Cistanche Tubulosa Ⅲ 유래 Sucrose Synthase의 유전자 클로닝, 기능 동정, 구조 및 발현 분석

4 가뭄 스트레스 하에서 Cistanche tubeulosa 및 세포 배양 시스템의 여러 부분에서 CtSus의 발현 분석

4.1 Cistanche tubeulosa의 다양한 부위에서 CtSus의 발현 분석

시험관 내에서 전체 세포 형질전환 실험과 효소 촉매 반응 실험을 통해 CtSus 유전자에 의해 암호화된 단백질이 UDP-포도당 합성을 촉매할 수 있음이 확인되었습니다. 이 유전자와 Cistanche tubeulosa에서 배당체 화합물의 생합성 사이의 상관관계를 더 조사하기 위해 Cistanche tubeulosa의 여러 부분에서 이 유전자의 발현 수준을 분석했습니다.

10-98% 에키나코사이드가 함유된 고품질 시스탄체 허브

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>공중 부분; 그 중 하우스토리아의 에키나코사이드 함량이 가장 높습니다.

실시간 형광 정량 PCR은 Cistanche tubeulosa의 여러 부위의 cDNA를 주형으로 하여 수행하였고, 그 결과를 2-ΔΔCT 방법으로 분석하여 미분분석을 수행하였다. 결과는 그림 4A에 표시됩니다. haustoria에서 CtSus 유전자의 발현 수준은 공중 부분의 1.5배로 가장 높았으며, 지하 부분의 발현 수준이 공중 부분에 비해 유의하게 높았으며 이는 페닐에타노이드 배당체의 축적 패턴과 일치합니다. Cistanche tubeulosa의 여러 부분에서 echinacoside로 표시됩니다.

그림 4 PEG6000으로 처리된 C. tubeulosa 및 현탁 세포의 여러 부분에서 CtSus의 상대적인 발현 수준. A: C. tubeulosa의 다양한 부분에서 CtSus의 상대적 발현 수준; B: 다양한 시점에서 PEG6000으로 처리된 C. tubeulosa 현탁 세포에서 CtSus의 상대적 발현 수준. n=3, 𝑥̅± s.*P < 0.05,***P < 0.001

4.2 가뭄 스트레스 조건에서 Cistanche Deserticola 현탁 세포의 CtSus 발현 분석

이 프로젝트에 대한 예비 연구에서는 PEG6000에 의해 유발된 가뭄 스트레스가 Cistanche Deserticola 현탁 세포에서 페닐에탄올 배당체의 축적을 크게 증가시킬 수 있음을 보여주었습니다. 유도 후 3~9일에 에키나세아사이드 함량이 크게 증가했습니다. 12일부터 15일까지 에키나코사이드 함량의 증가율이 둔화되어 15일에 최대치에 도달했습니다. 그리고 배양시간이 길어질수록 에키나코사이드 함량이 유의하게 증가하였다. 프럭토사이드 함량은 점차 감소했습니다[24]. 이러한 연구를 바탕으로 본 논문에서는 처리되지 않은 Cistanche Deserticola 현탁 세포와 PEG6000- 유도 Cistanche Deserticola 현탁 세포의 cDNA를 템플릿으로 사용하여 실시간 형광 정량 PCR 검출을 수행하여 Cistanche Deserticola 현탁 세포의 CtSus 유전자를 조사했습니다. 가뭄 스트레스 조건. 발현 수준의 변화. 결과는 그림 4B에 표시됩니다. PEG6000으로 유도된 Cistanche Deserticola 현탁세포에서는 유도 후 6일째에 CtSus의 발현이 유의하게 증가하였고, 9일째에 최고치에 도달한 후 대조군과 동일한 수준으로 감소하였다. 같은 레벨의 그룹. 위의 결과는 가뭄 스트레스가 Cistanche Deserticola 현탁 세포주에서 CtSus 유전자의 발현을 크게 증가시킬 수 있음을 보여 주며, 이는 가뭄 스트레스 하에서 에키나세아사이드의 축적 패턴과 일치합니다. 그러나 CtSus 유전자의 최고 발현은 에키나세아사이드 함량의 최고치보다 일찍 나타나는데, 그 이유는 CtSus 촉매작용에 의해 합성된 활성 글리코실 공여자가 에키나세아사이드의 후속 생합성 경로에서 다단계 글리코실화 반응에 필요한 중요한 전구체이기 때문입니다. , 가뭄 스트레스를 받은 후 유기체는 1차 대사와 관련된 유전자를 우선적으로 동원하여 활성 기증자의 축적을 달성한 다음 대사 산물의 중요한 2차 대사 축적을 달성할 것으로 추측됩니다.

5 CtSus 단백질의 3차원 구조 연구 및 주요 활성 부위 분석

글리코실 공여체 UDP-글루코스의 생산을 촉매하는 CtSus의 기능을 기반으로 CtSus 촉매 활성의 구조적 기초를 추가로 연구했습니다. 온라인 도구인 SOPMA를 사용하여 단백질의 2차 구조를 예측했습니다. 결과는 CtSus의 2차 구조가 55.28% α나선, 25.47% 무작위 코일, 12.80% 확장 가닥 및 6.46% 회전을 포함하고 있음을 보여주었습니다(그림 5A). 이는 α나선이 CtSus 단백질에서 가장 중요한 2차 구조 단위임을 나타냅니다. 그 다음에는 단백질의 큰 부분을 차지하는 무작위 코일이 뒤따릅니다. 확장된 가닥과 회전은 단백질 전체에 분포됩니다. 기존 연구에 따르면 수크로스 합성효소는 일반적으로 사량체 형태로 존재하는데, 이는 활성 형태로 간주된다. 따라서 본 논문에서는 AlphaFold2를 추가로 사용하여 CtSus 단백질의 구조를 예측하고 단백질 사량체의 3차원 구조를 얻었습니다. PDB(단백질 데이터 뱅크) 데이터베이스 비교를 통해 Arabidopsis thaliana 자당 신타제 AtSus1(PDBID 3S28)과 CtSus 사이의 서열 유사성이 77.93%에 도달할 수 있음을 발견했습니다. 예측된 CtSus 구조를 AtSus1 3차원 구조와 비교한 결과, 단백질 중첩 후 RMSD(제곱평균제곱근 편차) 값이 1.11Å으로 두 구조의 공간 구조가 매우 일치함을 나타냅니다(그림 5B).

그림 5 CtSus의 구조적 조사. A: SOPMA.Blue를 사용하여 예측된 CtSus의 2차 구조: 나선; 보라색: 무작위 코일; 빨간색: 확장된 가닥; 녹색: 시트. B: AtSus1(파란색)과 CtSus(녹색)의 3차원 구조 정렬. 둘 다 사량체로 표시되었습니다. C: AtSus1(파란색) 및 CtSus(표지된 잔기가 있는 녹색)의 기질 결합 포켓에 있는 주요 잔기; D: AtSus1(파란색) 및 CtSus(녹색)에서 UDP와 과당의 결합 형태 정렬; E: Discovery Studio 클라이언트에서 분석한 2D 다이어그램에 표시된 UDP와 CtSus 간의 상호 작용

UDP 및 과당을 포함하는 Arabidopsis AtSus1의 보고된 단백질-리간드 결정 복합체 구조(PDBID3S29)는 UDP 및 과당과 CtSus의 결합 모드를 분석하기 위한 템플릿으로 사용되었습니다. 분자 도킹 결과는 그림 5C에 표시됩니다. AtSus1과 CtSus의 기질 결합 포켓은 아미노산 유형, 공간 분포 및 구성 측면에서 매우 유사하고 중첩도가 높음을 관찰할 수 있으며, 이는 수크로스 신타제의 서열이 식물에서 고도로 보존되어 있음을 증명합니다. 단백질 기질 결합 포켓에 있는 두 개의 리간드인 UDP와 과당의 형태가 그림 5D에 나와 있습니다. UDP 및 CtSus의 분자 도킹 가장 유리한 형태는 AtSus1-UDP 결정 복합체의 UDP 형태와 잘 겹쳐서 분자 도킹 결과의 정확성을 입증합니다. UDP와 단백질 기질 결합 포켓의 주요 아미노산 잔기 사이의 상호 작용은 그림 5E에 나와 있습니다. UDP와 CtSus는 주로 수소 결합과 소수성 상호 작용에 의해 서로 결합되어 있습니다. 기질 결합 포켓의 주요 아미노산 잔기는 Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 및 Glu681을 포함합니다.

논의

글리코실화 변형은 천연물이나 약물 전구체의 물리적 특성과 생물학적 활성을 개선하는 중요한 수단 중 하나입니다. 전통적인 화학적 방법과 비교하여, 효소적 글리코실화 변형은 온화한 반응 조건, 강력한 선택성 및 환경 친화성의 장점을 가지고 있습니다. 그러나 글리코실트랜스퍼라제의 글리코실화 반응에는 많은 양의 UDP-당 공여자가 필요하며, 이는 가격이 비싸고 구하기 어려워 글리코실트랜스퍼라제를 산업적 생산에 널리 사용할 수 없다는 문제가 있다. 자당 합성효소는 자당 + UDP ⇌ UDP-포도당 + 과당이라는 가역 반응을 촉매할 수 있으며 글리코실트랜스퍼라제와의 결합 반응을 통해 재생 가능한 UDP-포도당 순환을 형성할 수 있습니다. Cistanche tubeulosa는 페닐에탄올 글리코시드 화합물로 대표되는 다양한 구조 유형의 다양한 글리코시드 화합물이 풍부하며, 이는 자당 합성 효소와 관련된 체내 활성 글리코실 공여체 합성 경로가 강력한 신진대사를 가지고 있음을 시사하지만 Cistanche 식물의 관련 자당 합성 효소는 그렇지 않음을 시사합니다. 보고되었습니다. 이 연구에서는 자당 합성효소 유전자 CtSus가 처음으로 Cistanche tubeulosa에서 복제되었습니다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 식물 자당 합성효소의 보존된 도메인을 포함합니다. 다른 식물의 수크로스 합성효소의 서열을 비교한 결과, 동일한 목의 식물의 수크로스 합성효소와 아미노산 서열 유사성이 90% 이상인 것으로 나타났는데, 이는 식물의 수크로스 합성효소의 서열 보존 정도가 높다는 것을 의미한다. 분자 진화 분석에 따르면 CtSus는 쌍자엽 식물 수크로스 신타제 가지에 속하며 Orobanchaceae 계통의 P. ramosa의 자당 신타제 PrSus와 가장 밀접하게 관련되어 있음이 나타났습니다.

CtSus의 촉매 활성을 조사하기 위해 이 연구는 이전에 연구 그룹에서 활성이 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGT71BD1을 결합하여 이중 플라스미드 공동 발현 시스템을 구축했습니다. 전세포 촉매 실험을 통해 추가적인 UDP-당 공여체를 추가하지 않고도 조건을 달성했습니다. 쿠마린 화합물인 계피와 스틸벤 화합물인 레스베라트롤의 글리코실화 반응. 대조군과 비교하여 CtSus 첨가는 UGT71BD1-촉매된 글리코실화 반응의 전환율을 크게 증가시켰습니다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 CtSus 재조합 발현 플라스미드를 추가로 구축하고 대장균에서 재조합 단백질의 가용성 발현을 달성했습니다. 시험관 내에서 효소 촉매 반응을 통해 수크로스와 UDP가 존재하는 경우 CtSus가 UDP-포도당 생성을 촉매할 수 있으며, 재조합 단백질에 포함된 유발 인자 친화성 태그가 제거된 후 CtSus 생성물이 UDP 생성을 촉매하는 것으로 나타났습니다. -포도당이 얻어집니다. 속도가 크게 향상되었습니다. 전체 세포 형질전환 및 시험관 내 효소 촉매 반응 결과를 통해 CtSus의 자당 합성 효소 촉매 활성 설탕 공여체 UDP-포도당의 활성이 확인되었습니다. CtSus 유전자와 Cistanche tuberosum의 배당체 생합성 사이의 상관 관계를 더 조사하기 위해 Cistanche tuberosum의 여러 부분에서 CtSus의 발현을 실시간 형광 정량 PCR 실험으로 분석했습니다. 그 결과, 해당 유전자는 Cistanche tuberosum의 흡기(haustoria)에서 발현되는 것으로 나타났다. 가장 높은 표현 수준. Cistanche Deserticola는 기생 식물로 광합성을 통해 성장과 발달에 필요한 영양분을 얻을 수 없습니다. 따라서 숙주 식물의 뿌리에 기생하며 성장을 유지하기 위해 영양분을 얻기 위해 숙주 식물에 의존해야 합니다. 식물에서 자당은 대부분 에너지와 탄소원 기증자를 제공합니다 [12]. 그러나 자당은 세포에서 직접 사용할 수 없으며 추가로 분해되어야 합니다. 하우스토리아는 Cistanche Deserticola와 숙주 식물을 연결하는 다리이며 성장 과정에서 중요한 역할을 합니다. 중대한

따라서 Cistanche Deserticola의 haustoria에서 sucrose synthase의 높은 발현은 합리적입니다. 하우토리아에서 CtSus의 높은 발현은 또한 하우토리아의 페닐에타노이드 배당체의 큰 축적 패턴과 일치합니다. 또한, 가뭄 스트레스 하에서 각기 다른 시점에 Cistanche Deserticola 현탁 세포의 CtSus 유전자 발현 수준 변화를 형광 정량적 PCR 분석을 통해 가뭄 스트레스가 현탁 세포주에서 CtSus 유전자의 발현을 유의하게 증가시킬 수 있음을 확인했습니다. 에키네시아사이드와 일치합니다. 가뭄 스트레스 하에서 현탁 세포주의 축적 패턴은 일관됩니다. 위의 결과는 CtSus가 생체 내 Cistanche Tulipis에서 에키네시아로 대표되는 페닐에타노이드 배당체의 생합성 경로에 관여함을 시사합니다. 이는 많은 생합성 경로 중 하나입니다. 첫 번째 단계 글리코실화 반응은 활성 글리코실 공여체 UDP-글루코스를 제공합니다. 간단히 말해서, 이 연구는

이 연구에서는 활성 글리코실 공여체의 시험관 내 효소 합성을 가능하게 하고 Cistanche Deserticola 배당체의 생합성을 위한 엔지니어링 박테리아 구축을 위한 새로운 유전 요소를 제공하는 Cistanche Deserticola에서 새로운 수크로스 합성 효소 유전자를 확인했습니다.

저자 기여: Tian Weisheng은 생물정보학 분석, 발현 분석, 효소 활성 분석 및 CtSus 유전자 초안 작성을 담당했습니다. Yan Yaru는 유전자 검사 및 복제를 담당했습니다. Cui Xiaoxue와 Huang Wenqian은 생물정보학 분석 및 발현 분석에 참여했습니다. Wang Yingxia와 Zhao Saijing은 벡터 구축 및 효소 활성 분석에 참여했습니다. Li Jun과 Shi Shepo는 주로 효소 활성 분석 및 발현 분석을 안내했습니다. Tu Pengfei와 Liu Xiao는 논문 아이디어 디자인, 실험 안내, 논문 작성 및 수정을 담당했습니다. 모든 저자가 논문 수정에 참여했습니다.

참고자료

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