비만 지방세포 비대 및 혈관 내피 기능 장애에 대한 링곤베리(Vaccinium Vitis-idaea L.) 폴리페놀의 ROS 조절 효과 파트 1
Apr 28, 2022
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추상적인:비대해진 지방 조직에 수반되는 산화 스트레스와 조절되지 않은 아디포사이토카인 분비는 만성 염증을 유발하여 혈관 내피 기능 장애를 유발합니다. 본 연구에서는 3T3-L1 지방세포와 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용하여 링곤베리 과일의 안토시아닌(ACN) 및 비-안토시아닌 폴리페놀(PP) 분획이 지방 조직 비대 및 내피 기능 장애를 완화하는 능력을 조사했습니다. 이 연구는 PP 분획이 항산화 효소 발현(SOD2)을 강화하고 산화 효소 발현(NOX4, iNOS)을 억제함으로써 비대화된 지방세포에서 세포 내 ROS 생성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 또한, PP 및 ACN 분획은 aP2, FAS 및 DAGT1과 같은 지방 생성 유전자의 발현의 하향 조절과 함께 지방 세포의 트리글리세리드 함량을 감소시켰다. 두 분획을 사용한 처리는 비대화된 지방세포에서 주요 아디포카인의 mRNA 발현 및 단백질 분비를 조절했습니다. 렙틴과 아디포넥틴의 발현과 분비는 각각 하향 및 상향 조절되었다. 또한 PP 및 ACN 분획은 염증 유발 유전자(IL{12}}, IL{13}}) 및 접착 분자(VCAM-1)의 발현을 억제하여 TNF 유도 HUVEC에서 염증 반응을 완화했습니다. 14}}, ICAM{15}}, SELE). 얻어진 결과는 폴리페놀이 풍부한 링곤베리 과일을 섭취하면 항산화 및 항염 작용으로 인해 비만과 내피 기능 장애를 예방하고 치료하는 데 도움이 될 수 있음을 시사합니다.
키워드:폴리페놀; 안토시아닌;링곤베리; 항산화 잠재력; 항비만; 항염증;시스탄체 튜불로사 추출물;3T3-L1 지방세포; 비대;아디포킨; 내피 기능 장애
1. 소개
비만은 심혈관 질환의 독립적인 위험인자이며 성인과 어린이 모두에서 이상지질혈증, 인슐린 저항성, 고혈압 및 죽상동맥경화증의 위험 증가의 주요 원인 중 하나입니다[1]. 비만의 경우, 비대된 지방세포에 과도한 지방 축적에 의한 백색 지방 조직(WAT)이 기능 장애를 일으켜 만성 염증, 산화 스트레스 및 제2형 당뇨병의 원인이 되는 아디포카인 분비 조절 장애를 일으키며 또한 관상 동맥 내피 기능 장애와 독립적으로 연관됩니다[2 ,삼]. 비대 지방 세포는 긍정적인 에너지 균형, 당뇨병 및 심장 대사 질환을 연결하는 필수 요소입니다[2]. WAT는 내분비 기관으로 작용하며 분비된 아디포카인 및 사이토카인을 통해 내장 또는 피하 WAT와 심혈관 조직 간의 누화를 중재합니다.cistanche tubulosa 레딧렙틴, 아디포넥틴 및 레지스틴과 같은 아디포카인, 사이토카인, TNF-, IL-1, IL{2}}, IL-8, MCP{4}}, 활성산소 및 질소종( ROS 및 RNS)는 직간접적 기전을 통해 내피 기능 장애 발달에 영향을 미칩니다[4]. 또한, 주로 비만인의 혈관주위 지방 조직(PVAT)은 국소 염증 및 내피 기능 손상을 촉진합니다.
PVAT는 아디포카인, ROS 및 산화질소(NO)와 같은 혈관 활성 화합물을 생성하여 혈관 항상성에 기여합니다. 광범위한 생리 활성 분자를 분비함으로써 PVAT는 혈관 평활근 세포 수축, 증식 및 이동에 영향을 미칩니다[4].
Cistanche는 면역력을 향상시킬 수 있습니다
혈관계의 내벽을 따라 늘어선 내피 세포는 항상성 기능을 조절하며, 이들의 기능 장애는 동맥경화 및 심혈관 질환의 조기 예측인자입니다[5]. 산화 스트레스는 내피 세포 활성화에 기여하여 접착, 침투 및 면역 세포 활성화를 촉진하여 혈관계에서 낮은 등급의 염증 표현형을 유발합니다[5,6]. ROS는 NO의 향상된 분해를 통해 내피 의존성 혈관 이완을 변경할 수 있습니다[6]. 내피 기능 장애는 역전될 수 있으며, 이는 죽상동맥경화증의 진행을 지연시키거나 심지어 예방하고 동맥 기능을 개선하며 심혈관 사건의 발병률을 감소시킬 수 있습니다 I5]. 최근의 임상 연구에서는 비만과 인슐린 저항성을 표적으로 하는 비약리 및 약리 요법이 내피 기능을 개선하고 저급 염증을 감소시키는 것으로 나타났습니다[7]. 이러한 발견은 비만, 인슐린 저항성 및 내피 기능 장애 사이의 연관성을 보여주었습니다. 따라서 비만에서 병리학적 지방세포 기능을 감소시키는 것이 심혈관 질환 예방의 목표가 되어야 합니다. 비대 지방 조직에서 산화 스트레스와 염증을 감소시키는 치료 및 영양 전략은 심혈관 질환을 예방하는 주요 표적이 될 수 있습니다[7].
베리는 플라보놀, 페놀산, 안토시아닌과 같은 폴리페놀의 풍부한 공급원이며 역학 연구에 따르면 베리 과일 섭취 증가와 비만 감소 및 심혈관 질환 사이의 연관성이 보고되었습니다. 베리 과일은 천연 항산화제로 알려져 있으며, 항산화 능력이 높아 천연 기능성 식품으로 점점 더 많이 언급되고 있습니다[9]. 링곤베리는 비타민 C, A, E(토코페롤) 및 폴리페놀과 같은 항산화제가 특히 풍부한 "수퍼프루트"로 분류됩니다[10]. 시험관 내 및 생체 내 연구에서 항염증제[11], 항산화제[11] 및 항증식 활성[8,9]과 같은 링곤베리의 다양한 건강상의 유익한 효과가 나타났습니다. 또한, 링곤베리는 당뇨병 동물의 식이 유발 비만과 저급 염증을 예방하는 것으로 나타났습니다[12]. 우리의 이전 연구는 동결 건조 링곤베리 과일의 수성 추출물의 항염 가능성을 보여주었습니다[11]. 추출물은 염증이 있는 TNF에서 전염증(IL{15}}, MCP{16}} 및 IL{17}}) 및 항염증(IL{19}}) 유전자 발현을 조절했습니다.{20} }3T3-L1 지방세포를 유도하고 염증유발 매개체(TNF-, IL{28}}, IL{29}}, MCP{30 }}, iNOS, COX-2). 또한, 링곤베리 열매 추출물을 처리한 염증 지방세포에서 유의한 항산화 효과가 관찰되었습니다. 세포 내 ROS 축적은 항산화 방어 효소(SOD, catalase, GPx)의 발현 증가와 억제된 산화촉진 효소(NADPH oxidase 4)의 결과로 감소했습니다[11].
본 연구는 체외 모델에서 모방된 비대 비만 및 내피 기능 장애를 예방 및 치료하는 링곤베리 과일 안토시아닌(ACN) 분획 및 비-안토시아닌 폴리페놀(PP) 분획 능력을 조사했습니다. 산화 스트레스, 염증 및 조절되지 않은 아디포카인 분비의 분자 경로에 대한 ACN 및 PP 분획의 효과는 비만 비대 3T3-L1 지방세포에서 분석되었습니다. 내피 기능 장애에 대한 보호 가능성은 TNF-x로 유도된 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용하여 평가되었습니다.
2. 재료 및 방법
2.1.안토시아닌 및 비안토시아닌 폴리페놀 분획의 제조
DANEX 사(PHU"DANEX", Wielen, Poland)로부터 입수한 냉동 링곤베리(Vaccinium Vitis-idea L.) 과일을 과일 펄프로 균질화한 후,{1}}도에서 냉동하고 동결 건조했습니다. 앞서 설명한 절차에 따라 [11]. 과일 분말을 0.75%(v/v)아세트산 수용액에 현탁시켰다. 고형분(g)과 추출제(mL)의 비율은 1:10이었다. 30초 동안 볼텍스 믹서에서 혼합한 후, 현탁액을 음욕조에 넣었다(5분, 20도). 다시, 추출 혼합물을 볼텍스 믹서에서 30초 동안 교반하고 20도에서 방치하였다.
10분 후 시료를 3600×g(10분, 20도)에서 원심분리하여 상층액을 채취하였다. 새로운 추출제를 나머지 고형물에 부어 두 번째 추출 단계를 시작했습니다. 두 번째 단계의 절차는 첫 번째 단계와 동일했습니다. 두 단계의 추출물을 합하고 12,{5}}×g에서 원심분리하여 작은 과일 잔류물을 제거했습니다.
분획 준비의 다음 단계에서는 추출물에서 당과 유기산을 제거하였다. XK 26/20 유리 컬럼(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)이 장착된 AKTA Explorer 100 Air(GE Healthcare, Chicago, IL, USA) 크로마토그래피 시스템으로 분리를 수행했습니다. ). 컬럼은 40mL의 Amberlite XAD{4}} HP 거대 다공성 흡착제 수지(DuPont, Wilmington, DE, USA)로 채워졌습니다. 컬럼에 감염시키기 전에 용액(추출 단계에서 얻은 추출물 50ml)을 유리 섬유 프리필터(Merck Millipore, Burlington, MA, USA). A-5%(v/o) 포름산, B-메탄올 및 C-0.1%(u/o) 포름산의 세 가지 용리액을 적용했습니다. 적절한 양의 포름산을 탈이온수와 혼합하여 포름산 용액을 제조하였다. 용리액 유속을 5mL/분으로 조정했습니다. 분리하는 동안 다음 크로마토그래피 프로그램이 사용되었습니다. 컬럼 평형: 95% A, 5% B, 3 CV(컬럼 부피); 추출물의 샘플 주입{16}} mL; 비결합 물질 세척{17}}:100% C,6 CV;비결합 물질 세척-2:100% A,1 CV;용출:20% A,80% B,5 CV;컬럼 세척: 100% B, 2.5 CV.
흡광도(λ{0}}, 320 및 520 nm에서 모니터링됨)를 나타내는 용리 단계의 전체 유출물을 회전 증발기(Laborota 4003 HB control, Heidolph, 독일). 고형물을 0.75%(o/o) 아세트산 수용액에 녹인 후 유리 바이알에 옮겨 -85도에서 동결시킨 후 동결건조기 Beta {{8 }}(Martin Christ, Germany). 동결건조는 48시간 동안 진행하였으며, 실제 건조는 10Pa의 압력하에서 40시간(선반온도 -15도에서 20시간, 상온에서 20시간) 동안 진행하였다. 15도 ). 최종 건조는 압력 조절 없이 22도의 온도에서 8시간 동안 수행되었으며, 고형 제제는 -85 C의 질소 분위기에서 밀폐된 바이알에 보관되었습니다.
바이알 고형물을 5% (o/o) 포름산 수용액에 용해시키고 0.{2}}μm 공극 크기 필터(Merck Millipore)를 사용하여 여과했습니다. UV/VIS 검출기와 Agilent Zorbax SB C18 컬럼(250×21.2mm)이 장착된 AKTA Explorer 100 Air 크로마토그래프를 사용하여 샘플에서 다른 폴리페놀 화합물로부터 안토시아닌을 분리했습니다. 분리는 20도에서 수행하였다. 액상의 유속은 21mL/분이었다. 두 가지 용리액이 적용되었습니다. 물 중 A{10}} 퍼센트(v/v) 포름산 및 B-메탄올. 컬럼 평형화(95% A, 5% B,3 CV) 및 2mL 부피의 샘플 주입 후 복잡한 구배에서 분리를 수행했습니다. 기울기 프로그램은 5% B-0.5 CV, 20% B{20}} CV, 20% B-1.2 CV, 30% B-3였습니다. 5 CV;30% B-1.2CV;45% B-3.5 CV;45% B-1.2CV;100% B-2.5 CV;100 퍼센트 B-2.5 CV. λ=520 nm에서 흡광도가 있는 유출물을 수집하고 안토시아닌(ACN) 분획으로 표시했습니다. 入{43}} nm에서 흡광도를 나타내는 유출도 모아서 비-안토시아닌 폴리페놀 분획(PP)으로 표시하였다. 두 분획을 모두 증발시키고, 아세트산 수용액에 용해시키고, 동결 건조시키고, 상기 기재된 바와 같이 저장하였다. ACN 및 PP 분획을 준비하는 데 사용된 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich(Merck Group, Poznan, Poland)에서 구입했습니다.
2.2. ACN 및 PP 분획에서 폴리페놀 식별 및 정량화
ACN 및 PP 분획의 폴리페놀 조성은 G1315D 포토다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)에서 HPLC-DAD-ESI-MS 방법으로 분석되었으며 온라인 결합 Agilent 6224 time-of-flight MS 시스템을 사용합니다. 크로마토그래피 분리는 150×2.1mm, 3-μm C18 컬럼(Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, Scotland)에서 수행되었습니다. 이전에 발표된 연구에서는 분리 조건(이동상, 기울기 용출 프로그램, 유속, 시료 주입량)에 대해 자세히 설명합니다[11].
HPLC 크로마토그램은 각각 플라반올, 하이드록시신남산 유도체, 플라보놀 및 안토시아닌을 검출하는 데 권장되는 280,325,355 및 520nm에서 기록되었습니다.
ACN 및 PP 분획의 폴리페놀 화합물은 시아니딘{0}}O-글루코사이드(안토시아닌), 카테킨((에피)카테킨 및 프로시아니딘), 4-하이드록시벤조산(하이드록시벤조산 유도체), 페룰산의 등가물로 정량화되었습니다. (페룰산 유도체), 클로로겐산(3-O-카페오일퀸산), p-쿠마르산(쿠마르산 유도체), 트리히드록시 벤조산-갈산(벤조산 및 알부틴 유도체), 케르세틴(케르세틴 배당체) . ACN 및 PP 분획의 독립적으로 제조된 용액으로부터 모든 샘플을 3중으로 주입하였다.
DAD 검출기를 통과한 후 컬럼 용출액은 양이온 및 음이온 모드에서 작동하는 전자분무 이온화(ESI) 소스가 장착된 MS 시스템으로 보내졌습니다. 이전에 발표된 기사에서는 ACN 및 PP 분획에서 페놀 화합물을 식별하는 데 사용되는 ESI-MS 매개변수를 제시합니다[11]. 기기 제어, 데이터 수집 및 분석은 MassHunter B.04.{3}} 소프트웨어(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다. Sigma-Aldrich는 HPLC/DAD/MS 분석을 위한 페놀 표준물질 및 기타 시약을 공급했습니다.
2.3. 3T3-L1 지방세포 배양 및 치료
마우스 지방전구세포 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, CL-173)에서 입수했습니다. 세포는 1{17}}%(o/o) FBS(fetal bovine serum)가 포함된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland)에서 5% CO, 분위기에서 37도에서 배양되었습니다. (Gibco, Thermo Fisher Scientific Polska, Warsaw, Poland) 보완. 3T3-L1 지방전구세포는 앞서 설명한 프로토콜에 따라 분화 과정을 거쳤습니다[11]. 지방전구세포를 2.5×1{20}}4cells/cm²의 밀도로 12-웰 플레이트에 파종하고 합류점에 도달할 때까지 배양했습니다. 그런 다음 0.25μM의 덱사메타손(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland), 0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland)이 포함된 분화 혼합물로 2일 동안 자극했습니다. 및 10% FBS가 포함된 DMEM에 1μM의 인슐린(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland)이 포함되어 있습니다. 배지는 10% FBS 및 1μM 인슐린이 보충된 DMEM으로 교체되었습니다. 2일 후, 배양 배지를 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 교체하고 12.3일째 분석까지 2-일 간격으로 새로 고쳤습니다. 5, 10 및 20ug/mL의 농도.
2.4.HUVEC 배양 및 치료
인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 ATCC(CRL{0}})에서 얻었습니다. HUVEC는 10% FBS(Gibco), 소 신경 조직의 내피 세포 성장 보충제(30ug/mL)(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland) 및 헤파린이 보충된 F{1}}Kmedium(ATCC)에서 배양되었습니다. 100ug/mL)(Sigma-Aldrich, Poznan, 폴란드). HUVEC를 쥐 꼬리 콜라겐 용액으로 코팅된 24-웰 플레이트(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland)에 6×103 cells/cm²의 밀도로 시딩했습니다. 그런 다음 HUVEC의 24-시간 배양물을 0.1, 1 및 10ug/mL 농도의 ACN 및 PP 분획에 3시간 동안 노출시킨 후 TNF-(10ng/mL)(Sigma-Aldrich, Poznan)로 처리했습니다. , 폴란드) 염증을 유도하기 위해 추가 3시간 동안.
2.5. 세포 생존력 분석
MTT(3-(4,{{7) }}디메틸티아졸-2-일)-25-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland)은 이전에 설명한 절차에 따라 수행됩니다[13]. 세포 처리에 적용된 낮은 농도의 ACN 및 PP 분획은 MTT 테스트에서 배지의 색상 및 흡광도 판독에 영향을 미치지 않았습니다.
2.6.세포내 ROS 생산의 결정
3T3-L1 지방세포의 ROS 생성은 앞서 설명한 절차에 따라 NBT(nitro blue tetrazolium) 분석을 사용하여 측정되었습니다[14]. 0.2% NBT(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland) 용액에서 90-분 인큐베이션한 후, 세포를 인산염 완충 식염수로 세척하고 메탄올로 고정했습니다. KOH 및 DMSO를 사용하여 포르마잔을 추출한 후, 620 nm에서 흡광도를 판독했습니다(Tecan Infinite M200, Tecan Group Ltd., Männedorf, Switzerland).
2.7.세포내 지질 함량 측정
비대된 지방세포의 지질 함량에 대한 PP 및 ACN 분획의 효과는 앞에서 설명한 Oil Red O(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland) 염색 방법[13]과 Adipogenesis Assay Kit( 제조업체의 지침에 따라 Sigma-Aldrich, Poznan, Poland). 세포 내 TG 함량은 효소 분석에 의해 결정되었습니다. 존재하는 TG에 상응하는 비색 생성물은 570nm에서 측정되었다. TG 농도는 TG 표준에 대해 그려진 곡선을 기반으로 계산되었습니다.
2.8.RNA 추출 및 Real-Time PCR 분석
3T3-L1 지방세포와 HUVEC를 총 RNA 분리를 위해 TRI-Reagent(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland)로 처리했습니다. 첫 번째 가닥 cDNA 합성은 제조사의 지시에 따라 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche Diagnostics, Poland)를 사용하여 1ug의 총 RNA로 수행되었습니다. 실시간 PCR 시스템(SmartCycler DX real-time PCR System Cepheid, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하여 유전자 발현 정량을 수행했습니다. 리버스 프라이머(5μM/1μL) 및 SYBR⑧ Select Master Mix(12.5μL)(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 프라이머 시퀀스는 표 S1에 나와 있습니다. PCR 사이클링 조건은 94도에서 초기 변성을 포함했습니다. 10분 후 40개의 PCR 주기(95도에서 40초, 59도에서 30초, 72도에서 30초) 상대 유전자 발현은 2-△ACT 방법을 사용하여 계산되었습니다. 전사체 수준은 -액틴으로 정규화되었습니다. 3T3-L1 지방세포의 경우 및 HUVEC의 경우 GAPDH. 상대적 mRNA 발현은 대조군(미처리) 세포와 비교하여 배수 변화로 표현되었습니다. 모든 반응은 3중으로 수행되었습니다.
2.9.아디포카인 생산의 측정
렙틴 및 아디포넥틴 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA 키트(Sigma-Aldrich, Poznan, Poland)를 사용하여 측정되었습니다. 표준품의 교정을 사용하여 정량을 수행했습니다. 각 표준 및 샘플은 3회 분석되었습니다. 분석 간 및 분석 내 변동 계수는 각각 렙틴의 경우 12.5% 및 9.3%, 아디포넥틴의 경우 11.2% 및 7.9%로 계산되었습니다.
2.10.통계분석
통계 분석은 STATISTICA 버전 13.3 소프트웨어(Stat-soft, Inc., Tulsa, OK, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 일원 분산 분석(ANOVA)과 Tukey의 사후 검정을 적용하여 여러 그룹 평균 값 간의 차이를 추정했습니다. Levene의 검정은 등분산 가정을 확인했습니다. 통계적 유의성은 p로 설정되었습니다.<>
3. 결과 및 논의
3.1.링곤베리 ACN 및 PP 분획의 폴리페놀 조성
이 연구는 링곤베리 과일에서 분리된 두 가지 폴리페놀 제제인 안토시아닌 ACN 분획과 비안토시아닌 PP 분획에 초점을 맞췄습니다. HPLC-DAD-ESI-MS 분석을 기반으로 결정된 ACN 및 PP 분획의 폴리페놀 프로파일은 표 1에 나와 있습니다. ACN 분획은 3가지 주요 안토시아닌 화합물로 구성되며, 링곤베리 열매 추출물[11]에 함유된 시아니딘 기반 유도체, 3-O-갈락토사이드(82.5%),{11}}O-아라비노사이드(13.{14}}%) 및 3-O-글루코사이드(4.5%) 포함(표 1A) .
표 1. 안토시아닌(ACN) 분획(A) 및 비-안토시아닌 폴리페놀(PP) 분획(B)에서 확인된 화합물은 링곤베리 열매에서 얻었습니다.
The purity of ACN preparation was evaluated at 97.3%; among the non-anthocyanin constituents, 1-O-Benzoyl-β-glucose was identified by HPLC-ESI-MS analysis in positive ion mode (precursor ion at m/z307.079, production at m/z 185.0432). The PP fraction contained polyphenolic compounds belonging to three predominant groups: Flavan-3-ols, hydroxycinnamic acid derivatives, and flavonols, which accounted for 40.4%, 22.8%, and 31.0%, respectively. In addition, the anthocyanin compounds' residue (5.8%)was detected in the PP fraction with cyanidin-3-O-galactoside as dominant anthocyanin, cyanidin-pentoxide, and cyanidin 3-O-(6"-acetyl)-glucoside (Table 1B), trace amounts of which have been identified previously in the original lingonberry fruit extract [11]. In the PP fraction, the following polyphenols were quantified in a significant amount (>5% ): A형 및 B형 프로시아니딘, 카테킨,3-O-카페오일퀸산, 페룰산-헥소시드, 케르세틴 및 그 유도체(3-O-갈락토시드,3-O- 아라비노푸라노사이드,{10}}O-람노사이드). 표 1B는 링곤베리 과일의 PP 분획에서 잠정적으로 확인된 모든 폴리페놀 화합물의 질량 스펙트럼 데이터를 보여줍니다.
이 기사는 Nutrients 2021, 13, 885 7에서 발췌했습니다.