글루코코르티코이드 유발 쥐 모델에서 Cistanche Deserticola 및 막걸리 증숙 제품의 신경내분비 면역 기능에 관한 연구-Ⅰ

1. 소개

시스탄체 데세르티콜라"사막 인삼"이라 불리는 인삼은 수세기 동안 양장약으로 사용되어 온 전통 한약재입니다.신장을 보하고 양기를 튼튼하게 한다[1]. 8종과 1변종시스탄체 허바 중국에서만 녹음됐는데시스탄체 데세르티콜라YC 마와시스탄체 튜불로사(Schenk) Wight는 중국 약전[2]에 기록되어 있습니다. 약리학적 연구에 따르면시스탄체스 허바신경보호제 [3], 면역조절제 [4], 심장보호제 [5], 항피로제 [6], 항염증제 [7], 간 보호제 [8], 항산화제 [9], 항균제 [10], 완하제 [11] 및 항 종양 효과를 나타냈습니다. 효과 [12]. 이 속의 보고된 생물학적 활성의 광범위한 스펙트럼은 복잡하고 다양한 식물화학적 구성에 기인합니다.시스탄체 데세르티콜라페닐에탄올배당체, 이리도이드, 다당류 등을 함유하고 있다[13]. 페닐에타노이드 배당체의 함량은 오리지널 약재 중 가장 높다[14].

신장 활성화를 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

한약재 가공(CMM)은 전통 한의학 이론에 따라 치료, 조제 및 준비를 위한 다양한 요구 사항을 충족하는 전통 제약 기술입니다. 이렇게 가공된 제품을 음편이라 부르며 진료소에서 사용합니다. 가공은 생약의 독성을 감소시켜 효능을 높이는 것을 목표로 합니다. 2015년 중국 약전에는 시스탄체 두꺼운 조각(CD)과 막걸리로 찐 시스탄체(WCD)가 임상에서 달인 조각으로 사용될 수 있다고 기록되어 있습니다. 우리 연구진은 시스탄체를 막걸리로 쪄서 완하작용이 완화되고, 항노화 및 신장양강작용이 강화되는 것을 확인하였다[15].

신장양결핍증후군에서는 시상하부-뇌하수체-부신-흉선(HPAT) 축의 기능이 손상됩니다[16]. 신장양허증 환자는 면역기능 장애도 광범위하다. HPA 축 기능 장애는 면역결핍과 밀접한 관련이 있습니다. 신경내분비-면역 네트워크(NEI) 이론은 면역계와 신경내분비계가 많은 리간드와 수용체를 공유하며[17], 시상하부는 신경내분비계와 면역계를 연결하는 중심축으로 간주된다는 것을 보여줍니다.

본 연구에서는 외인성 코르티코스테로이드 주사를 통해 모델 쥐의 신장양 결핍을 재현하고 내분비면역 기능의 관점에서 Cistanche Deserticola의 다양한 가공 제품에 반응하는 신장양 결핍의 메커니즘을 탐색했습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 재료 및 시약

Cistanche Deserticola는 2019.5년 Alashan Neimenggu에서 수집되었으며 Yanjun Zhai 교수(중국 랴오닝 중의약대학 약학부)에 의해 Cistanche Deserticola YC Ma의 건조된 과육 줄기로 확인되었습니다. 바우처 표본은 랴오닝 가공 공정 기술 센터에 보관되었습니다.

아주골의 표준 화합물은 Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd.(중국 청두)에서 구입했습니다. 시스타노사이드 F,에키나코사이드, 시스타노사이드 A, 이소액티오사이드Must Company(중국 쓰촨성)에서 구입했습니다. acteoside는 Dalian Meilun Bio에서 구입했습니다. Co., Ltd. (중국 대련) MS 등급 아세토니트릴과 메탄올은 Merck KGaA(독일 다름슈타트)에서 구입했습니다. HPLC 등급 포름산은 Merck KGaA(Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. 막걸리는 Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd.(Zhejiang, China)에서 구입했습니다.

코르티코스테론(CAS: 50-22-6, 순도 > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), 친쿠에이 신추완 알약(Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), 쥐 ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 및 IL-10 ELISA 검출 키트는 Nanjing Jiancheng Co., Ltd.에서 구입했습니다. 쥐 코르티솔 ELISA 키트는 BOSK Co., 쥐 CD4 항체, CD8a 항체(번호 561833 및 559976), RBC 용해물(Solarbio, R1010), PBS 완충 용액(Solarbio, P1020-500), TRIzol(MAN0001271), CaM 및 -actin 업스트림 및 다운스트림 프라이머 역전사 키트(번호 RR037A) 및 cDNA 합성 키트(번호 10000068167)는 Bole Life Medicine Products(Shanghai) Co., Ltd.에서 제공되었습니다. 클로로포름, 이소프로판올, 75% 에탄올 및 우레탄 용액은 모두 분석적으로 순수했고 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.에서 생산되었습니다. 초순수는 Milli-Q 시스템(18.2 MΩ, Millipore, MA, USA)에서 생산되었습니다.

2.2. 실험 장비

효소 마커(Thermo, 모델 3530911931), 자동 판 세척기(모델 HBS- 4009), 디지털 디스플레이 푸시-풀 힘 측정기(모델 VICTOR- 50N), 고속 냉동 원심분리기(모델 Sigma 3k15 ), 초소형 분광광도계(모델 B-50Q), 유전자 증폭기(모델 L96G), 실시간 형광 정량 PCR(모델 StepOne), 유세포 분석기(모델 AC66051710132), 파라핀 마이크로톰(모델 Laika), 현미경(Olympus , 모델 BS-53) 및 순수 장비(모델 F7JA36507)가 사용되었습니다.

2.3. UPLC-Q-TOF-MS 및 약리학 실험을 위한 샘플 준비

WCD는 동일한 배치에서 처리되었습니다.시스탄체 데세르티콜라우리 연구실에서요. WCD 제조를 위해 건조 CD 조각(두께 5mm)(100g)에 막걸리(30mL)를 주입하고 고압(1.25kPa)에서 4시간 동안 찌고 55도에서 건조했습니다.

CD와 WCD의 거친 분말을 10배 95% 에탄올에 0.5시간 동안 침지시킨 후, 1시간 동안 3회 환류 추출한 후 여과하고, 여액을 3회 합쳤다. 에탄올을 감압하에 회수하고, 투여용 추출물을 얻었다. 추출물(1 mL)을 50% 메탄올에 첨가하여 전체 부피를 20 mL로 한 후 함량 분석을 위해 4도에 보관하였다.

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2.4. CD 및 WCD 추출물 분석을 위한 UPLC-QqQ-MS 조건

2.4.1. LCThMS 분석 조건

MassLynx 4.1 Analyst 소프트웨어가 포함된 UPLC-MSThMS 시스템을 사용하여 데이터 수집 및 처리를 수행했습니다. 분석 컬럼은 온도 40 ℃에서 Acquity UPLC BEH C18 (1{{1{12}}}}0 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)이었습니다. 이동상 0.1% 포름산 수용액(A)과 0.1% 포름산을 함유한 아세토니트릴(B)이었습니다. 용출 구배는 3% B에서 0.00–1.00분, 3%–11.5% B에서 1.01–2.00분, 2.01–3입니다.{{29 }}분(12% B), 3.01–4.00분(15% B), 4.01–5.00분(20% B), 5.01–6.00분(22) % B, 25% B의 경우 6.01–8.00분, 10% B의 경우 8.01–9.00분. 유속은 0.3 mLTh min이고 주입량은 1.0 μL입니다.

음이온 모드에서는 ESI(electrospray ionization) 소스가 장착된 Waters 삼중 사중 질량 분석기(Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA)를 사용했습니다. 탈용매화 가스는 온도 250도에서 유량 500LThh의 질소였습니다. 검출된 모든 화합물은 다중 반응 모니터링(MRM) 모드에서 측정되었습니다. 표 1은 에너지 매개변수를 보여주고, 표 2는 분석된 성분에 대한 검량선을 보여줍니다.

2.4.2. 기준 물질의 준비

튜불로사이드 A(3.02 mg), 에키나코사이드(3.00 mg), 2'-아세틸액티오사이드(2.34 mg), 액티오사이드(2.45 mg), 이소액티오사이드(0.61 mg), 시스타노사이드 F( 2.14 mg), 살리드로사이드(3.39 mg), 게니포시드산(2.84 mg), 아주골(1.58 mg), 카탈폴(2.39 mg)을 메탄올에 용해하여 원액을 제조하였다. 스톡 용액을 메탄올로 희석하여 작업 표준 용액에 대한 적절한 농도를 얻었습니다. 준비된 모든 용액은 사용 전 4도에 보관되었습니다.

2.5. 동물 모델의 준비 및 그룹화

SD 수컷 쥐(180-220g)는 Liaoning Changsheng Biotechnological Co., 동물 허가 번호: SCXK(Liao) 2015-0001에서 구입했습니다. 모든 쥐는 25도, 상대습도 30~50%에서 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 유지되었습니다. 실험 전 동물을 7일 동안 사육하였다.

100마리의 쥐를 무작위로 10 그룹으로 나누었습니다: 공백 대조군(BC)군, 모델 대조군(MC)군, 양성 대조군(PC)군, 막걸리 대조군(WC)군, CD 고용량(CD) -HD) 그룹, CD 중간 용량(CD-MD) 그룹, CD 저용량(CD-LD) 그룹, WCD 고용량(WCD-HD) 그룹, WCD 중간 용량(WCD-MD) 그룹 및 WCD 저선량(WCD-LD) 그룹. CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD 및 CD-LDThWCD-LD의 용량은 각각 5.48 gTh(kg ∙ d), 2.74 gTh(kg ∙ d) 및 1.37 gTh(kg ∙ d)였습니다. 40일 동안 PC군은 1.646 gTh(kg·d), WC군은 1 mLTh100 g을 투여하였다. 투여 후 6일째에 코르티코스테론 수현탁액(코르티코스테론+ 0.1% 디메틸설폭사이드+ 0.1% 트윈-80 + 0.9% 염화나트륨)을 래트에게 피하주사하였다. BC 그룹의 경우 [18]. 코르티코스테론의 농도는 5gThL이었으며, 용량은 0.1mLTh100g이었다. BC 그룹의 쥐에게는 생리식염수 + 0.1% 디메틸설폭사이드+ 0.1% Tween- 80 + 0.9% 염화나트륨을 동일한 용량으로 주사했습니다.

2.6. HPA 축 기능 결정

2.6.1. 무게, 온도, 유지력 테스트

체중검사는 3일마다 실시하였고, 체온은 6일마다 측정하였다. 실험 도중. 39일째 뒷다리의 최대 근력을 악력계로 측정하였다. 쥐를 매끄러운 플랫폼 위에 놓고 뒷다리가 기둥을 잡도록 했습니다. 쥐는 당기는 힘이 그립을 초과할 때까지 꼬리를 당길 때 뒤로 움직이는 것을 방지하기 위해 본능적으로 물체를 잡습니다. 쥐가 쥐는 힘을 잃으면 프리앰프는 자동으로 최대 쥐는 힘을 기록할 수 있습니다.

2.6.2. 혈청 내 T, CRH, ACTH, CORT 및 코르티솔 수준 측정

마지막 투여 1시간 후, 우레탄 용액(20 gTh100 mL)을 복강내 주사하여 쥐를 마취시켰다. 이후 혈액 샘플을 채취하고 3500r에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻은 후 -20도에 보관하였다. T, CRH, ACTH, CORT 및 코르티솔의 농도는 제조업체의 지침에 따라 쥐 ELISA 키트를 사용하여 측정되었습니다.

2.6.3. 현미경 관찰

HE 염색을 통해 부신 조직의 형태학적 구조를 관찰하였다. 부신 조직을 10% 파라포름알데히드에 고정하고, 에탄올로 탈수시키고, 자일렌 용액으로 투명하게 만들고, 기존 방법으로 포매하고, 4 μm 두께의 슬라이스로 자르고, 자일렌 용액으로 왁스를 제거하고, 에탄올 구배로 수화시킨 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색했습니다. 염색 용액. 자일렌으로 투명하게 만든 후 중성검으로 밀봉하여 현미경으로 관찰하였다.

2.6.4. 부신에서 Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas 및 FasL 단백질 발현의 면역조직화학적 염색

포르말린으로 고정하고 파라핀으로 포매한 쥐의 부신 절편을 4 μm 두께로 절단한 후 탈파라핀 처리하고 재수화시켰습니다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해 섹션을 과산화수소 블록에서 10분 동안 사전 배양했습니다. 섹션을 0.01 M 구연산염(pH 6.0)에 담그고 끓을 때까지 가열했습니다. 이 과정은 5~10분 후에 반복되었습니다. 식힌 후 PBS(pH 7.2~7.6)로 1~2회 세척한 후 실온에 약 5분간 방치한 후 PBS(pH 7.2~7.6)로 2~3회 세척하였다. 5% BSA 차단 용액을 실온에서 첨가하고, 20분 후에 단면의 과잉 액체를 털어냈습니다. FasTh FasL, Bcl{25}}ThBax 및 카스파제-3(PBS로 1:100 희석)에 특이적인 희석된 1차 항체를 첨가하고 37도에서 1시간 또는 4도 밤새 배양했습니다. 절편을 PBS(pH 7.2~7.6)로 2~3회 세척했습니다. 그런 다음 비오티닐화된 염소 항-마우스 IgG를 첨가하고 절편을 20~37도에서 20분간 건조시킨 후 PBS(pH 7.2~7.6)로 5분간 4회 세척했습니다. PBS로 철저히 세척한 후 절편을 시약 A와 B의 혼합물에서 30분간 배양하고 PBS에서 45분간 배양한 후 최종적으로 DAB 기질(DAKO)에서 30분간 현상시킨 후 헤마톡실린으로 약간 대조염색하고 탈수하였다. 그리고 장착.

성감각 강화를 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. 면역 기능의 결정

2.7.1. 면역기관지수 계산

마지막 투여 1시간 후, 우레탄 용액(20 gTh100 mL)을 복강내 주사하여 쥐를 마취시킨 후 비장과 흉선을 적출하여 멸균 후드에서 즉시 무게를 측정하였다. 비장 또는 흉선의 중량 계수(%) � 비장 또는 흉선 중량(mg) 체중(g).

2.7.2. 말초 혈액에서 T 림프구 하위 집합의 검출

비장세포와 혈액세포를 단클론 항체 항CD4(PE) 및 항CD8(FITC)과 함께 암실에서 30분 동안 배양했습니다. 2 mL의 적혈구 용해물을 첨가하고 용액을 볼텍싱하여 혼합하였다. 용액을 어둠 속에 10분 동안 방치하고 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척한 후 PBS 투과용액에 재현탁시켰다. 각 Mab 염색 후 1시간 이내에 최소 10개000 세포를 유세포 분석으로 분석했습니다.

2.7.3. 혈청 내 IL-10, IL-6, IL-2, TNF- 및 IFN-c 수준 측정

마지막 투여 1시간 후, 우레탄 용액(20 gTh100 mL)을 복강내 주사하여 래트를 마취시킨 후, 복부 대동맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액을 3500r에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻고 -20도에 보관하였다. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- 및 IFN-c의 농도는 제조업체의 지침에 따라 쥐 ELISA 키트를 사용하여 검출되었습니다.

2.8. 시상하부 및 뇌하수체 조직에서의 CaM 발현

TRIzol을 사용하여 시상하부 및 뇌하수체 조직에서 총 RNA를 추출했습니다. 제조업체의 지침에 따라 총 RNA 10 μL에 대해 역전사를 수행했습니다. dsDNA 결합 염료(Promega, USA) 및 CFX 96 Real-time PCR System(Bio-Rad, USA) 존재 하에서 qPCR을 통해 동일한 양의 cDNA를 분석하여 초기 활성화 조건에서 서로 다른 유전자를 살펴보았습니다. 10분 동안 95도, 15초 동안 95도에서 변성 40사이클, 1분 동안 60도에서 어닐링 연장.

CaM과 -actin에 대한 프라이머는 표 1에 나와 있으며, -actin은 내부 대조군으로 사용되었습니다. 각 샘플은 표적 유전자와 α-actin 사이의 임계 임계값(Ct) 차이를 사용하여 정규화되었습니다. 결과를 설명하기 위해 다음 방정식을 사용했습니다: ΔΔCt � (Ct 표적 유전자 - Ct -actin 유전자) 실험군 - (Ct 표적 유전자 - Ct -actin 유전자) 대조군. 그런 다음 발현 2- ΔΔCt 표적 유전자를 사용하여 각 샘플의 mRNA 수준을 비교했습니다. 각 그룹의 결과를 평균화했습니다(표 3).

2.9. 통계분석

모든 데이터는 SPSS 소프트웨어(버전 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL)를 사용하여 분석되었습니다. 그룹 간의 차이는 일원 분산 측정 분산 분석(ANOVA)을 통해 분석되었습니다. 결과는 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 6.0, San Diego, CA, USA)를 사용하여 평균 ± 표준편차(SD)로 표시되었습니다. 0.05보다 작은 P 값의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

3. 실험 결과

3.1. UPLC-QqQ-MS분석

최상의 분리, 피크 모양 및 짧은 분석 시간을 달성하기 위해 예비 실험에서는 컬럼, 이동상 및 그래디언트 프로그램을 포함한 크로마토그래피 조건을 연구했습니다. MRM 모드를 사용한 일반적인 크로마토그램은 그림 1에 나와 있습니다.

표 4에서 우리는 WCD의 페닐에타노이드 배당체 함량이 CD의 함량에 비해 특히 echinacoside와 acteoside의 경우 증가한 반면 Iridoid의 함량은 WCD에서 감소한 것을 볼 수 있습니다.

3.2. HPA 축 기능에 대한 규정

3.2.1. 무게, 온도, 유지력 테스트

MC군과 실험군의 쥐는 코르티코스테론을 투여한 후 점차 신장양 결핍 증상을 보였다. 체중 감소, 저체온증, 모발 윤기 상실, 기력 저하, 반응 지연, 물 소비 및 활동의 현저한 감소 등의 증상은 CD 및 WCD 그룹에서 크게 개선되었습니다. 그림 2(a)는 체중 변화를 보여줍니다. 특히 CDHD 및 WCD-HD 그룹에서 각 약물 그룹의 가중치가 증가했습니다. MC그룹의 체중증가율이 가장 낮았습니다. 그림 2(b)는 MC 그룹에서 가장 낮은 온도 변화를 보여주며, WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD 그룹에서는 온도가 증가함을 보여준다.

Figure 2(c)에서는 BC군과 각 실험군에서 유지력이 증가한 것을 알 수 있으며, WCD-MD군에서 가장 높게 나타나 신장양허약으로 인한 허약 징후가 투여 후 호전되는 것을 확인할 수 있다.

3.2.2. T, CRH, ACTH, CORT 및 코르티솔 수준

그림 3은 BC 그룹과 비교하여 쥐 혈청의 T, CRH, ACTH 및 CORT 수준이 감소하고(P < 0.01) 코티솔 수준이 감소한 것을 보여줍니다(P < 0.05) MC 그룹에서. MC 그룹에 비해 WCD-HD 및 WCD-MD 그룹에서는 T 수준이 증가했으며(P < 0.01), WCD-LD에서는 CRH 수준이 증가했습니다. WCD-MD, WC 그룹은 향상되었으며(P<{24}}.01), CD-HD, WCD-MD, WCD-HD 그룹에서는 ACTH 함량이 증가했으며(P<0.01), CORT 수준은 CD-MD, WCD-MD 및 WCD-HD 그룹(P < 0.01)은 CDHD 및 WCD-LD 그룹에서 향상되었으며(P < 0.05), 코티솔 수준은 각 약물 그룹에서 증가했습니다.

3.2.3. 현미경 관찰 결과

부신 조직은 피질층과 수질층으로 나눌 수 있습니다. 피질층에는 구형층, 다발층, 망상층이 포함됩니다. 세포에는 더 많은 지질이 포함되어 있으며 수질층은 대부분 갈색 세포종 세포와 소량의 섬유 조직으로 구성됩니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 BC 그룹에서는 모든 것이 정상인 반면 MC 그룹에서는 부신 피질에 명백한 증식, 세포 위축 및 밀도 증가가 있음을 발견했습니다. 구근 띠는 두꺼워졌고, 반투명 근막대, 좁은 망상대, 더 작은 세포는 고르지 않은 색상과 모세혈관 울혈을 나타냈습니다. PC 그룹에서는 피질과 수질 경계가 보였습니다. 구상띠와 다발띠의 세포가 고르게 배열되어 형태학적 구조가 회복되었다. WCD 그룹에서도 동일하게 더 나은 복원이 관찰되었으며 WCD-MD 그룹의 효과는 WCD-HD 및 WCD-LD 그룹의 효과보다 더 좋았습니다. CD 그룹의 부신 형태는 WCD 그룹만큼 좋지 않았습니다.

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