을 탈 웬트 화하고 수화시킨 후, 10 분 동안 NISSL 염색 용액으로 염색하고, 매번 3 분 동안 증류수로 2 회 세척하고, 구배 에탄올 (2 분 동안 80% 에탄올, 2 분 동안 95% 에탄올 I 및 5 분 동안 100% 에탄올 II)로 탈수 된 XYLEN 및 밀폐형 및 밀폐형 및 밀폐형 및 밀폐. 각 마우스 그룹에서 해마 조직 세포의 형태 학적 변화는 현미경하에 관찰되었다.
1.2.8 해마 조직의 면역 조직 화학
파라핀-매장 된 해마 조직 시편은 보편적 면역 조직 화학 키트의 지시에 따라 면역 조직 화학 (IHC) 염색에 의해 처리되었다. 탈 왁스, 수화, 항원 복구, 퍼 옥시 다제 차단 및 차단 후, IBA -1 (1 : 400), GFAP (1 : 400), LRP31 : 300) 및 CaspSAE1 (1 : 400) 1 차 항체를 첨가하고 밤새 4도에 배양 하였다. DAB 색상 발달, 핵 염색, 탈수 및 밀봉, IBA1, GFAP, NLRP3 및 Caspsae의 양성 발현이 광학 현미경 하에서 관찰되었고 이미지를 이미지 J에 의해 분석 하였다.
1.2.9 해마 조직의 면역 형광 검출
파라핀-매립 한 해마 조직 시편은 면역 형광 키트의 지시에 따라 면역 형광 염색에 의해 처리되었다. "1.2.5"하에서 제조 된 파라핀 섹션을 탈 웨축, 수화, 항원 복구 및 차단 된 다음 TLR4 (1 : 400) 및 P-NF-κB P65 (1 : 200) 1 차 항체를 섹션에 첨가하고 4도에서 밤새 인큐베이션 하였다. 1 차 항체를 다음날 제거하고, PBS로 3 회 세척하고, 2 차 항체 (1 : 500)를 첨가하고 어둠 속에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세 번 세척 한 후, 섹션을 DAPI를 포함하는 고정 제로 밀봉 하였다. 해마 조직 영역의 형광 신호는 형광 현미경에 의해 관찰되었고 이미지는 이미지 J에 의해 분석되었다.
1.3 데이터 처리
실험 데이터는 통계 소프트웨어 SPS 26을 사용하여 통계적으로 분석되었습니다. 0 및 GraphPad Prism 9. 0. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (x ± S)로 표현되었고, 일원 분산 분석을 사용하여 분석을 수행 하였다. 두 그룹 간의 비교는 Dunnett의 테스트를 사용하여 수행되었습니다. 피<0.05 indicated that the difference was statistically significant.
