Laminaria Japonica Fucoidan과 Cistanche Tubulosa 추출물의 시너지 항염증 효과
Apr 17, 2024
외부 항원에 대한 면역 반응으로 대식세포는 종양괴사인자-(TNF-), 인터루킨{3}}(IL{4}}), IL-6 등과 같은 전염증성 사이토카인을 방출합니다. 이러한 사이토카인은 손상된 조직에 과립구, 단핵구, 림프구 및 비만세포의 화학주성 유입을 유도하여 항원 제거 및 조직 회복을 촉진합니다. 그러나 세포의 과도한 침투와 활성화는 조직 손상을 악화시켜 잘 알려진 염증 현상인 부종(혈관 삼출)과 통증을 유발합니다.
TNF-는 여러 세포주에서 산화질소 합성효소(iNOS) 유전자 발현을 유도하는 중요한 요소입니다. iNOS 활성화는 살균 및 혈관 확장과 같은 여러 생리적 기능을 조절할 뿐만 아니라 염증을 유발하는 산화질소(NO) 생성을 유도합니다. 조직 손상 후, 세포막 인지질의 포스포리파제에 의한 분해로 인해 아라키돈산이 생성됩니다. 아라키돈산은 사이클로옥시게나제(COX)에 의해 프로스타글란딘(PG)으로 분해됩니다. COX-II에 의해 형성된 과도한 양의 PGE2는 염증을 위한 여러 사이토카인을 유도합니다. NO와 PGE2는 모두 염증과 통증 유발의 주요 요인으로 작용하므로 TNF--NO 및 COX-II-PGE2 경로는 코르티코스테로이드와 비스테로이드성 약물에 의해 억제되는 염증 과정의 주요 흐름입니다.항염증제(NSAID), 각각.
여러 가지 스테로이드와 NSAID가 있음에도 불구하고염증성 질환의 치료, 이러한 약물은 면역체계, 위장관, 신장, 간, 중추신경계, 혈압 및 심혈관계에 부작용을 일으킬 수 있습니다. 따라서 화학적 치료제를 대체하거나 천연물과 병용하여 부작용을 최소화하는 것이 필요하다.
후코이단은 여러 나라에 널리 분포하는 Laminaria japonica, Cladosiphon okamuranus 등의 해조류에서 추출한 황산다당체 복합체로 오랫동안 한의학에서 치료제로 사용되어 왔습니다. 이전 연구에서 후코이단은 항산화, 항응고, 항암,항염증 활동. 따라서 염증성 질환, 허혈, 면역 기능 장애 및 종양에 대한 후코이단의 유익한 효과가 연구자들의 관심을 끌고 있습니다. 반면에,시스탄체 튜불로사(CT)는 중국에서도 전통적인 약재로 널리 사용되어 왔습니다. CT 추출물은 염증 경로에서 NO 생성의 주요 요인인 TNF-α와 IL{1}}의 생성을 감소시키는 것으로 보고되었습니다[19].
이러한 이전 연구 결과를 통해 우리는 염증의 2가지 주요 경로에 대한 후코이단과 CT 추출물의 조합 효능을 조사하게 되었습니다. 작용 메커니즘을 밝히기 위해 카라기난으로 유발된 공기 주머니 염증으로 인한 삼출물에서 NO와 PGE2를 분석했습니다.
예방을 위한 천연 시스탄체 투불로사염증성 활동PHGS75% ECH 30% ACT 12%
재료 및 방법
재료
반정제 후코이단과 CT 물 추출물은 Misuba RTech Co., Ltd.(한국 아산)에서 구입했습니다. 후코이단과 CT추출물을 4도 유지한 후 정제수에 1:3으로 용해시켜 사용하였고, 5mL/kg의 용량으로 경구투여하였다.
세포 배양 및 NO 정량화
쥐 대식세포 RAW 264.7 세포주는 American Type Culture Collection(Manassas, USA)에서 구입하여 10% 소태아혈청과 항생제(100 U/mL)를 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Sigma, St. Louis, USA)에서 배양하였다. 페니실린(Sigma) 및 100μg/mL 스트렙토마이신(Sigma)]. 세포를 37도의 가습된 5% CO2 대기에서 배양했습니다.
후코이단과 CT 추출물이 NO 분비에 미치는 영향을 평가하기 위해 RAW 264.7 세포(1×1{19}}6 세포/mL)를 후코이단 또는 CT 추출물(1~320μg/mL)과 함께 5분간 배양했습니다. , 이어서 인터페론-(IFN-, 10 U/mL) 및 지질다당류(LPS, 10 µg/mL)를 24시간 동안 유지했습니다. 우리의 예비 연구에서 RAW 264.7 세포의 활성화를 위해 IFN-+ LPS를 처리한 경우 최대 24시간까지 세포의 생존력에 영향을 미치지 않았으며 후코이단과 CT 추출물은 최대 1mg/mL까지 세포독성이 없는 것으로 확인되었습니다. NO의 지표로 NO의 산화생성물인 아질산염(NO2 – )의 농도를 측정하였습니다. 배양 배지를 동량의 Griess 시약(2.5% 인산에 1% 설파닐아미드, 0.1% 나프틸 에틸렌디아민)과 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 아질산염 농도는 540nm에서 분석되었으며, 여기서 NaNO2는 표준 곡선을 생성하는 데 사용되었습니다.
동물과 치료
수컷 ICR 마우스(7주령)는 대한바이오링크(한국 음성)에서 구입하여 일정한 환경조건(22±2°C, 40-70% 상대습도, 12-시간 빛)이 유지되는 방에 사육하였다. - 어두운 주기; 150-300 럭스 밝기). 펠릿 공급물과 정제수는 자유롭게 이용 가능했습니다. 모든 동물 실험은 충북대학교(CBNU) 동물실험연구위원회(IACUC)의 승인을 받았으며, 충북대학교 실험동물연구센터의 표준작업절차(SOP)에 따라 수행되었습니다.
쥐(n=8/그룹)에게 후코이단(18 또는 54 mg/kg), CT 추출물(54 또는 162 mg/kg) 또는 이들의 혼합물(18+54, {{6 }} 또는 90+270 mg/kg) 7일 동안 하루에 한 번. 저용량 후코이단(18 mg/kg)과 CT 추출물(54 mg/kg)은 체중(Km{14)의 표면적 환산 후 인간의 추정 복용량 100 mg/body(70 kg) 및 300 mg/body에서 나온 것입니다. }} 인간의 경우/Km=3 마우스의 경우). 최대의 시너지 효과를 평가하기 위해 고용량의 후코이단과 CT 추출물을 단독 또는 혼합으로 3배로 설정하고, 최고 용량의 혼합물을 5배로 고정했습니다.
후코이단 및 CT 추출물 처리 1일째에 생쥐의 뒷면에 멸균 공기 10mL를 피하 주사하여 파우치를 형성했습니다[22,23]. 2일과 5일 후, 파우치에 공기 5mL를 다시 주입했습니다. 최종 처리 1시간 후, 카라기난(1% in saline, Sigma) 또는 그 부형제(saline) 1 mL를 파우치에 주입하였다.
삼출물 분석
카라기난 주입 6시간 후 공기 주머니를 차가운 식염수 1mL로 세척하고 세척액의 순 부피를 기록했습니다. 콜터 카운터(coulter counter)를 사용하여 염증 세포, 호중구, 단핵구 및 림프구의 총 수를 결정했습니다. NO 및 PGE2의 농도는 각각 Correlate-EIA 키트(Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA)를 사용하여 Griess 시약(Sigma) 및 효소 면역검정(EIA)으로 측정했습니다.
염증성 세포 주화성 PHGS75% ECH 30% ACT 12%에 대한 차단 작용을 위한 천연 CISTANCHE TUBULOSA
조직병리학적 검사
파우치 라이닝 조직을 제거하고 중성 포르말린 용액에 고정했습니다. 파라핀 포매 조직 슬라이드를 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 광학 현미경으로 염증 병변을 검사했습니다.
통계 분석
결과는 평균±SE로 표시됩니다. 실험 그룹 비교는 일원 분산 분석에 이어 Tukey 테스트 수정을 통해 이루어졌습니다. AP 가치<0.05 was considered statistically significant.
결과
시험관 내에서 RAW 264.7 세포 배양, IFN- 및 LPS 처리는 NO 생성을 크게 증가시켰습니다(그림 1). 후코이단(1–320 µg/mL)을 사용한 전처리는 대식세포 세포주에서 NO 방출에 영향을 미치지 않았습니다(그림 1A). 이에 비해 CT 추출물(32~320 µg/mL)은 NO 생성을 크게 억제하여 항염증 활성을 나타냅니다(그림 1B).
마우스 에어 파우치에 카라기난을 주입하면 파우치 내의 삼출물량이 현저히 증가했습니다(그림 2). 이러한 증가된 삼출물은 후코이단(18 mg/kg)과 CT 추출물(54 및 162 mg/kg)로 처리하여 약화되었습니다. 특히, 후코이단과 CT 추출물의 병용 치료는 개별 효과에 비해 삼출량을 더욱 감소시켰지만, 고용량 조합(54+162 mg/kg 및 90+270 mg/kg)에서는 추가 효능을 나타내지 않았습니다. 최저 용량 조합(18+54 mg/kg)으로 변경합니다(그림 2A). 파우치 내 N도 함량도 카라기난 주입 후 급격히 증가했습니다(그림 2B). 후코이단의 약한 효과와 비교하여, CT 추출물은 N도 농도를 현저히 낮췄습니다. 후코이단과 CT 추출물의 병용 처리는 복용량 의존적으로 NO 수준을 더욱 감소시켰습니다. 유사하게, 증가된 PGE2 함량은 후코이단과 CT 추출물의 병용 요법에 의해 상승적으로 억제되었습니다(그림 2C).
파우치 내 염증 매개체와 병행하여, 카라기난 주사에 의해 염증 세포 수가 급격히 증가했습니다: 호중구, 단핵구 및 림프구에 대한 제어 수준은 각각 37.8배, 4.8배 및 24.1배였습니다(표 1). 그러나 후코이단과 CT 추출물은 염증 세포 침윤을 크게 감소시켰으며, 그 중 후코이단은 CT 추출물보다 다소 우수했습니다. 예상외로, 후코이단과 CT 추출물의 병용 투여에서는 염증 세포 침투에 대한 시너지 효과가 나타나지 않았습니다.
삼출물의 염증 세포 침윤에서 유추된 바와 같이, 공기 주머니를 둘러싼 피하 조직은 심각한 염증성 병변을 나타냈습니다(그림 3). 대조군 동물의 거의 정상적인 특징(그림 3A)과 비교하여 Carrageenan에 노출된 두꺼워진 피하 조직의 엄청나게 많은 세포가 관찰되었습니다(그림 3B). 이러한 염증성 병변은 후코이단(그림 3C 및 3D) 또는 CT 추출물(그림 3E 및 3F) 처리로 현저하게 약화되었습니다.
특히, 후코이단과 CT 추출물의 병용 요법으로 더 높은 항염증 효과를 얻었습니다(그림 3G-3I).
논의
생체 내 아라기난 유발 공기 주머니 염증 모델을 사용하여 설치류의 등에 공기를 주입하면 공동 표면에서 층화되는 세포의 증식이 유도되어 윤활막과 유사한 구조가 형성됩니다. 이 모델에서 카라기난 유발 염증 세포 침윤을 주입하면 삼출물이 증가했는데, 이는 혈관 누출을 나타냅니다. 공기 주머니는 국소적으로 축적되는 체액에서 쉽게 측정할 수 있는 염증 세포와 매개체의 저장고 역할을 합니다.
혈관 투과성을 유도할 수 있는 다양한 염증 매개체 중에서 NO와 PGE2가 많은 염증성 질환의 발병에 관여하는 주요 인자라는 것이 잘 알려져 있습니다. 그들은 또한 통증 유발 및 인식의 중재자로 알려져 있습니다. 염증 동안 TNF- 및/또는 LPS로 자극하여 다양한 세포 유형에서 발현되고 활성화되는 iNOS는 높고 지속적인 농도의 NO를 생성합니다. NO는 혈관 누출로 이어지는 혈관 확장과 같은 다양한 생리적 기능에서 중요한 조절 분자입니다. COX를 통해 아라키돈산에서 생성되는 PGE2는 많은 염증성 질환의 발병에 기여하며, 다양한 염증 자극에 반응하여 PGE2의 과잉 생산은 COX-II 수준의 상향 조절 및 염증 진행과 관련이 있습니다. 따라서 TNF- - NO 및 COX-II-PGE2 경로는 각각 iNOS(코르티코스테로이드) 및 COX(NSAID) 억제제에 의해 차단되는 염증 과정의 두 가지 주요 흐름으로 간주되었습니다.
염증성 질환 예방을 위한 천연 CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%
본 연구에서 후코이단과 CT 추출물을 함께 투여하면 파우치의 삼출물량이 감소하여 혈관 누출에 대한 억제 활성이 있음을 시사합니다(그림 2A). 각 후코이단과 CT 추출물의 개별 효과와 비교하여 병용 치료가 더욱 증가했는데, 이는 2도의 복합 효과가 시너지 효과를 발휘한다는 것을 의미합니다. 후코이단과 CT 추출물 사이의 이러한 시너지 효과는 삼출물 내 NO 및 PGE2 수준에 대한 이들의 활성에 의해 뒷받침되었습니다(그림 3B 및 2C).
그러나 흥미롭게도 후코이단은 시험관 내 분석에서 대식세포의 활성화를 직접적으로 억제하지 않는다는 것이 확인되었습니다(그림 1A). 유사하게, 생체 내 분석에서 NO 및 PGE2 축적에 대한 후코이단의 억제 잠재력은 CT 추출물의 억제 잠재력보다 상대적으로 낮았습니다(그림 2B 및 2C). 후코이단의 이러한 작용 메커니즘은 CT 추출물에 의한 세포의 직접적인 불활성화와 다릅니다(그림 1B). 이에 비해 후코이단은 파우치 내 염증 세포 침윤 억제에 높은 효능을 나타냈습니다(표 1). 후코이단은 호중구, 단핵구, 림프구가 카라기난 유발 조직 손상 부위로 이동하는 것을 차단하는 데 있어 CT 추출물보다 우수했습니다. 흥미롭게도 후코이단과 CT 추출물 사이의 서로 다른 작용 메커니즘을 나타내는 상승적인 항이동 효과는 없었습니다. 즉, 후코이단은 염증 세포의 침투를 차단하는 반면, CT 추출물은 세포의 활성화를 억제합니다.
다형핵 세포, 특히 호중구는 카라기난에 의해 유발된 급성 염증 부위에 동원되는 주요 세포 구성 요소입니다. 또한, 대식세포 및 림프구와 같은 염증 세포도 사이토카인을 분비하여 염증 과정에서 중심 역할을 합니다. 후코이단이나 CT 추출물로 전처리했을 때, 카라기난이 주입된 공기 주머니로 이동하는 백혈구 수가 현저히 억제되었습니다. 이 결과는 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드에서 얻을 수 있는 효과와 일치하지만 인도메타신을 포함한 NSAID에서는 얻을 수 없는 효과입니다. 따라서 후코이단과 CT 추출물은 부분적으로 스테로이드의 성질을 갖고 있는 것으로 추정됩니다.
염증세포 주화성에 대한 차단작용 외에도 CT 추출물은 대식세포의 활성화를 억제하는 것으로 나타났다. 이는 대식세포에 의해 생성되는 주요 염증 매개체인 NO에 대한 in vitro 및 in vivo 억제 작용으로 확인되었습니다. 따라서 대식세포에 대한 CT 추출물의 효과는 이들 세포에서 mRNA 발현의 억제 및/또는 iNOS 활성의 직접적인 억제로 인한 것일 수 있습니다.
PGE2도 주요 염증 매개체 중 하나입니다. 이는 COX 억제제인 NSAID에 의해 억제되는 조직 부종과 병행하여 증가합니다. Carrageenan은 파우치 삼출물에서 COX-II mRNA와 COX-II 단백질을 유도하여 PGE2 생산을 증가시킬 수 있습니다. 이 모델에서 카라기난은 PGE2의 양을 크게 증가시켰으며 CT 추출물에 의해 이는 실질적으로 억제되었습니다. 이 결과가 NSAID 인도메타신에 의해 얻을 수 있는 효과와 일치한다는 점이 흥미롭습니다. 따라서, CT 추출물은 NSAID의 추가적인 특성을 가지고 있는 것으로 추론된다. 종합하면, CT 추출물은 카라기난 유발 염증 모델에서 코르티코스테로이드와 NSAID 유사 효과를 모두 발휘했으며 후코이단은 코르티코스테로이드와 NSAID 유사 효과를 강화한 것으로 여겨집니다.CT 추출물의 항염증 효과염증세포 침투를 차단함으로써
정확한 작용 메커니즘을 정의하려면 추가 연구가 필요하지만, 후코이단과 CT 추출물의 혼합물은 카라기난 유발 공기 주머니 염증에서 TNF-NO 및 COX-II-PGE2 경로를 차단하여 염증 징후를 현저하게 약화시켰습니다. 이러한 발견은 후코이단과 CT 추출물의 병용 치료가 코르티코스테로이드 또는 NSAID에 반응하는 다양한 유형의 염증 완화를 위한 유망한 후보가 될 수 있다는 증거를 제공합니다.
염증성 질환 예방을 위한 천연 CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%
