종양 세포에 대한 허브 물질 Acteoside의 선택적 세포 독성과 그 기계론적 통찰력
Mar 14, 2022
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Christina Cheimonidi et al
추상적인
천연 제품은 극단적 인 구조적 다양성을 특징으로하므로 새로운 항 종양 제제의 확인을위한 독특한 출처를 제공합니다. 이하, 한방물질이 있다고 보고하고 있습니다.액테오사이드Lippia citriodora 잎에서 진보 된 식물 화학적 방법에 의해 분리되는 것은 전이성 종양 세포에 대해 향상된 세포 독성을 나타냈다; 다양한 세포독성제 및 감작된 화학저항성 암세포와 시너지 효과를 발휘하였다.액테오사이드생리적 세포 맥락에서 독성이 없는 반면, 산화 부하를 증가시키고, 단백질 분해 모듈의 활성에 영향을 미치고, 종양 세포주에서 매트릭스 메탈로프로테이나제를 억제하였다. 복강내 또는 경구(음용수를 통해) 흑색종 마우스 모델에서 액테오사이드의 투여는 종양에서 상향조절된 항산화 반응; 그러나, 복강내 전달만이 종양 성장을 억제하고 항종양 반응성 면역 반응을 유도하였다. 질량 분광분석법 식별/정량 분석은 복강내 전달이액테오사이드치료된 마우스의 혈장 및 종양에서 화합물의 농도가 경구 투여 대 유의하게 더 높은 결과를 가져왔고, 이는 그의 생체내 항종양 효과가 투여 경로 및 종양에서의 달성된 농도에 의존한다는 것을 시사한다. 마지막으로, 분자 모델링 연구 및 효소 활성 분석은액테오사이드단백질 키나아제 C. 결정적으로, 액테오사이드는 신규한 항종양제의 개발을 위한 화학적 스캐폴드로서 약속을 지킨다.
키워드:액테오사이드, 암, 천연 화합물, 산화 스트레스, 프로테오스타시스, 면역조절
1. 소개
발암은 여러 세포 신호 전달 경로의 탈조절을 특징으로하며 세포 산화, 복제, 대사, 유전 독성 및 단백질 독성 스트레스 증가와 관련이 있습니다 [1]. 이러한 스트레스 표현형을 적응시키고 극복하기 위해 악성 세포는 진행중인 스트레스를 억제하거나 (적어도) 완화시키는 것을 목표로하는 몇 가지 비 발암 경로를 상향 조절합니다 (종양 유전자와는 별도로). 종양 발생 동안 빈번하게 상향조절되는 것으로 밝혀진 다양한 비발암성 경로 중에는 세포 항산화 반응과 함께 프로테오스타시스 네트워크(PN)의 모듈이 있다[2,3].
PN의 주요 구성 요소는 두 가지 주요 분해 기계, 즉 세포 분자 샤페론의 네트워크와 함께 Autophagy-Lysosome 경로 (ALP)와 유비퀴틴 - 프로테아좀 경로 (UPP)입니다. ALP는 주로 단백질 응집체와 손상된 소기관의 분해에 관여하는 반면[4], UPP는 정상적인 수명이 짧은 단백질과 수리할 수 없는 미스폴딩 또는 전개 단백질을 분해합니다[5-8]. 상기 26Seukaryotic 프로테아좀은 19S 조절 입자(RP) 및 20 스코어 입자(CP)로부터 구성되고; 후자는 배럴과 같은 구조를 형성하는 네 개의 적층 된 헵타머 링 (α 유형의 두 개를 둘러싸고있는 β 유형의 두 개)으로 구성됩니다. 키모트립신-유사 (CT-L), 트립신 유사 (T-L), 및 카스파제-유사 (C-L) 프로테아좀 펩티다제 활성은 각각 β5, β2, 및 β1 프로테아좀 서브유닛에 위치한다[6]. 다양한 혈액학적 악성종양에 대한 프로테아좀 억제제 보르테조밉(Velcade®; PS-341이라고도 함) 및 카르피필조미브의 입증된 임상적 효능[9]은 암 치료를 위한 유망한 전략으로서 UPP를 표적화하는 "개념 증명"을 제공하였다. 발암 동안 빈번하게 상향조절되는 세포 항산화 방어 경로의 복잡한 네트워크[3,10]는 항산화 효소뿐만 아니라 세포 보호 게놈 반응을 동원하는 몇몇 전사 인자를 포함한다; 여기에는 포크 헤드 박스 O (Foxo) 및 핵 인자 에리스로이드 2 관련 인자 (Nrf-2)가 포함됩니다. Nrf-2는 항산화 및 II 상 유전자의 발현을 자극하기 때문에 산화 및 / 또는 이종 생물 적 손상으로부터 세포를 보호하는 데 중심적입니다 [11-13].
우리와 다른 사람들은 최근에 이러한 종양 의존성 (즉, 단백질 정체 모듈 및 / 또는 항산화 반응 경로)을 표적화하거나 형질전환 유전자형의 맥락에서 ROS의 세포 수준을 증가시키는 것이 종양 세포의 선택적 사멸을위한 잠재적 인 치료 창을 제공한다고 제안했다 [3,14]; 지지체에서, 세포 ROS 수준을 상향조절하는 소분자에 의한 암 세포의 선택적 사멸이 보고되었다[2]. 항종양 반응성 면역 반응의 활성화를 포함하는 조합 접근법[15]은 PN 및 항산화 반응을 억제하거나 세포 ROS 수준을 상승시킴으로써 제공되는 치료 창을 최대화할 것으로 예상된다.
다양한 공급원 (식물, 해양 생물, 미생물 등)의 천연 제품 (추출물 또는 순수 화합물) (NPs)은 극도의 구조적 다양성 및 화학적 복잡성으로 인해 항종양 제제로 작용할 수있는 능력뿐만 아니라 여러 세포 신호 전달 경로를 pleiotropically 조절하기 때문에 스크리닝됩니다 [16]. 보도에 따르면, NP는 항염증제, 항종양 및/또는 항전이성 반응을 활성화시키고 다제내성을 회피한다[18,19]. 이들 중에서도, 페놀계 화합물(페닐에타노이드 배당체 포함)은 다양한 인간 질환의 예방 및/또는 치료에서 보고된 역할 때문에 상당한 관심을 끌었다.
Acteoside, 또한 사용법 또는 verbascoside [20]라고도하며, 많은 dicotyledons에서 분리 된 페닐 에타노이드 글리코 시드입니다. 보고된 바에 따르면, 액테오사이드는 항산화, 항염증 및 세포 아폽토시스 조절 특성을 포함하는 몇 가지 흥미로운 생물학적 활성을 발휘한다[21,22]. 그럼에도 불구하고, 그것의 잠재적인 항종양 활성은 다루어지지 않았다. 우리는 여기서 acteoside가 생리적 세포 맥락에서 명백한 독성 효과없이 포유류 암 세포에 대해 증가 된 세포 독성을 나타냈다고보고합니다. 더욱이, 액테오사이드는 (다른 것들 중에서도) 항종양 반응성 면역 반응을 활성화시킴으로써, 생체내 마우스 모델에서 흑색종 종양 성장을 억제하였다.
2. 재료 및 방법
2.1. 식물 재료 및 추출
말린 Lippia citriodora (Lamiaceae) 잎 (4.5 kg)은 그리스 아테네의 현지 시장에서 구입했습니다. 잎을 분쇄하고, 메탄올 (2 × 20 L)로 12 h 동안 기계적 교반에 의해 추출하였다. 메탄올 추출물을 증발시켜 건조시키고, CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L)의 혼합물로 세척하였다. 불용성 잔류물을 분리하고 건조시켜 녹색-황색 분말(450 g)을 제조하였다.
2.2. 액테오사이드의 정제 및 UPLC-HRMS 분석
전술한 잔류물의 일부(10 g)를 고속 원심 분할 크로마토그래피(FCPC) 장치(Kromaton, France)를 사용하여 역류 크로마토그래피를 실시하였다; EtOAc/EtOH/H2O의 혼합물을 5/0.5/4.5의 비율로 이phasic 용매 시스템으로 사용하였다. 수집된 분획은 박층 크로마토그래피를 실시하였다; 그 다음 크로마토그램을 UV 램프 (254 및 365 nm) 하에서 관찰하고, 메탄올 바닐린 설페이트로 분무한 다음 2분 동안 가열하여 시각화하였다. 총 2.1 g의 액테오사이드(순도 ≥ 90%)를 전술한 공정에 의해 분리하였다. 액테오사이드의 확인은 핵 자기 공명 (NMR) 및 질량 분광법 (MS) 스펙트럼에 의해 수행되었으며, 순도는 UPLC-MS 및 NMR 분석에 의해 확립되었다. 자세한 내용은 Suppl. 재료 및 방법을 참조하십시오.
2.3. 세포주
인간 폐 배아 섬유아세포(IMR90 세포)와 B16. F1, B16. F10, YAC-1, 및 WEHI-164 마우스 세포주를 미국 조직 배양 컬렉션 (ATCC)으로부터 수득하였다. U2 OS와 Sa OS 인간 골육종 세포주는 V. Gorgoulis 교수 (그리스 아테네의 국립 및 카포 디스트리안 대학 의과 대학)에 의해 친절하게 기증되었으며, KH OS 골육종 세포와 화학 저항성 골육종 세포주 [23]는 E. Gonos 박사 (National Hellenic Research Foundation, Greece)의 기증이었다. 마우스 암 세포주 C5N 및 A5는 다단 마우스 피부 발암 모델에 속하며[24,25] A. Balmain 교수(미국 캘리포니아 대학교 종합 암 센터)에 의해 기증되었다. 사용된 세포주의 배양 조건은 Suppl. 재료 및 방법에 보고되어 있다.
의 이점시스탄체 액테오사이드
2.4. 흑색종 마우스 모델 남성
C57BL / 6 마우스 (체중 25-30g, 생후 6-8 주)는 그리스 파스퇴르 연구소에서 얻었으며 물과 음식에 자유롭게 접근 할 수있는 통제 된 온도 (22 ° C) 및 광주기 (12 시간 빛 : 12 시간 어둠)하에 보관되었습니다. 마우스를 105 B16으로 피하 접종하였다. F1 흑색종 세포 (PBS 내 100 μL)를 무작위로 3기 (n=5/군)에 할당하였다. 종양이 만져질 수있게되었을 때 (11 일째) 마우스는 두 가지 경로를 통해 액테오사이드를 받았다. 복강 내 (IP) (200 μL PBS로 희석 된 1 mg / 마우스; 격일로 총 6 회 투여) 또는 식수 (OR) (2.5 mg / 마우스, 13 일 연속 총 13 회 투여). 대조군 마우스는 PBS를 투여하였다. 종양 성장은 디지털 캘리퍼로 형성된 종양의 주요 및 부 축을 측정함으로써 2일마다 기록되었다. 측정은 하기 화학식을 사용하여 종양 부피로 형질전환되었다: 종양 용적 (cm3) = 장축 × 단축2 × 0.5. 28일째에, 동물들은 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었고, 비장은 무균적으로 제거되었다. 실험은 유사한 발견으로 세 번 반복되었다.
비장세포를 개별적으로 균질화된 비장으로부터 분리하고, 즉시 그들의 세포독성 대 B16에 대해 시험하였다. F1, YAC-1 및 WEHI-164 셀 대상. 세포독성은 이펙터 세포 탈과립화의 결과로서 세포 표면에서의 CD107 노출의 검출에 기초하여 평가되었다. 비장세포(105 세포/웰)를 5% CO2에서 37°C에서 100:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비율로 96-웰 U 바닥 마이크로플레이트에서 표적과 공동 배양하였다. FITC 컨쥬게이션된 항-CD107a 및 항-CD107b 모노클로날 항체 (25 μL/mL) 및 모넨신 (6 μL/mL; BD 바이오사이언시즈로부터의 모두)을 각 웰에 첨가하였다. 세포를 6시간 후에 수확하고 FACSCanto II 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 병행하여, 종양을 적출하고 Suppl. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 하류 분석을 위해 처리하였다.
시스탄체 액테오사이드
