추상적인
배경 AKI는 SARS-CoV-2 감염의 일반적인 후유증이며 코로나19의 중증도와 사망률에 영향을 미칩니다-19. 여기서 우리는 다음과 같은 가설을 테스트했습니다.신장 변화코로나19 관련 AKI에 의해 유발된 AKI는 소변에서 수집된 세포에서 검출될 수 있습니다. 우리는 AKI가 있거나 없는(n55) 코로나-19 입원 환자 8명과 비COVID–19 AKI 환자 4명의 소변에서 회수한 세포에 대해 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq)을 수행했습니다. (n54) AKI 동안 세포 구성과 유전자 발현의 차이를 평가합니다. 결과 30,076개의 세포를 분석한 결과 다양한 종류의 세포 유형이 밝혀졌으며, 그 중 대부분은 다음과 같습니다.신장, 요로상피세포 및 면역세포. AKI 환자의 관형 세포에 대한 경로 분석은 AKI가 없는 환자와 비교하여 손상 관련 경로와 관련된 전사물이 풍부하다는 것을 보여주었습니다. ACE2 및 TMPRSS2 발현은 회수된 세포 유형 중 요로상피 세포에서 가장 높았습니다. 특히 한 환자의 요로상피 세포에서 SARS-CoV-2 바이러스 RNA를 검출했습니다. 이러한 동일한 세포에는 항바이러스 및 항염증 경로와 관련된 전사물이 풍부해졌습니다. 결론 우리는 입원한 코로나19 환자의 요침사물에 대해 scRNAseq를 성공적으로 수행하여 AKI와 관련된 세포 변화를 비침습적으로 연구하고 손상된 신장 세포와 손상되지 않은 신장 세포를 모두 포함하는 데이터 세트를 구축했습니다. 또한, 우리는 SARS-CoV-2에 의한 방광 세포의 직접 감염에 대한 예비 증거를 제공합니다. 요침사물에는 풍부한 정보가 포함되어 있으며, 요로에서 발생하는 병태생리학 및 세포 변화를 연구하는 데 유용한 자원입니다.신장 질환.
신장 건강을 위한 유기농 건강식품
소개
중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염은 신장을 포함한 여러 시스템에 걸쳐 병리를 유발하며 AKI는 2019년 코로나바이러스 질환(COVID-19)에서 상당한 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다(1 –5). 여러 연구에 따르면 입원한 코로나19 환자 중 AKI 발생률이 높은 것으로 나타났습니다-19(6). 일부 연구에서는 감염된 개인의 최대 50%에서 AKI가 발생한다고 보고했습니다(7-9). 일차 SARS-CoV-2 수용체 ACE2는 근위 세뇨관 세포 및 요로 상피 세포를 포함하여 비뇨기 계통 전체의 상피 세포에서 발현되지만(10-13), 코로나 환자에서 AKI가 나타나는지는 확실하지 않습니다.-19 이는 근위 세뇨관의 직접적인 바이러스 감염으로 인해 발생하거나 SARS-CoV에 대한 전신 반응의 결과입니다-2(14–22). 마찬가지로, SARS-CoV-2가 요로 상피 세포의 직접적인 감염을 통해 바이러스성 방광염을 일으킬 수 있는지 여부는 불분명하지만 이러한 가능성이 제안되었습니다(23-26). 코로나19 관련 AKI의 높은 유병률에도 불구하고 AKI 환경에서 발생하는 근본적인 세포 변화는 아직 잘 알려져 있지 않습니다.
코로나19 관련 AKI는 신장 조직에 접근하려면 생검이나 사후 분석이 필요하기 때문에 크게 연구되지 않았습니다(27). 최근 연구에 따르면 소변에서 다양한 신장, 방광 및 면역 세포가 발견되었습니다(28-30). 따라서 소변은 코로나19 관련 AKI 중 신장 변화에 대한 비침습적 연구에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기서 우리는 AKI 유무에 관계없이 입원한 코로나19 환자의 소변 내 세포 다양성을 특성화하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)을 수행했습니다. 우리는 코로나19 관련 AKI의 신장 변화가 소변에서 수집된 세포에서 검출될 수 있다는 가설을 테스트했습니다. 우리는 또한 코로나-19가 없고 AKI(비COVID–19 AKI) 환자로부터 샘플을 수집했습니다. 우리는 코로나19 관련 AKI에서 여러 염증성 면역 세포 집단과 차별적으로 활성화되는 경로와 예비 증거를 발견했습니다.SARS-CoV-2에 의한 요로상피 세포의 직접적인 감염에 사용됩니다.
재료 및 방법
참가자 및 변수 18세 이상 성인은 2021년 3월부터 5월 사이에 버밍엄에 있는 앨라배마 대학교(UAB) 병원에 입원하거나 이송하는 동안 선별검사를 받았습니다. AKI 사례는신장 질환48시간 내 혈청 크레아티닌(sCr) .0.3mg/dl 또는 기준선 크레아티닌 .1.53의 상승으로 전반적인 결과 정의를 개선합니다. 크레아티닌에 변화가 없는 대조군은 가능한 경우 연령 및 성별 일치를 기준으로 선택되었으며 각각의 AKI 샘플로 처리되었습니다. 기준선 sCr은 입원 7~365일 전 가장 최근의 sCr 값을 사용하여 결정되었습니다. 인구 통계, 병력, 임상 특성 및 실험실 값에 관한 추가 임상 데이터는 UAB 임상 및 중개 과학 센터 i2b2 팀을 통해 환자 차트에서 추출되었습니다. 8명의 입원 환자(COVID-19), AKI가 있는 환자 5명, AKI가 없는 환자 3명이 포함되었습니다. 이 연구와 표본 수집은 UAB Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. UAB 급성 신장학 상담팀은 또한 코로나19 관련 AKI와 세포 변화를 비교하기 위해 비COVID-19 AKI(n54) 환자로부터 샘플을 수집했습니다. 이는 잔여 소변 샘플 수집을 허용하는 다른 기관 검토 위원회 프로토콜에 따라 수집되었으므로 익명으로 처리됩니다.
검체 수집 및 처리
모든 단계는 얼음 위에서 수행되었습니다. 소변은 배뇨된 표본이나 요로 카테터에서 수집되었습니다. 샘플은 처리를 위해 즉시 생물안전성 수준 21 실험실로 옮겨졌습니다. 소변 샘플을 50-ml 원뿔형 튜브에 옮기고 10003g에서 10분간 4C에서 원심분리했습니다. 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 40-mm 필터를 통해 여과한 후 다시 원심분리했습니다. MACS Debris Removal Kit(Miltenyi Biotec)에 이어 EasySep Annexin V Dead Cell Removal Kit(StemCell)을 사용하여 살아있는 세포를 정제했습니다. 간략하게, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁시키고 잔해 제거 용액과 혼합했습니다. 혼합물 위에 Cold PBS를 얹고 3003g에서 10분간 4C에서 원심분리하였다. 상위 2개 상을 흡인한 후 남은 세포를 PBS로 세척하였다. 세포를 재현탁하고 Dead Cell Removal Cocktail, Biotin Selection Cocktail, RapidSpheres와 혼합한 후 EasySep 자석에서 분리했습니다. scRNAseq 처리를 위해 세포를 세척하고 PBS(칼슘 또는 마그네슘 없음) 10.04% BSA(Fisher Scientific) 52ml에 재현탁했습니다.
scRNAseq
정제된 세포를 UAB Flow Cytometry 및 Single Cell Core로 옮기고 Chromium 39 Single-Cell RNA Sequencing Kit(103)를 사용하여 즉시 처리했습니다.Genomics) 제조업체에 따르면'지침.세포 현탁액을 계산하고 103 크롬 시약 혼합물을 마이크로플로리다UI딕용해 및 역전이 가능한 단일 세포 분할 장치전사는 미세액적에서 일어난다. 결과 cDNA충분했다fiPCR에 의해 편집된 후 처리되어 산출됩니다.
바코드 시퀀싱 라이브러리. 페어드 엔드 시퀀싱은 Illumina NovaSeq6000 또는 NextSeq500 시퀀싱 플랫폼(Illumina)에서 수행되었습니다. 읽기가 처리되었습니다.10을 사용하여3 Genomics Cell Ranger 단일 셀 소프트웨어UAB Cheaha High-Performance의 Suite 버전 6.0컴퓨팅 클러스터. BCLfi파일이 FASTQ로 변환되었습니다.fiCellRanger 빠른 기능을 사용하는 파일. 셀레인저FASTQ를 정렬하는 데 fast가 사용되었습니다.fi사용자 정의 게놈에 대한 파일hg38 인간 게놈(GRCh38.p13)으로 구성됨
엑손(31)으로 삽입된 SARS-CoV-2 게놈(NC_045512.2). 분석을 위해 유전자 테이블, 바코드 테이블, 전사 발현 매트릭스가 생성되었습니다.아래에 표시됩니다.
데이터 분석
분석은 R 통계분석 환경(버전 4.06)용으로 제작된 패키지를 이용하여 수행하였다. 데이터는 주로 Seurat 버전 3.2.3(32,33)에서 분석되었으며관련 종속성. 각 환자의 데이터Read10을 사용하여 가져왔습니다.3 기능을 수행한 다음 구조를 지정합니다.CreateSeuratObject를 사용하여 Seurat 객체로 변환되었습니다. 을 위한품질 관리, 고유한 기능을 갖춘 셀 수 2500개 이상또는 200 미만 및 미토콘드리아 비율이 다음과 같은 세포.15%는fi필터링했습니다. 데이터는 Log를 사용하여 정규화되었습니다.선형 차원을 준비하기 위해 정규화 및 크기 조정절감. 개별 환자의 개체에 라벨이 지정되었습니다.고유한 그룹 ID로fi양이온을 결합한 다음Seurat 병합 기능을 사용하는 단일 객체. 환자 샘ples는 다음을 사용하여 RunHarmony 기능과 통합되었습니다.Harmony R 패키지(34). 주성분 분석수행한 후 다음을 기준으로 셀을 클러스터링했습니다.Seurat에 의해 결정된 차별적인 유전자 발현FindAllMarkers 함수는 1의 해상도로 설정됩니다. 디멘균일한 매니폴드를 사용하여 선택적 환원을 수행했습니다.근사와 투영. 세포 유형은 동일했습니다fi에드차등적으로 표현된 성적표를 비교함으로써특정 항목과 관련된 알려진 성적표가 있는 각 클러스터fic 세포 유형(29,35,36). Escape R 패키지를 사용하여 실행했습니다.유전자 세트 농축 분석(GSEA)(37). 웹게슈탈트R경로를 식별하기 위해 유전자 온톨로지 분석에 사용되었습니다.생물학적 과정과 교토백과사전을 이용하여유전자 및 게놈 데이터베이스(38).
