Stx2는 차등 유전자 발현을 유도하고 근위 세뇨관의 일주기 리듬 유전자를 방해합니다.

추상적인: 시가 독소를 생성하는 대장균(STEC)은 신장의 근위 세뇨관 결함을 유발합니다. 그러나 근위 세뇨관 내의 Shiga 독소(Stx)에 의해 변경된 요인은 아직 표시되지 않았습니다. 우리는 쥐와 인간 신장에서 Stx 수용체 Gb3을 결정하고 근위 세뇨관에서 수용체 발현을 확인했습니다. Stx2-주사된 마우스 신장 조직 및Stx2-처리된 인간 일차 신장 근위 세뇨관 상피 세포(RPTEC)을 수집하고 마이크로어레이 분석을 수행했습니다. 우리는 쥐의 신장과 RPTEC 어레이를 비교하고 대조군(0h, 독소 처리 없음)과 다르게 발현되는 공통 58개 유전자를 선택했습니다. 우리는 가장 많이 발현된 유전자가 Stx{4}}유발 체중 감소에 관여할 수 있는 GDF15라는 것을 발견했습니다. src 키나아제와 같은 이전에 보고된 Stx2 활성과 관련된 유전자 예 인산화 경로 활성화 펼쳐진 단백질 반응(UPR) 및 리보독성 스트레스 반응(RSR)은 차등적인 발현을 보였습니다. 더욱이, 일주기 시계 유전자는 차등적으로 발현되었으며, 이는 Stx2-가 신장 일주기 리듬 교란을 유발했음을 암시합니다. 일주기 리듬 조절 근위 세뇨관 Na+ -포도당 수송체 SGLT1(SLC5A1)이 하향 조절되어 근위 세뇨관 기능 저하를 나타냈고, 생쥐에 당뇨병이 발생하여 근위 세뇨관 기능 장애가 확인되었습니다. Stx2는 알려진 활동과 새로 조사된 일주기 리듬 장애를 통해 쥐 및 인간 근위 세뇨관의 유전자 발현을 변경하여 근위 세뇨관 기능 장애를 일으킬 수 있습니다.

키워드:시가 독소 2형(Stx2);신장 근위세뇨관; 생쥐; 인간 신장 근위 세뇨관 상피 세포(RPTEC); 마이크로어레이; 일주기리듬

주요 기여:Stx2-처리된 마우스 신장과 인간의 1차 근위세뇨관 세포에서 차별적으로 발현된 유전자를 분석했습니다. 이전에 알려진 Stx2- 영향 유전자 외에도 일주기 리듬 관련 유전자가 발현을 변경하고 근위세뇨관 기능에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.

1. 소개

시가 독소를 생성하는 대장균STEC(STEC) 감염은 급성 신부전, 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈의 3대 증상으로 정의되는 용혈성 요독 증후군(HUS)의 심각한 증상을 유발합니다. 시가 독소(Stxs)는 이 전염병에서 세포를 손상시키는 데 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. HUS의 특징적인 신장 조직병리학에는 사구체 내 모세혈관 피브린 침착 및 세뇨관 괴사와 같은 사구체 및 세뇨관 손상이 포함됩니다[1,2]. 소변 분석을 통해 STEC 감염 환자의 근위세뇨관에서 초기 기능 장애 발생이 보고되었습니다. 근위세뇨관 기능성 요로 표지자N-아세틸글루코사미니다제STEC O157- 또는 O111- 관련 HUS 환자의 급성기 소변에서 NAG(NAG)와 2 microglobulin( 2MG)이 크게 증가한 것으로 측정되어 초기 근위 세뇨관 기능 장애를 시사합니다[3].

Stx2를 포함한 Stxs는 단일 A 하위 단위와 5개의 B 하위 단위(A1B5 독소)로 구성됩니다. 여기서 A 하위 단위는 60S 리보솜 하위 단위의 28S rRNA에서 아데닌 4324를 제거하는 효소 활성을 갖는 반면 B 하위 단위는 글로보트리아오실세라미드를 통해 숙주 세포에 결합하는 데 필요합니다. (Gb3). Stxs가 세포에 미치는 영향에는 몇 가지 알려진 영향이 있습니다. (I) 독소는 수용체 Gb3에 결합함으로써 Src 계열 키나아제를 통해 신호 전달을 유도합니다. 예 [4,5]. 수용체에 결합한 후 Stxs는 세포내이입에 의해 세포 내로 들어가고 역행적으로 ER로 운반됩니다. Stxs는 엔도솜과 A 서브유닛이 퓨린에 의해 촉매 A1과 C 말단 A2 단편 사이에서 절단되는 골지체를 통과하지만[6] A1과 A2 단편은 여전히 ​​이황화 결합으로 연결되어 있습니다. 독소가 ER에 도달하면 이황화 결합이 감소할 수 있습니다. 그런 다음 홀로톡신의 A1 단편이 방출됩니다[7,8]. 이는 (II) ER-스트레스의 영향이 펼쳐진 단백질 모방 독소 단편에서 발생하여 펼쳐진 단백질 반응(UPR)을 유도하는 경우입니다. A와 B 하위 단위 모두 Bip에 결합할 수 있으며, 이는 ER 스트레스를 유발함을 나타냅니다[9,10]. 절단된 A1 단편은 세포질로 전위되어 28S rRNA에서 아데닌을 제거하여 (III) 단백질 합성을 억제합니다. 28S rRNA에 대한 변형 Stxs는 (IV) 리보독성 스트레스 반응(RSR)을 유도하여 하류 신호전달 계통을 활성화합니다[11]. 영향 (II) 및/또는 (IV)는 (V) 특정 유전자 전사를 유도하여 사이토카인 분비를 유도하는 것으로 알려져 있습니다[12]. 또한 (II)와 (IV)는 (VI) Stxs에 의한 세포 사멸에 관여합니다 [13-15].

인간 근위 세뇨관과 생체 내 마우스 모델을 사용한 시험관 내 실험은 근위 세뇨관 손상을 Stxs와 강력하게 연결합니다. 인간 근위 세뇨관의 일차 배양물과 세포주 모두 Stxs에 매우 민감하며 사이토카인 방출과 세포 사멸을 포함한 세포 사멸을 나타냅니다 [16-20]. 인간 일차 신장 근위 세뇨관 상피 세포(RPTEC)는 Gb3 수용체를 발현하고 시가 독소에 매우 민감하며 단백질 합성 억제, 사이토카인 생성 및 세포사멸 유도와 같은 생물학적 반응을 분석하기 위해 많은 논문에서 사용되었습니다[17,20] . 시가 독소 1형(Stx1)을 주사한 생쥐는 근위세뇨관에 의한 포도당 재흡수 감소를 나타내는 당뇨병을 나타냈습니다[21]. 이는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 근위 세뇨관에 대한 Stxs 독성을 시사합니다. STEC에 감염된 마우스 모델에서 조직병리학의 빈번한 발견은 관형 상피 세포의 괴사와 근위 세뇨관의 내강 내 탈락 세포입니다 [22-24]. 정제된 Stx(Stx1 또는 Stx2) 주사된 마우스는 또한 상대적으로 온전한 핵을 가진 근위 세뇨관의 탈락을 나타냅니다[25-27].

Stx 주입 또는 STEC 감염과 관련된 근위 세뇨관의 손상이 기능적으로나 조직학적으로 설명되었지만 근위 세뇨관 병변과 관련된 유전자 표적은 아직 표시되지 않았습니다.

여기에서 우리는 Stx2에 의해 유도된 근위 세뇨관 관련 유전자 변형을 보여주기 위해 Stx2-주사된 마우스 신장과 Stx{1}}처리된 인간 일차 신장 근위 세뇨관 상피 세포(RPTEC) 배양에서 유전자 발현을 분석했습니다.

2. 결과

2.1. Stx2-주사된 마우스 신장 병리학

Stx{0}}관련 쥐 신장 병리를 확인하기 위해 Stx2- 주사 마우스의 신장 조직 절편을 PAS(Periodic Acid-Schiff)로 염색했습니다. 세뇨관 상피 세포의 내강 측에 뚜렷하고 강한 분홍색 얼룩이 있는 것은 근위 세뇨관 세포의 특징인 브러시 경계의 당칼릭스를 나타냅니다. 우리는 이웃 세포 및 기저막(즉, 벗겨진 세포)에서 분리된 것으로서 글리코칼릭스 외부(내강 공간 내)의 세포/핵을 결정했습니다. 그림 1B(Stx2 후 8시간), C 및 D(Stx2 후 48시간)에서는 상대적으로 손상되지 않은 핵을 가진 벗겨진 세포가 화살표로 표시됩니다. 우리는 또한 근위 관형 루멘 내의 세포 파편을 관찰했습니다(그림 1화살촉). Stx2 투여 후 이러한 병변은 매우 명확하게 나타났지만 0시간(그림 1A, Stx2 없음)에서는 무시할 수 있었습니다.

그림 1. Stx2는 쥐의 신장에서 근위 관형 세포의 탈락을 유도합니다. Stx2- 주입된 쥐 신장 절편의 PAS(과요오드산 쉬프) 염색이 표시됩니다. (A) 0시간(순진), (B) 8시간 및 (C) Stx2 주입 후 48시간. 화살표는 근위 관형 세포가 벗겨지는 것을 나타냅니다. 화살촉은 세포 파편을 나타냅니다. (C) 내의 확대된 필드는 (D)에 화살표로 표시된 박리 세포와 함께 표시됩니다. (A–C)의 막대는 50μm를 나타냅니다. (D)의 눈금 막대는 10μ를 나타냅니다.

2.2. 마우스 및 인간 신장의 Gb3 발현

2.2.1. 마우스 신장 피질 Gb3 발현

근위 세뇨관 세포가 Stx2 모욕으로 인한 조직학적 손상을 나타냄에 따라 우리는 근위 세뇨관 마커인 아쿠아포린-1(AQP1)과 함께 쥐 신장 피질에서 Stx2 수용체 글로보트리아오실세라미드(Gb3) 발현을 테스트했습니다. 그림 2에 표시된 대로 AQP1-양성 세포는 주로 세포의 관강 측면에서 Gb3 양성을 나타냈습니다(세포는 닫힌 화살촉으로 표시되고, 관강은 별표로 표시됨). 우리는 또한 보고된 바와 같이 AQP1 음성 관형 Gb3 염색이 아마도 덕트 세포를 수집하는 것으로 추정됩니다(그림 2 열린 화살촉). Gb3 염색의 강도는 AQP1(-) 세포에서 더 강했지만, 이러한 유형의 세뇨관 수는 피질의 Gb3/AQP1 이중 양성 근위 세뇨관에 비해 적었습니다. CD31-양성 내피 세포는 마우스 신장에서 Gb3 음성입니다. Gb3(래트 IgM)에 대한 이소형 일치 항체 대조군을 음성 대조군으로 사용했습니다. 쥐 IgM은 마우스 신장 조직과 반응하지 않았습니다 (그림 S1)

2.2.2. 인간 신장 피질 Gb3 발현

인간 신장 조직에서 Gb3는 AQP1-양성 근위세뇨관에서도 양성이었습니다(그림 3, 닫힌 화살촉). 근위 관형 세포 내의 Gb3의 위치는 관강 측에서 더 강했습니다. 우리는 또한 쥐 조직에서와 마찬가지로 AQP1(-)Gb3(+) 세포(그림 3, 열린 화살촉)를 관찰했습니다. 인간 내피 세포는 Gb3(CD31/Gb3 이중 양성, 그림 3, 별표)을 발현합니다. 쥐 IgM이 포함된 Isotype 대조 섹션은 인간 신장 조직에서 양성 반응을 나타내지 않았습니다(그림 S2).

2.3. 마이크로어레이 분석

마우스와 인간 근위 세뇨관 상피 세포는 모두 Gb3 양성이므로 이 세포 유형이 Stx2에 의해 직접적으로 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 쥐과 인간 근위 세뇨관 세포 모두에서 Stx2-에 영향을 미치는 유전자를 확인하기 위해 우리는 Stx2-주사한 마우스와 Stx2-처리된 인간 1차 RPTEC의 신장에서 총 RNA를 추출하고 분석했습니다. 마이크로어레이에 의한 유전자 발현

2.3.1. 마우스 신장과 RPTEC 모두에서 차별적으로 발현되는 유전자

마우스 신장과 RPTEC 모두에 공통적인 차별적으로 발현된 유전자(DEG)가 선택되었습니다. 일반적인 DEG를 선택하는 기본은 (1) 마우스 신장과 RPTEC 마이크로어레이 둘 다에서 적어도 하나의 로그2-배 변화(0 h에 대해)가 1보다 크거나 -1보다 작은 유전자입니다. 시점 및 (2) 유전자의 로그2-배 변화 분포는 신장 마이크로어레이의 시간 경과 중간에 유전자 발현 피크를 더 잘 수용하기 위해 2차 곡선이 아닌 3차 곡선에 적합합니다. 위의 두 가지 기준을 사용하여 Stx2- 처리된 마우스 신장과 인간 RPTEC 사이의 58개 공통 유전자를 선택했습니다(그림 4A). 마우스 신장에서 이러한 58개 유전자의 발현 패턴이 히트맵에 표시됩니다(그림 4B). 대부분의 유전자는 Stx2 주입 후 나중에 시간에 상향 조절되었습니다. 그러나 일부 유전자는 초기 발현 패턴을 가지고 있었습니다. 각 시점마다 로그2-배 변화가 1개 이상인 유전자가 나열되었습니다(표 1).

그림 4. 마이크로어레이 분석. (A) 마이크로어레이로 분석한 유전자 중 Stx2- 처리된 마우스 신장과 RPTEC에서 각각 147개의 유전자(녹색 원)와 4013개의 유전자(빨간색 원)가 log{ {4}}-1보다 작거나 1보다 큰 변화. 두 마이크로어레이(일반적으로 차별적으로 발현되는 유전자/DEG)에서 0 h에 대한 Stx2 처리에 의해 변경된 유전자는 총 58개(빨간색과 녹색이 겹치는 영역)입니다. (B) 공통 58개 유전자의 히트맵이 마우스 신장 샘플링 타임라인에 표시됩니다. Z=0는 유전자의 로그2-배 변화 값의 평균을 나타내며 유전자 발현 추세를 반영합니다. 따라서 녹색을 띤 색상은 연속된 특정 유전자의 평균보다 낮은 값을 나타내고, 붉은 색은 평균 이상의 변화를 나타냅니다. 0시간과 비교한 PBS 주입 72시간 데이터세트의 58개 유전자의 로그 접기 데이터는 참조용으로 표 S3에 표시되어 있습니다. (C) Metascape GO 농축 막대 그래프가 표시됩니다. X축은 58개의 공통 DEG에 걸쳐 강화된 GO 용어의 -log10 p 값을 보여 주며, 강화된 GO 용어의 수가 많을수록 시스템과 더 관련이 있을 가능성이 높습니다. 상위 20개의 강화된 GO 용어가 표시됩니다. (D) 58개의 공통 DEG에 대한 STRING 분석은 가장 많이 연결된/관련 클러스터 6개에 표시됩니다. 구형 색상은 동일한 클러스터에 속하는 유전자를 나타냅니다. 유전자 간의 작용 관계는 색상 및 끝 모양으로 구분되어 표시됩니다. ENSG00000279576은 이제 ENSP00000485396으로 코딩되었으며 이는 MALAT1 유전자의 인간 ID를 나타냅니다.

일반적인 DEG의 기능을 분석하기 위해 Metascape 플랫폼을 사용했습니다. 분자 기능, 세포 구성 요소, 생물학적 과정으로 구성된 GO(Gene Ontology) 용어를 선택된 유전자에 할당합니다. 우리는 공통 58 DEG를 Metascape에 기탁하고 이러한 DEG가 속하는 상위 20개 GO 용어를 얻었습니다(그림 4C). GO 용어는 표 S1에 해당 유전자와 함께 나열되어 있습니다. 그림 4C에 표시된 각 GO 용어 내의 유전자 목록을 보려면 표 S2 Metascape 농축을 참조하십시오. 세포 사멸, 염증 및 신호 전달 계통과 관련된 GO 용어는 예상대로 상위 20위 안에 들었습니다. 그러나 일주기 리듬은 새로운 GO 용어로 주목을 받았습니다. 공통 유전자의 알려진 연결은 STRING 분석을 통해 표시되었습니다(그림 4D). 이 분석에서 유전자는 유전자의 결합, 영향(촉매, 활성화 또는 억제) 및 공동 발현의 강력한 연관성을 설명하는 6개의 다른 그룹으로 분류되었습니다.

2.3.2. 유전자 발현 동향

여러 유전자 발현의 흔적은 Stx2 주입 후 시간(h)에 대한 x축과 0h에 대한 로그2-배 변화에 대한 y축이 있는 그래프로 표시됩니다(그림 5). 따라서 y축 값이 1과 같다는 것은 2-배 변화 대 0 h 표현식을 의미합니다.

그림 5. 마우스 샘플링 타임라인에 따라 차별적으로 발현된 유전자. (A) PDK4 및 CEBPB mRNA 발현 패턴이 표시됩니다. (B) 직전 유전자. (C) 모세포 단백질 CYR61(CCN1) 및 CTGF(CCN2) 발현. (D) UPR 관련 유전자 DDIT3(CHOP, GADD153), DDIT3 결합 파트너 CEBPB 및 음성 피드백 인자 PPP1R15A(GADD34)가 표시됩니다. (E) 전사 인자 DDIT3(CHOP, GADD153)과 이들 인자에 의해 전사적으로 조절되는 ATF3 및 GDF15가 표시됩니다. (F) UPR 및 RSR 관련 유전자가 표시됩니다. (G) UPR 유전자와 관련된 EDN1이 그려져 있습니다. (H) EDN1 및 EGR1의 초기 피크와 PER1의 다음 피크는 세 유전자 모두에서 나중에 점진적인 증가로 표시됩니다. (I) 그림 4D 보라색 클러스터의 유전자는 일주기 리듬 관련 유전자입니다. (J) 일주기 핵심 유전자 PER1, Arntl(BMAL1), Cry1 및 Clock이 표시됩니다. (K) PER1 및 일주기 시계 조절 신장 유전자가 표시됩니다. (L) NF-kB 경로 관련 유전자를 가진 염증성 유전자가 표시됩니다. 개별 log2 데이터 포인트를 보려면 보충 그림 S4를 참조하십시오. 표준 편차 막대가 있는 평균 log2를 보여주는 그림 S5는 참고 자료로 제시됩니다.

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