카테킨으로 젖산 탈수소효소 A를 표적으로 하면 SNU620/5FU 위암 세포가 5-플루오로우라실 1부에 재민감화됩니다.
Mar 23, 2022
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추상적인:항암 치료에 대한 내성은 거의 모든 유형의 암에서 발생하며 암 치료에 큰 어려움이 됩니다. 5-플루오로우라실(5FU)은 위암에 대한 항암 요법의 1차 선택이지만 약물 내성으로 인해 그 효과가 제한적입니다. 최근, 에너지 생산을 위한 산화적 인산화보다 해당과정을 선호하는 Warburg 효과를 포함한 변경된 암 대사가 화학요법에 대한 내성을 조절하는 중추 기전으로 받아들여지고 있습니다. 이에 기존의 위암 세포주인 SNU620과 SNU620/5FU를 이용하여 5FU 내성 개선에 대한 항당분해제의 상세한 기전과 유용성을 조사하였다. 의해당과정 관련 효소, 예를 들어 lactate dehydrogenase A(LDHA)는 부모 SNU620 세포보다 해당 작용을 제한하기 위해 우리는 알려진 카테킨과 그 유도체를 조사했습니다.항염증및 에피갈로카테킨 갈레이트가 이전에 LDHA 발현의 억제제로 보고되었기 때문에 항암 천연물. 그 중 가장 단순한 화합물인 Catechin은 lactate 생성과 LDHA 활성 억제 효과가 가장 높았다. 또한, 5FU와 catechin의 조합은 SNU620/5FU 세포에서 추가적인 세포독성을 나타내어 활성산소종(ROS) 매개 세포자멸사를 유도하였다. 따라서 우리는 이러한 결과를 바탕으로 LDHA를 제한하여 5FU에 대한 내화학성을 감소시키는 새로운 보조제의 개발을 위한 후보로 카테킨을 제안한다.
키워드:5-플루오로우라실;내화학성; 해당과정; 젖산 탈수소효소; 카테킨
1. 소개
원발성 종양의 외과적 절제와 5-에피루비신, 시스플라틴, 플루오로우라실과 같은 플루오로우라실(5FU) 기반 복합 화학요법과 도세탁셀, 옥살리플라틴, 5FU[1 ,21 현재까지, thymidylate synthase를 억제하여 DNA 합성을 차단하는 uracil의 유사체인 5FU[3]는 위암 치료에 일반적으로 사용되는 화학요법 약물로 남아 있습니다[1, A4]. 그러나 항암제 내성과 관련된 원발성 또는 전이성 암의 재발로 인해 항암화학요법의 임상적 효능이 만족스럽지 못하였다[1,5].
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약물 활성화 또는 비활성화, DNA 손상 복구 기계, 약물 표적의 변형, 세포자멸사 경로의 비활성화, 자가포식 증가를 포함하여 여러 세포 과정이 화학내성의 기본 메커니즘으로 간주됩니다[6,7]. 암은 이질적이며 다양한 암은 에너지 대사를 위해 해당과정과 산화적 인산화를 모두 사용합니다[8]. 그러나 대사 재프로그래밍, 특히 비정상적 호기성 해당작용은 위암에서 5FU를 포함한 화학요법 약물에 대한 내성 발달에 핵심 역할을 하는 것으로 보고되었습니다[9]. 젖산 탈수소효소 A(LDHA)와 피루브산 탈수소효소 키나아제(PDK)는 피루브산에서 젖산을 생성하는 호기성 해당과정의 주요 조절자로 알려져 있습니다[10,11]. PDK의 확립된 억제제인 dichloroacetate의 조합은 5FU에 대한 감수성을 회복시킵니다[12]. 또한, pyruvate에서 lactate로의 전환을 촉매하는 핵심 효소인 LDHA는 위암 치료의 잠재적 표적으로 보고되고 있다[13,14]. 암세포에서 LDHA 발현을 억제하면 미토콘드리아 호흡을 증가시키고 세포 생존력을 감소시켜 종양 형성을 억제합니다[15]. FX11, PSTMB 및 GSK 2837808A와 같은 여러 LDHA 억제제는 ATP 수준을 감소시키고 산화 스트레스를 생성하여 최종적으로 세포 사멸을 유발합니다[{14}}]. 연구에서 microRNA에 의한 LDHA 억제가 결장암에서 5FU에 대한 내성을 회복했음을 보여주었지만[19], 유전적 또는 약리학적 LDHA 억제제가 내화학성에 미치는 영향을 보고한 이전 연구는 없습니다.
카테킨(CA), 에피카테킨(EC), 갈로카테킨(GC), 에피갈로카테킨(EGC), 에피카테킨{0}갈레이트(ECG), 에피갈로카테킨{1}}갈레이트(EGCG)를 포함한 녹차 폴리페놀은 염증, 당뇨병, 심혈관 질환 및 악성 암을 포함한 여러 질병을 예방하고 치료함으로써 건강을 유지합니다[20,21]. 폴리페놀 중 EGCG는 AMPK 경로를 활성화하고 암 줄기세포성을 제한하여 대장암 및 간세포 암종 세포에서 5FU 화학 감수성을 향상시킵니다[22,23]. 또한 EGCG는 유방암과 췌장암 세포에서 LDHA의 발현을 억제하여 LDHA를 억제하는 것으로 보고되었습니다[24,25].
이 연구에서 우리는 CA가 위암 세포에서 5FU에 대한 내성을 감소시키는 보조제의 후보일 수 있다는 가설을 세웠다. LDHA 활성에 대한 CA 및/또는 5FU와의 조합의 억제 효과가 5FU 내성 세포에서 미토콘드리아 활성 산소 종(ROS) 및 세포 사멸을 유도하는 것으로 조사되었습니다.
2. 결과
2.1. 5FU-저항성 세포의 해당 특성
강화된 증식은 5FU-저항성 암세포를 포함한 내화학성의 특징이다[26,27]. 먼저 SNU620과 SNU620/5FU 세포의 5FU에 대한 내성과 장기 성장률을 확인했다. 이 세포를 표시된 농도의 5FU로 48시간 동안 배양했을 때 SNU620/5FU 세포(100.63μM)에서 50% 성장 억제(G150)를 일으키는 추정 용량은 모 SNU620 세포(28.88μM)에서 GIso를 유발하는 용량보다 훨씬 높았습니다. ) (그림 1A 및 보충 그림 S1). 또한 SNU620/5FU 세포의 성장률은 SNU620 세포의 성장률보다 빨랐습니다(그림 1B 및 보충 그림 S2). 내화학성 및 빠르게 성장하는 특성은 위암 세포의 증가된 해당 특성과 관련될 수 있기 때문에[28] 잘 알려진 oxamate 존재하에서 두 세포에서 세포외 산성화율(ECAR)과 산소 소모율(OCR)을 측정했습니다. 해당과정 억제제, 그렇지 않습니다. 결과는 SNU620/5FU 세포가 SNU620 세포에서 분비된 것보다 더 많은 젖산을 유의하게 분비하고 이어서 배양 배지를 산성화함을 입증했습니다(그림 1C 및 보충 그림 S3). 그러나, 이들 세포 사이에 OCR의 유의한 변화는 관찰되지 않았다(도 1D). LDHA의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 측정하였다. LDHA 발현은 SNU620 세포보다 SNU620/5FU 세포에서 더 높았다(그림 1E, F). 또한 PDK 이소타입의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 조사한 결과 PDK2 및 PDK3의 발현 수준이 SNU620 세포보다 SNU620/5FU 세포에서 더 높다는 것을 발견했습니다(보충 그림 S4A, B). PDK에 의해 증가된 피루브산 탈수소효소(PDHA1)의 E1 소단위체의 인산화도 평가되었으며, SNU620 세포보다 SNU620/5FU 세포에서 더 높은 것으로 밝혀졌습니다(보충 그림 S4C). 옥사메이트는 SNU620/5FU 세포에서 5FU 내성을 극복하기 위한 LDHA 억제제로 사용됩니다. 이 화합물은 SNU620 및 SNU620/5FU 세포 모두에서 세포 성장을 억제했습니다(보충 그림 S5). 또한, SNU620/5FU 세포에서 옥사메이트 또는 5FU를 사용한 개별 처리와 비교하여 옥사메이트와 5FU를 함께 처리한 경우 세포 성장이 억제되었습니다(그림 1G). 이러한 데이터는 SNU620/5FU 세포가 LDHA를 고도로 발현하고, LDHA 활성을 억제하면 5FU에 대한 SNU/5FU 세포의 내성을 극복할 수 있음을 시사한다.
그림 1. 결과에 따르면{1}} 플루오로우라실(5FU) 내성 세포는 높은 해당작용 특성을 나타냅니다. (A)SNU620 및 SNU620/5FU 세포는 표시된 농도의 5FU로 48시간 동안 처리했습니다. 이들 세포의 생존력은 MTT assay를 통해 평가하였고, (B) SNU620 및 SNU620/5FU 세포의 성장 수준은 MTT assay로 4일 동안 매일 측정하였고, (C,D)SNU620 및 SNU620/5FU 세포는 oxamate로 처리하였다( 5mM) 또는 아니 24시간 동안 ECAR 및 OCR 값을 Seahorse XF 분석기로 평가했습니다. (G) SNU620 및 SNU620/5FU 세포에 옥사메이트(25mM) 및/또는 5FU(10μM)를 48시간 동안 처리했습니다. 결과는 평균 ± SEM으로 표시됩니다.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
2.2. CA는 LDHA 활동을 억제합니다.
SNU620/5FU 세포에서 EC, GC, EGC, EGCG를 포함한 CA와 그 유도체로 젖산 생성을 분석하였다. 이러한 유도체와 비교하여 CA는 젖산 생산을 보다 효과적으로 감소시켰습니다(그림 2A). 또한, 시험관 내에서 LDHA 활성 분석법이 확인되었으며 CA는 그 유도체보다 LDHA 활성에 대한 더 강한 억제 효과를 보였다(그림 2B). 시험관 내 LDHA 및 LDHB 활성에 대한 CA의 억제 효과를 용량 의존적 방식으로 측정하였다. CA는 LDHB 활성에 영향을 미치지 않고 LDHA 활성을 억제했습니다(그림 2C, D). 또한 LDHA 및 LDHB 활성은 LDHA 활성을 억제하는 것으로 알려진 EGCG로 측정되었으며 용량 의존적으로 감소하는 것으로 나타났습니다(보충 그림 S6A, B). 또한, SNU620/5FU 세포에서 지시된 농도의 CA로 세포내 LDHA 및 LDHB 활성을 평가하였다. CA는 시험관 내 결과 용량 의존적 방식으로 LDHA 활성을 억제했지만 LDHB 활성은 억제하지 않았습니다(그림 2E, F). p-PDHA1, PDK2, PDK3 및 LDHA의 단백질 발현 수준은 CA 처리 후 SNU620/5FU 세포에서도 측정되었으며(보충 그림 S7) 이 처리의 영향을 받지 않는 것으로 관찰되었습니다. 이러한 결과는 CA가 발현에 영향을 미치지 않으면서 LDHA 활성을 조절함을 시사한다.
2.3. CA에 의한 LDHA 억제 작용 방식
CA 및 그 유도체에 대한 LDHA 활성의 억제 메커니즘을 분석하기 위해 우리는 인간 재조합 LDHA와 CA 사이의 결합 상호작용의 분자 모델링을 수행했습니다(그림 3A,B). 결과는 CA가 LDHA의 T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 및 T247의 잔기와 상호작용할 수 있음을 보여주었다. 그 중 R105, S136 및 R168은 기질(피루브산) 결합에 중요합니다. 따라서 우리는 CA가 기질 결합 부위를 방해할 수 있다고 가정했습니다. 반대로 EGCG는 다른 부위를 통해 LDHA와 결합합니다. CA에 의한 LDHA 억제 작용 방식을 추가로 확인하기 위해 다양한 농도의 피루브산 및 CA로 Michaelis-Menten 및 Lineweaver-Burk 플롯을 확인했습니다. LDHA 활성은 pyruvate 용량 의존적으로 증가했습니다. 그러나 CA의 증가로 역전되었습니다. 따라서 Michaelis-Menten 및 Lineweaver-Burk 플롯의 결과는 CA가 LDHA에 대한 비경쟁적 억제제임을 보여주었습니다(그림 3C, D). 또한 등온 적정 열량계(ITC) 데이터는 CA가 물리적으로 Kd에 의해 LDHA에 결합한다는 것을 보여주었습니다. 197 uM의 값(보충 그림 S8). 이러한 결과는 CA가 LDHA의 기질 결합 부위를 결합하여 LDHA 활성을 억제한다는 통찰력을 제공합니다.
2.4. CA, LDHA 활성 감소를 통해 5FU 내성 재감작
SNU620 및 SNU620/5FU 세포에 대한 CA의 세포독성 효과를 평가한 결과 CA가 두 세포 그룹에서 성장을 억제한다는 것을 발견했습니다(그림 4A). 성장 억제가 LDHA 활성 억제와 관련이 있음을 확인하기 위해 LDHA(shLDHA)에 대한 짧은 헤어핀 리보핵산(shRNA)에 의해 LDHA의 발현이 제거되었고 그 발현은 LDHA 발현 플라스미드를 형질감염시켜 회복되었습니다(보충 그림 S9A, B ). shLDHA로 형질감염된 SNU620/5FU 세포에서, 젖산 생산 및 세포 생존율은 모의 형질감염된 세포와 비교하여 CA 처리에 의해 현저하게 변화되지 않았다(도 4B, C). 또한, CA의 성장 억제 효과는 LDHA-넉다운 SNU620/5FU 세포에서 LDHA 발현의 회복에 의해 증가됨(그림 4D). 또한 CA와 5FU를 개별적으로 또는 두 가지를 병용한 후 SNU620과 SNU620/5FU 세포를 조사하였다. CA와 5FU의 동시 처리는 SNU620/5FU 세포의 성장을 유의하게 억제했습니다(그림 4E). 또한 CA와 5FU의 조합 효과는 인간 위암 AGS, 췌장암 Panic{23}}, MIA PaCa-2, 결장암 LS174T 및 RKO 세포와 같은 여러 다른 세포주에서 조사되었습니다. SNU620 및 SNU620/5FUcell. 젖산 생성과 LDHA 발현은 서로 좋은 상관 관계를 보였고 이러한 해당 특성은 SNU620/5FU, AGS 및 RKO에서 상대적으로 높습니다(보충 그림 S10A, B). 또한 CA와 5FU의 조합 처리는 AGS 및 RKO를 포함한 해당 세포에서 5FU의 단일 처리와 비교하여 세포의 생존력을 유의하게 감소시켰습니다(보충 그림 S10C). 그러나 CA와 5FU의 동시 처리는 낮은 LDHA 발현을 보인 SNU620, Panic{37}}, MIA PaCa{38}}, LS174T 세포의 성장을 유의하게 억제하지 못했습니다. 이러한 결과는 5FU 내성 세포에 대한 CA의 감작 효과가 LDHA 활성에 대한 억제 효과와 관련될 수 있음을 시사하였다.
그림 2. 카테킨(CA)은 LDHA 활성을 억제하지만 그 발현은 억제하지 않습니다.(A) SNU620/5FU의 젖산 생성은 CA 유도체(10μM)를 24시간 동안 처리한 후 측정되었습니다. (B) 시험관내 LDHA 활성은 치료 시 평가되었습니다. CA 유도체(10 uM) 및 옥사메이트(20 mM)로;(C, D) 시험관내, LDHA 및 LDHB 활성은 표시된 농도의 CA로 추정되었습니다. (E, F) 세포를 24시간 동안 표시된 농도의 CA로 처리하였다. 세포내 LDHA 및 LDHB 활성은 세포 용해물을 효소 공급원으로 사용하여 측정하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. **피<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
그림 4. 5FU 내성 세포에서 카테킨(CA)과 5-플루오로우라실(5FU)을 동시에 처리하여 세포 생존율이 억제되었습니다.(A) SNU620 및 SNU620/5FU 세포의 생존율은 표시된 농도의 48시간 동안 CA; (B) SNU620/5FU-pLKO.1 및 SNU620/5FU-shLDHA 세포에 CA(10μM)를 24시간 동안 처리했습니다. SNU620/5FU-pLKO.1 및 SNU620/5FU-shLDHA 세포의 배양 배지에서 젖산 생산을 측정했습니다. SNU620/5FU-shLDHA와 LDHA#2 세포를 48시간 동안 표시된 농도의 CA로 처리했습니다. 세포 생존율은 MTT 분석을 사용하여 측정했습니다. (E) SNU620 및 SNU620/5FU 세포를 CA(10μM) 및/또는 5FU(10μM)로 48시간 동안 처리했습니다. 이들 세포의 생존력은 MTT 분석을 통해 측정되었다. 결과는 평균±SEM으로 표시됩니다.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
이 기사는 Int에서 발췌했습니다. J. 몰. 과학. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms
