살아있는 인간 사구체의 스캐닝 이온 전도도 현미경 검사

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루슬란 보호비크1,2 | 미하일로 페도리크1,2 | 엘레나 이사에바1,2 | 앤드류 셰브추크3 | 올렉 팔리긴1 | 알렉산더 스타루첸코1,4

1 의과 대학 생리학과 위스콘신, 밀워키, 위스콘신, 미국 2 세포 Membranology학과, Bogomoletz Institute of Physiology, 키예프, 우크라이나 3 임페리얼 칼리지 의학과 영국 런던, 런던 4 클레멘트 J. 자블로키 VA 의료 센터, 밀워키, 위스콘신주, 미국

대응 알렉산더 스타루첸코와 루슬란 Bohovyk, 생리학과, 위스콘신 의과 대학, 8701 워터타운 플랭크로드, 밀워키, WI 53226, 미국. 이메일: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@ gmail.com

자금 조달 정보 재향 군인 업무학과, 보조금 / 수상 번호: I01 BX004024; 국가의 심장, 폐 및 혈액 연구소, 그랜트 / 수상 번호: P01 HL116264 및 R35 HL135749; 미국 생리 학회, 보조금/수상 번호: 연구 경력 향상 상; 국립 연구소 당뇨병과 소화기 및신장질병, 교부금/수상 번호: DK126720

추상적인

Podocyte 손상은 사구체 질환의 특징, 예를 들어 초점 분절 사구체 경화증, 일반적으로 현저한 알부민뇨 및 진행과 관련이 있습니다. 신장 병리학. Podocyte 구조적 이상 및 손실은 또한 최소한과 관련이 있습니다. 질병 및 더 일반적인 변화당뇨병성 신장 질환. 여기서 우리는 신선하게 평가하기 위해 처음으로 이온 전도도 현미경 (SICM) 기술을 주사하는 것을 적용했습니다. 고립 된 인간사구체의위상수학. SICM은 평가할 수 있는 특별한 기회를 제공합니다.사구체podocytes뿐만 아니라 전자를 가진 다른 네프론 구조 세그먼트 현미경 검사 해상도이지만 라이브 샘플에서. 여기에 SICM의 적용이 표시됩니다. 살아있는 인간의 방법사구체미래를위한 원칙의 증거를 제공합니다. 살아있는 세포에서 막 형태학 및 다양한 기능적 매개 변수의 동적 분석.

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1. 소개

사구체는 네프론의 입구 부분에 위치한 모세혈관의 턱받이를 나타내며, 여기서 혈액은 선택적으로 여과됩니다. 사구체 여과 장벽은 내피 세포, 사구체 기저막 및 podocytes로 구성됩니다. 기본 및 보조 인접한 podocytes의 과정은 서로 얽혀있어 사구체 모세 혈관을 단단히 덮는 슬릿 횡격막을 만듭니다. 이 다이어프램에는 복잡한 형태학이며 혈액 여과를위한 최종 장벽을 형성합니다. 크기 선택성에 기여하고 알부민보다 작은 분자에 대한 투과성을 허용합니다. podocyte 수의 감소 및 발 과정 유출은 초점 분절 사구체 경화증, 최소 변화 질환 및 당뇨병 성 신증에서보고되었습니다.1-3 또한, podocytes의 손실과 그들의 구조의 변형은 의 초기 단계에서 분명신장그들의 진행을 약화 / 악화시킬 수있는 질병. 세포의 고해상도 이미징 형태학은 공부에 필수적이고 유용한 도구가되고 있습니다. 세포 구조와 세포 기능과 질병 진행에서 그들이 하는 역할.4 주사 전자 현미경 (SEM)은 널리 그러한 연구를 수행하기위한 사용 된 방법. 그래도 여러 가지가 필요합니다. 시료 준비를 위한 복잡한 절차로 인해 살아있는 표본을 분석할 수 없습니다.5 따라서 podocyte 형태학의 변화를 연구하기위한 새로운 도구를 개발할 필요가 있습니다. 라이브 샘플에서. 스캔 이온 전도도의 호핑 프로브 모드 현미경(SICM)은 복잡한 형태를 가진 살아있는 세포 표면의 고해상도, 비광학적 이미징을 가능하게 하는 기술입니다.6-8 이 방법의 가장 큰 장점은 몇 나노 미터에 가깝다는 것입니다. 공간 분해능과 적용 가능한 긴 Z(수직) 범위 생리 학적으로 복잡한 형태를 가진 샘플을 살기 위해 관련 조건. SICM은 다음과 같은 멀티모달 이미징 기술입니다. 다른 확립 된 기술과 동시에 결합 될 수 있습니다. 및 막 형태학의 동적 분석, 및 다양한 기능적 파라미터, 예컨대 세포용적, 막 전위, 단일 이온 채널 전류, 심지어 막 단백질의 역학 살아있는 세포의 복합체.9-11 여기서, 우리는 살아있는 인간의 형태를 분석하기 위해 SICM을 적용하는 예를 제공합니다.사구체구조.

시스탄체 신장 질환 증상

2. 재료 및 방법

실험을 위해, 우리는 버려진 이식 인간으로부터 피질 영역의 일부를 사용했다.신장해부되어 위스콘신에 보관됨 보존 용액에 이어 산소화된 상태에서 인큐베이션한다. 생리식염수(PSS).12 신장 사구체를 분리하였다. 앞에서 설명한 대로 진동 해리 기술을 사용합니다.13 이 접근법은 인간으로부터 잘 보존 된 신장 사구체의 신속한 분리를 가능하게합니다.신장. SICM 이미징을 수행하기 위해, 갓 격리된 인간사구체폴리-L-라이신 유리 표면에 부착되었다. PSS 용액으로 채워진 세포 챔버 내로 놓았다. 샘플은 반전된 광학 아래의 xy 방향으로 수동으로 배치합니다 현미경 니콘 TE2000-U (니콘 악기). 호핑을 위해 프로브, SICM 이미징 붕규산염 유리 나노 피펫 저항 약 120 nm 주변의 추정된 팁 직경에 해당하는 대략 100 MΩ이 사용되었다. 나노피펫을 함께 뽑아냈다. 수평 플레밍/브라운 타입 풀러 P-97 (셔터 악기, 노바토, 캘리포니아). 나노피펫을 욕조에 사용된 것과 동일한 PSS 용액으로 충전하고, 압전 액추에이터. 나노피펫을 통해 흐르는 이온 전류는 Axopatch 700B 패치-클램프 증폭기로 측정되었다. (Axon 계측기) 전압 클램프 모드에서 맞춤형 수정 범용 컨트롤러(ICAPPIC Ltd, UK)는 샘플과 피펫 포지셔닝을 동시에 제어했습니다.6 모든 실험은 실온(20-22°C)에서 수행하였다. 이미징용 podocytes 발 과정과 같은 복잡한 복잡한 구조 이사구체, 우리는 가장 백스텝 / 호핑 모드 SICM을 사용했습니다. 살아있는 세포의 지형을 고해상도로 이미징하는 데 적용 가능합니다.6,14 호핑 원리의 단일 단계는 사건으로 구성됩니다. 기준 전류가 측정되면 나노피펫을 샘플 위에 잘 위치시킴으로써 측정된다. 그런 다음 나노 피펫이 접근합니다. z축을 따라 전류가 측정될 때까지 샘플 표면까지 레벨은 ~ 1.0 % -1.2 %에 해당하는 사전 설정 설정점으로 떨어집니다. 기준 전류. 이 순간, 접근법은 종료되고, XY 및 Z 압전 액추에이터의 XYZ 좌표가 기록됩니다 첫 번째 이미징 포인트에 대한 샘플 표면 좌표로서, 피펫은 표면에서 철수됩니다. 그런 다음 이 절차는 다음에 의해 결정된 xy 축을 따라 각 단일 이미징 지점에서 반복됩니다. 사전 설정된 해상도 및 스캔 영역 범위. 그림 1B의 경우 스캔 범위 및 이미지 해상도는 30 μm × 30 μm 및 512 px × 512 px 및 도 1C는 각각 5 μm × 5 μm 및 480 px × 480 px이었다. 날것의 SICM 지형 데이터 및 이미지 후처리를 수행하였다. SICM 이미지 뷰어 현미경 분석 소프트웨어 (ICAPPIC 사용) 주식 회사, 영국).

그림 1 스캐닝 이온 전도도 현미경 영상의 적용. A, 갓 고립된 인간사구체폴리 Llysine 유리 표면에 부착. 왼쪽에는 SICM 이미징을 수행하기 위해 사구체 표면에 접근하는 마이크로피펫이 도시되어 있다. B, 예제 사구체 여과 장벽 성분, podocyte 및 발 과정을 포함하여 혈관을 덮고, SICM에 의해 시각화. 전체 면적 45분 스캔(30 × 30 μm, 해상도 512 × 512 픽셀, z축 변화 15 μm). C, 인간 podocyte 이차의 건축에 대한 확장 된 견해 발 공정은 고해상도 SIMM에 의해 밝혀졌습니다. 총 면적 스캔의 경우 12분(해상도 5 × 5μm, 해상도 480 × 480픽셀; z축 변경 3 μm). 배율 막대가 표시됩니다.

3. 결과 및 토론

SICM 이미지 품질은 SEM과 비슷하며 다음을 정확하게 검사 할 수 있습니다.사구체혈관을 포함한 표면 구조 및 podocytes, 그리고 이차 발 과정의 건축.4 안으로 우리의 이전 연구, 우리는 SICM 이미징을 사용하여 제 2 형 당뇨병 환자에서 podocyte 발 과정의 병리학 적 구조적 변화를 추정했습니다. 신병증 (T2DN) 쥐.15 우리는 비교 분석을 실시했다. podocyte 여과 장벽의 입체 구조 비 당뇨병 및 T2DN 쥐에서. 우리의 데이터는 상당한 손실을 나타냈다. 정확한 T2DN 사구체에서 podocyte 발 과정의 정확한 제공 이 쥐에서 신장뇨와 알부민뇨의 기초가되는 당뇨병성 신증에서 발생한 조직병리학적 변화에 대한 평가.15 여기에서, 처음으로, 우리는 성공적인 접근 방식을 시연했습니다. 갓 격리된 입체 표면 구조를 평가하고, 살아있는 인간 사구체. 인간 신장 사구체는 직경이 약 300 μm16인 구형 구조이고; 따라서, 피펫의 끝 관심 지역의 상단에 신중하게 접근해야합니다. 우리의 SICM 셋업은 25μm z축 및 30μm xy축 스캐너 범위× 30μm 우리가 큰 부분의 고해상도 이미지를 얻을 수있게 해주었습니다.사구체표면. 획득 시간은 스캔 범위, 해상도 및 호핑 전극 팁 크기. 갓 격리된 사구체와 같은 복잡한 구조에서 살아있는 세포 이미징의 경우, 스캐닝 시간은 프레임당 10분에서 50분까지 다양합니다(그림 범례 참조). 자세한 내용은). 고해상도의 누적 효과, 큰 스캐닝 영역 및 살아있는 시스템의 확률적 변동은 수평 및 수직 이동으로 표현되는 이미징 아티팩트를 초래할 수 있습니다. 희망하는 피펫 재배치 사이클 사이. 표면 위치의 갑작스런 변화와 함께 복잡한 형상에서 두 가지 모두 획득 시간 및 이미징 아티팩트, 어두운 픽셀 또는 나쁜 픽셀처럼, 수 있습니다 증가. SICM 지형 이미지(그림 1A)는 명확하게 보이는 1차 및 이차로 덮인 사구체 모세혈관을 보여줍니다. podocyte 발 과정. SICM을 사용하면 샘플 이미지를 얻을 수 있습니다. 나노미터 스케일에서 상이한 스캔 범위가, 충분한 분해능 레벨을 유지한다.17 도 1B는 고분해능 SICM에 의해 밝혀진 인간 podocyte 이차 발 공정의 구조를 나타낸다. 이러한 지형 이미지의 추가 분석을 연구에 사용할 수 있습니다. 병리학 적 조건 하에서 그리고 다양한 약물 적용에 반응하여 podocyte 발 과정의 형태 학적 변화.

를 조사하기 위한 SICM 기술의 적용 를 포함하는 입체 표면구조 연조직 시료사구체및 podocyte 세포는, 처음에 도입되었다. 나카지마 외4. 사용된 저자신장슬라이스는이 기술을 기존의 SEM과 비교합니다. 여기에서, 우리는이 연구를 다음과 같이 확장했습니다. 살아있는 인간 사구체. 이 접근법을 사용하여 우리는 위대한 것을 드러냈다. 의 신속하고 신뢰할 수있는 검사를위한 SICM 기술의 잠재력사구체여과 장벽. 큰 장점 중 하나 SICM의 (라이브 샘플의 사용 이외에)은 그렇지 않다는 것입니다. 일반적으로 필요한 여러 샘플 준비 절차가 필요합니다. 탈수 및 고정 용액을 포함한 EM 현미경 영상. 따라서 SICM을 사용하면 관찰 된 샘플의 수축을 피할 수 있습니다. EM은 실제 치수를 오도 할 수 있습니다. 중요 갓 격리 된 사구체에 대한 실시간 SICM은 또한 발의 동적 과정은 관심있는 약물에 대한 급성 노출에 반응하여 움직입니다. 마지막으로, SICM 피펫을 사용할 수 있습니다. 단일 채널 전류의 패치 클램프 기록을 수행합니다.18 이를 위해, 지형 지도의 재구성 후, 인수 소프트웨어 (ICAPPIC Ltd, UK)는 통제 할 수 있습니다. 챔버 표면에 SICM 유리 호핑 프로브의 브레이크, 패치 클램프 조건에 대한 미세 전극 저항 감소 (7 내지 12 MΩ) 동일한 실험에서 단일 채널 기록에 적합하게 만든다. SICM은 패치 클램프 전극이 셀 표면에서 정확한 위치에 따라 나노미터 정밀도로 잘 제어된 수직 접근 방식에 의한 지형 데이터로, 접촉 기가살을 쉽게 형성할 수 있습니다. 스마트 패치라고 불리는 세포막과 함께.19

요약하면, 여기에 설명 된 방법은 우수한 잠재력을 가지고 있습니다. 사구체 및 기타 갓 분리 된 네프론 세그먼트에 대한 연구. 또한, 인간을 사용할 수 있음을 보여준다.신장형태학을 평가하기 위한 정교한 준비가 없는 샘플 병리학 연구의 변화.

신장 질환에 대한 Cistanche

승인

저자 실험실에서의 연구는 교육부에서 자금을 지원했습니다. 재향 군인 업무 I01 BX004024, 국가 심장, 폐 및 혈액 연구소 R35 HL135749 및 P01 HL116264, 국립 연구소 당뇨병과 소화기 및신장질병 R01 DK126720, 및 미국 생리 학회 연구 경력 향상 수상.

이해 상충

Andrew Shevchuk 박사는 주주이며 컨설팅을받습니다. ICAPPIC Ltd.의 수수료 다른 모든 저자는 경쟁하지 않는다고 선언했다. 관심사

저자 기여

Ruslan Bohovyk : 개념화 (동등); 데이터 큐레이션(리드); 공식 분석 (리드); 작문 - 원본 초안 (동일); 쓰기 검토 및 편집 (동일). Mykhailo Fedoriuk : 데이터 큐레이션 (지원); 공식 분석 (지원); 쓰기 검토 및 편집 (동일). 엘레나 이사에바 : 개념화 (지원); 데이터 큐레이션 (지원); 공식 분석 (지원); 작문 - 원본 초안 (지원); 쓰기 검토 및 편집 (동일). 앤드류 셰브추크: 개념화 (지원); 소프트웨어 (지원); 원본 초안 작성 (지원); 쓰기 검토 및 편집 (동일). 올렉 팔리긴: 개념화 (동등); 공식 분석 (지원); 방법론 (지원); 프로젝트 관리 (지원); 작문 - 원본 초안 (지원); 쓰기 검토 및 편집 (동일). 알렉산더 스타루첸코: 개념화 (리드); 프로젝트 관리 (리드); 자원(리드); 감독 (리드); 작문 - 원본 초안 (동일); 쓰기 검토 및 편집 (동일).

데이터 가용성 선언문

이 연구의 결과를 뒷받침하는 데이터는 다음에서 구할 수 있습니다. 합리적인 요청에 따라 해당 저자.