자가 포식을 유도하여 NAFLD에 대한 Acteoside (Cistanche Deserticola의 활성 성분)의 효과에 대한 연구

추상적인:

목적:Cistanche Deserticola에서 활성 성분 아르 테오 시드 (ACT)의자가 포식-유도 기능 및 비 알코올성 지방간 질환 (NAFLD)에 미치는 영향을 탐구한다.

행동 양식에키나코 시드를 복용하고 연구 대상으로서 작용하기 위해, 1 0 0 μmol/L Act 및 Echinacoside (ECH)를 개입 치료를 위해자가 포식-리소좀 억제제 Bleomycin A1과 결합시켰다. 단백질 면역 블 롯팅을 사용하여자가 포식 마커 단백질 미세 소관 관련 단백질 1 경쇄 3 (LC 3- II)의 상대 발현 수준을 검출 하였다. HEPG2 세포를 시험 관내에서 상이한 농도의 ACT ACT로 개입시키고, 테트라 졸륨 염 방법을 사용하여 세포 생존력을 검출 하였다. Balofloxacin A1과 조합 된 상이한 농도의 ACTS를 갖는 HEPG2 세포의 시험 관내 중재 및 LC 3- II 단백질 발현 기술의 검출. 약물 중재로 시험 관내에서 구축 된 NAFLD 모델을 사용하여 오일 레드 O 염색법을 사용하여 지질 액 적을 염색하고 세포 내 트리글리세리드 수준을 검출 하였다. 면역 형광 기술을 통해 LC3 단백질 및 지질 액 적의 국소화를 관찰하십시오. 결과는 HEPG2 세포에서자가 포식을 유도 할 수 있으며, LC 3- II 단백질의 발현 수준은 대조군 (ACT 단독으로 처리) (1.36 ± 0. 11, {{21}. 28 ± {28}}. 각각), 통계적 유의성 (P0.05). 50 μmol/L은 HEPG2 세포에서자가 포식을 유의하게 유도하였고, LC 3- II 단백질의 발현 수준이 유의하게 증가 하였다 (각각 1.83 ± 0.53, 0.35 ± 0.18). ACT 중재 그룹 (19.11 ± 1.68)에서 HEPG2 세포의 TG 수준은 NAFLD 시험 관내 세포 모델 그룹 (34.15 ± 1.90)에서보다 상당히 낮았으며, 그 차이는 통계적으로 유의했다 (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

키워드 :비 알코올성 지방간 질환;Cistanche Deserticola;아르 테오 시드;자가 포식

비 알코올성 지방간 질환의 치료를위한 TCM 허브 시스 첸 (TCM Herb Cistanche) (NAFLD)

자세한 내용을 보려면 사진을 클릭하십시오

지난 수십 년 동안 비 알코올성 지방간 질환(NAFLD)가 가장 흔해졌습니다만성 간 질환, 성인 인구의 약 25%의 전 세계 유병률이 있으며, 대사 증후군과 밀접한 관련이있는 것으로 간주됩니다 [1]. NAFLD 환자의 간 관련 합병증의 확률은 10%미만이지만 NAFLD는 간경변 및 1 차 간암과 같은 간 관련 질환의 위험 인자로 환자에게 큰 경제적 부담 을가합니다 [2-5]. NAFLD에 대한 관심이 증가 함에도 불구하고 중요한 만성 질환으로서 NAFLD는 충분한 관심을받지 못했습니다. 따라서 NAFLD의 발병 기전과 효과적인 치료 전략에 대한 검색에 대한 심층적 인 이해는 해결해야 할 긴급한 문제가되었습니다 [6-7].

최근의 연구에 따르면 세포자가 포식은 간 생리학 및 병리학에서 중요한 역할을한다는 것이 밝혀졌습니다 [8]. 자가 포식 기능 장애 또는 조절 기능은 다음과 같은 다양한 간 질환과 관련이 있습니다.알코올 관련 간 질환[9], NAFLD [10], 비 알코올성 관골염 [11] 및 간세포 암종 [12]. NAFLD의 병리학 적 특성은 비 알코올성 자극하에 간세포에서 트리글리세리드 (TG) 및 기타 중성 지질 액적 (LD)의 과도한 침착이다. 간의 경우, 이들 LDS의 이화 작용을 조절하는 두 가지 주요 경로는 지방 분해 및자가 포식이다.
지방 분해 경로는 호르몬-민감성 리파제 및 지방성 TG 리파제와 같은 세포질 중성 리파제에 의해 조절된다. 상응하는 리포 아파트 포기 경로에서, LDS는자가 포식 관련 단백질을 직접 모집하여자가 포식 소체를 형성함으로써 선택적으로 흡수 될 수 있으며,이어서자가 포식 소체에 의해 캡슐화 된 LDS는 리소좀으로 추가로 전달되고 리소좀에서 산 리파제에 의해 분출된다. 따라서, 간세포에서 리포 상자 포식을 활성화하는 것은 NAFLD의 예방 및 치료를위한 효과적인 전략이되었다.
Cistanche Deserticola는 한약 전통 공식의 임상 실습에 널리 사용 된 귀중한 중국 약초입니다. 동시에, 그것은 오랫동안 건강 식품 보충제로 사용되어 왔습니다. Cistanche Deserticola에는 다양한 생물 활성 성분이 포함되어 있으며, 그 중 가장 중요한 것은 Cistanche Deserticola Phenylethanol Glycosides입니다. 페닐 에타 노이드 글리코 사이드의 대표자로서, 에키 나코 시드 (ECH) 및 Verbascoside (ACT)는 산화 방지제, 신경 보호, 면역 조절 및 간 보호와 같은 많은 중요한 생물학적 활성을 갖는 것으로보고되었다 [13]. 간 보호 측면에서, 연구에 따르면 ECH는 염증 매개체를 감소시키고, 형질 전환 성장 인자를 억제하며, 간 섬유증 관련 유전자의 발현 수준을 감소시킴으로써 간을 보호 할 수 있음을 발견했다. ACT는 알코올, 테트라 클로라이드 및 리포 폴리 사카 라이드와 같은 화학 및 약물 유발 간 손상에 상당한 보호 효과가 있습니다. ACT는 독성 화학 물질로 인한 산화 스트레스를 줄이고 간에 축적 된 반응성 산소를 제거하며 말론 디 알데히드 농도를 감소시킵니다. 동시에, 그것은 간 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 활성을 크게 증가시키고 글루타티온 함량을 감소시키고, 간 조직 병리학 적 손상 및 아 pop 토 시스를 크게 향상시킨다. 그러나, Cistanche Deserticola의 페닐 에타 노이드 글리코 사이드가 간 보호를 발휘하는 데자가 포식 과정에 관여하는지에 대한 관련 문헌 보고서는 없습니다. 이 연구는 기존의 세포 생물학적 방법과 시험 관내 세포 모델을 사용하여 Cistanche deserticola phenylethanoid glycosides의자가 포식-유도 효과를 예비 적으로 탐색하고 가능한 약물 발달을위한 과학적 근거를 제공하는 가능한 약물 학적 기능을 탐구했습니다.

Cistanche extract 4

1 재료 및 방법

1.1 재료

1.1.1 연구 과목 Ech and Act는 연구 과목으로 사용되었습니다.

1.1.2 재료 Hepg2 세포는 Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., Ech (Batch Numb 트립신은 미국의 Hyclone Company에서 구입했으며 태아 소 혈청 (배치 번호 : 04-002-1 a)은 BI Company, Israel, Penicillin/Streptomycin (Batch Numb (배치 번호 : BC0625) 탐지 키트는 중국 베이징의 Solebao Company에서 구입했습니다. 오일 레드 O (로트 번호 : O 0625-100 g), 디메틸 설폭 사이드 (로트 번호 : BCBZ1685)는 미국 시그마-알 드리 치 (Sigma-Aldrich)에서 구입했습니다. 자가 포식-리소좀 억제제 Bafilomycin A1 (BAFA1, LOT 번호 : TLRL-BAF1)은 미국 Invitrogen에서 구입 하였다; 자가 포식 활성화 제 라파 마이신 (Lot Number : S17098)은 중국의 상하이 위아니 바이오 테크놀로지 (Shanghai Yuanye Biotechnology Co.)에서 구입 하였다. 미세 소관 관련 단백질 1 광 사슬 3 (LC3, 로트 번호 : L7543, 종 : 토끼, 희석 비율 : 1 : 1 000) 및-actin (로트 번호 : ZRB1312, 종 : 희석 비율 : 1 : 5 000) 안티비이드에서 구매 하였다; 양 고추 냉이 퍼 옥시 다다 표지 된 이차 항체 (로트 번호 : 4010-05, 종 : 염소 항-토끼, 희석 비율 : 1 : 1 000)는 미국 남부 생명 공학에서 구입했습니다. 미국 Sigma-Aldrich Company, 미국 및 Bodipy 493/501 (로트 번호 : D3922)은 미국 Invitrogen Company에서 구입했습니다.

Cistanche healthcare supplement tablet

1.2 방법

1.2.1 세포 배양

HEPG2 세포를 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토 마이신을 함유하는 Dulbecco의 변형 독수리 고 포도당 배지에서 배양 하였다. 세포 합류가 85%에 도달하면 하위 문화, 도금, 중재 및 기타 작업이 수행되었습니다.

1.2.2 단백질 면역 블 롯팅 검출

1.2.2.1 ACT 및 ECH 처리

Lc 3- ⅱ 양성자 펌프 억제제로서 Hepg2 세포 Bafa1의 단백질 발현 수준은 LC 3- ⅱ 단백질이 세포에서 대량으로 응집되어자가 포식 유도 능력을 증폭시킬 수있다. 따라서, BAFA1의 결합 된 사용은자가 포식 유도 능력을 평가하기위한자가 포식 모니터링 시스템으로 사용될 수있다. 로그 성장 단계에서 HEPG2 세포를 밤새 배양을 위해 3.5 cm 세포 배양 접시로 옮겼다. 100 μmol/L Act, Ech 및 Bafa1을 12 시간 동안 중재에 사용 하였다. 세포를 사전 냉각 된 포스페이트 완충액 (PBS)으로 세척하고 10 분 동안 RIPA 단백질 용해 완충액에서 즉시 용해시켰다. 상청액을 원심 분리하고, 비신 코닌산 단백질 농도 분석 키트를 사용하여 총 단백질 농도를 측정 하였다. 나트륨 도데 실 설페이트 완충액으로 정량화 한 후, 샘플을 10 분 동안 95도에서 가열하여 단백질을 변성시켰다. 이어서, 30 μL의 샘플을 마이크로 피펫으로 취하고 폴리 아크릴 아미드 겔에서 전기 영동 하였다.
전기 영동 후, 단백질을 겔에서 니트로 셀룰로스 막으로 옮기고, 밤새 1 0% 우유로 차단하고, 1 시간 동안 실온에서 특정 1 차 항체와 함께 배양하고, 0.5% 트리톤을 함유하는 인산염 완충액과 세척하고, 1 시간 동안 실온에서 특정 2 차 항체와 함께 배양 하였다. ECL 방법은 색상 개발에 사용되었습니다. 이들은 블랭크 대조군, 라파 마이신 그룹, 에코 그룹, ACT 그룹, rapamycin+bafa1 그룹, ech+bafa1 그룹 및 ACT+Bafa1 그룹으로 설정되었습니다.

1.2.2.2 ACT의 상이한 농도는 LC의 발현 수준에 개입했다.

로그 성장 단계 HEPG2 세포를 밤새 배양을 위해 3.5 cm 세포 배양 접시로 옮기고, BAFA1과 결합 된 BAFA1과 결합 된 25, 50 및 100 μmol/L 작용을 12 시간 동안 중재 처리에 사용하였고, 단백질의 발현 수준을 단백질 면역 블 롯팅에 의해 검출 하였다. 대조군 (CON 그룹, 블랭크 컨트롤), 기아 그룹 (STA 그룹, 기아 처리 HEPG2 세포), 25, 50 및 100 μmol/L ACT 그룹 및 25, 50 및 100 μmol/L ACT 그룹과 결합 된 BAFA1을 설치 하였다.

1.2.3 MTT 방법 24 및 48 시간 동안 상이한 농도의 ACT로 처리 된 HepG2 세포의 생존율을 검출하는 방법
로그 성장 단계에서 HEPG2 세포를 적당한 접종 밀도를 갖는 96- 웰 플레이트에 접종하고 12 시간 동안 인큐베이터에서 배양 하였다. 2 0, 40, 60, 80 및 100 μmol/L act는 24 및 48 시간 동안 첨가되었다. 0.5 mg/mL MTT 용액을 어두운 환경에 첨가하고 인큐베이터에서 인큐베이션 하였다. 4 시간 후, 상청액을 폐기하고, 100 μl의 디메틸 설폭 사이드를 각 웰에 첨가하고, 세포를 37도에서 10 분 동안 일정한 온도 쉐이커에서 흔들었다. 490 nm의 파장에서 광학 밀도 (OD) 값은 효소 마커에 의해 검출되었고, 세포 생존율을 계산 하였다.

1.2.4 NAFLD 세포 모델의 시험 관내 구조

팔미틱 산 (PA)의 특정 중량을 칭량하고 특정 부피의 이소프로판올에 완전히 용해시켜 100 mmol/l PA 스톡 용액을 제조 한 다음 나중에 사용하기 위해 -20도 냉장고에 나뉘어 저장 하였다. PA 스톡 용액을 완전 배양 배지를 사용하여 100 μmol/L로 희석하고, 1% 지방산이없는 소 혈청 알부민을 첨가 하였다. 세포를 37도에서 3 시간 동안 인큐베이션하여 유도 용액을 제조 하였다. 로그 성장 단계에서 HEPG2 세포를 밤새 배양에 적합한 밀도로 3.5 cm 세포 배양 접시로 옮긴 다음, 제조 된 유도 용액을 개입에 사용 하였다.

1.2.5 ACT 개입 NAFLD 시험 관내 세포 모델 TG 검출 및 오일 레드 O 염색

1.2.5.1 TG 검출

로그 성장 단계에서 HEPG2 세포를 블랭크 대조군, 모델 그룹 및 ACT 중재 그룹에 따라 배양을위한 3.5cm 세포 배양 접시로 옮겼다. 모델 그룹을 100 μmol/L PA 유도 솔루션으로 유도하고, ACT 중재 그룹을 100 μmol/L PA 유도 용액으로 유도하고 동시에 50 μmol/L ACT를 추가 하였다. 중재 시간은 24 시간이었다. 오래된 배양 배지를 부드럽게 제거하고, 사전 냉각 된 PBS로 세포 표면을 천천히 세척하고, 사전 냉각 된 RIPA 용해 솔루션의 100 μL/접시를 추가하고, 15 분 동안 얼음에 완전히 해리, 4도에서 원심 분리기 및 10 분 동안 12 000 r/min을 10 분 동안 12 000 r/min, 상청액을 수집하기 위해 10 μL를 수집하여 10 μL을 수집합니다. TG 키트 지침, 최종적으로 단백질 mg 당 TG 수준을 수정하십시오.

Cistanche healthcare supplement tablet 3

1.2.5.2 오일 레드 O 염색

로그 성장 단계에서 HEPG2 세포를 밤새 배양을 위해 멸균 커버 슬립으로 덮인 3.5 cm 배양 접시로 옮겼다. 100 μmol/l PA는 세포를 유도하여 지질 액 적을 형성 하였다. 동시에, 24 시간 동안 개입을 위해 50 μmol/L 법을 첨가 하였다.
세포 슬라이드를 수집하고, 사전 냉각 된 PBS로 3 회 세척하고, 실온에서 10 분 동안 4% 포름 알데히드로 고정시키고, PBS로 세포 표면을 첨가하고, 제조 된 오일 레드 O 염색 작업 용액을 첨가하고, 15 분 동안 어두운 온도에서 실온에서 스테인 링 용액을 흡인하고, 두 배의 분류 물로 흡인 된 물질 스테인 팅 용액을 세척하고, 60% 더 구분 된 물을 세척 하였다. 밀봉하고 현미경으로 촬영했습니다.

1.2.6 ACT 처리 후자가 포식 소체 및 지질 액 적의 면역 형광 관찰

로그 성장 단계에서 HEPG2 세포를 밤새 배양을 위해 멸균 커버 슬립으로 덮인 3.5 cm 배양 접시로 옮겼다. 1 0 0 μmol/l PA를 사용하여 세포에서 지질 액 적의 형성을 유도 하였다. 동시에, ACT는 24 시간 동안 중재 치료를 위해 추가되었다. 세포 슬라이드를 수집하고, 사전 냉각 된 PBS로 3 회 세척하고, 4% 포름 알데히드로 10 분 동안 실온에서 고정 시켰으며, 0.1% 사포닌을 함유하는 투과성 완충제로 15 분 동안 실온에서 투과하여, 고트 혈청을 사용하여 1 시간 동안 실온에서 차단 된, 14 {14}}}}}}}}}}}}}}}}}}} {14}} {1 시간}} {1 시간}} {1 시간}}. 특정 형광-표지 된 이차 항체로, 실온에서 인큐베이션하고 1 시간 동안 빛으로부터 멀리 떨어진다. 항체 배양 후, 슬라이드를 PBS로 3 회 세척하고, 지질 액적-특이 적 프로브 493/503으로 10 분 동안 실온에서 대조하여, PBS로 세척하고, 방지 밀봉 배지로 밀봉하고, 어둠에 공기 건조되어, 레이저 냉소 현미경으로 관찰 된 및 기록된다. 블랭크 대조군, 라파 마이신 치료 그룹 및 ACT 중재 그룹이 설정되었다.