세포막 복구 단백질이 신장 섬유증을 조절하기 위해 전사 인자 신호 전달을 조절하는 방법

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

리 하이창

신장섬유증은 급성 진행과 관련이 있습니다.신장만성 신장 질환의 손상. 세포막 복구 단백질인 MG53은 신장 상피 세포 손상 및 급성 신장 손상으로부터 보호하는 것으로 나타났습니다. 여기, 우리는 변조에서 MG53의 역할을 평가했습니다.신장노화된 마우스와 편측성 요관 폐쇄(UUO)가 있는 마우스의 섬유증은 진행성 신장 섬유증의 알려진 모델입니다. MG53을 제거한 마우스는 같은 나이의 MG{1}}마우스보다 나이가 들어감에 따라 간질 섬유증이 더 많이 발생했습니다. 유사하게, MG53이 없는 경우,신장섬유증은 반대쪽의 폐쇄되지 않은 신장 또는 가짜 수술 마우스의 신장과 비교하여 폐쇄된 신장에 손상되지 않은 MG53이 있는 마우스에 비해 과장되었습니다. 요도 폐쇄신장MG53 결핍 마우스의 요관 폐쇄 신장은 MG53 온전한 마우스의 신장보다 훨씬 더 많은 염증을 보였습니다. 시험관 내 실험은 MG53이 근위 세뇨관 상피 세포의 핵에 들어갈 수 있고 전사 인자 NF-kB의 p65 구성 요소와 직접 상호 작용할 수 있음을 보여 주었으며, 이는 MG53이 없을 때 염증이 증가했다는 가능한 설명을 제공합니다. 이를 테스트하기 위해 조작된 세포 또는 직접적인 재조합 단백질 전달을 통해 향상된 MG53 발현을 UUO 대상 마우스에 제공했습니다. 이것은 NF-kB 활성화와 염증을 감소시키고 신장 섬유증을 약화시켰습니다. 따라서 MG53은 만성 신장 염증을 치료하는 데 치료적 역할을 할 수 있으며 이에 따라섬유증이는 만성 신장 질환 표현형으로 이어집니다.

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번역문 만성 염증은 급성 신장 손상에서 만성 신장 질환으로의 전환의 기초가 될 수 있는 섬유성 재형성으로 이어집니다. 단백질 염증 전사 인자 핵 인자-kB(NF-kB)의 활성화는 신장 염증의 발병기전에 관여합니다. 여기에서 우리는 이전에 확인된 세포막 복구 단백질인 MG53이 NF-kB와 직접 상호 작용하고 전사 활성을 감소시킨다는 증거를 제공합니다. 동시에 외인성으로 투여된 MG53은 염증이 있는 신장의 섬유화 리모델링을 감소시킬 수 있습니다. 이러한 발견은 MG53과 NF-kB 사이의 보호 상호작용이 염증 매개 신장 섬유증의 발병을 약화시킨다는 것을 나타냅니다. MG53의 약리학적 투여는 진행성 신장 섬유증의 치료를 위한 유망한 접근법일 수 있습니다.

급성 신장 손상(AKI) 또는 만성 신장 질환(CKD)으로 분류될 수 있는 신장 기능 장애는 노년층에서 전염병으로 성장했습니다. 2017년에 CKD의 유병률은 65세 이상 인구의 14.5%에 이르렀으며, 그 결과 치료에 840억 달러 이상의 메디케어 지출이 발생했습니다.^1,2AKI 및 CKD는 주로 손상에 대한 증가된 감수성과 노화된 신장을 복구하는 능력의 감소로 인해 노인에게 더 흔합니다. 임상 연구에 따르면 CKD는 AKI의 주요 위험 요소이며, 반대로 AKI의 에피소드는 CKD가 말기 신장 질환으로 진행하는 것을 가속화할 수 있습니다. 현재 AKI의 치료는 주로 보조적이며, 확립된 CKD의 치료는 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템의 억제를 통해 진행을 늦추는 데 초점을 맞추고 있으며 이제는 가능하게는 나트륨-글루코스 공동수송체-2 억제를 통해 진행을 늦추는 데 중점을 두고 있습니다.^3,4

손상의 중증도에 따라 급성 손상의 주요 표적인 근위 세뇨관 세포는 세포 주기 진행의 변화,5,6 대사,7 단백질-염증성 및 전섬유성 사이토카인 분비, 또는 부분적 상피-중간엽 전이,8 이는 리모델링/수리가 성공할 것인지 아니면 부적응적일 것인지를 결정하고 CKD의 특징인 신장 섬유증을 초래합니다.9,10 이 리모델링은 일반적으로 신장 염증의 배경에서 발생하며,

감소된 혈관 공급, 및 세포외 기질(ECM) 단백질의 생산 및 상피 세포의 손실 및 콜라겐, α-평활근 액틴 및 피브로넥틴의 축적을 포함함; 또한 신장 기능 저하와도 높은 상관관계가 있습니다.

만성 염증은 AKI에서 CKD로의 전환의 기초가 될 수도 있는 섬유성 리모델링을 초래합니다.11-13 누적 연구에 따르면 감염, 손상, 손상으로 인한 신장 염증의 발병기전에 핵 인자-kB(NF-kB) 전사 인자가 관련되어 있습니다. 또는 이식.11,12,14 표준 NF-kB 경로의 활성화는 NF-kB(IkB) 키나아제 억제제의 활성화로 시작되며, 이는 IkBa의 인산화 및 분해 및 NF-kB 이종이량체의 핵 전위로 이어집니다.15 신장 상피 세포 및 침윤성 면역 세포에서 NF-kB 신호의 활성화는 지질다당류(LPS) 또는 허혈 재관류 손상에 대한 노출과 같은 병태생리학적 유발 요인에 의해 유발될 수 있습니다.¹⁷신장 세뇨관 세포 외에도 대식세포 및 수지상 세포와 같은 타고난 면역 세포도 신장 손상, 염증 및 섬유화 리모델링에 기여합니다.^13,18–20

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증가하는 증거는 근육 유래 분비 인자(즉, 마이오카인)가 조직 누화를 통해 전신 생리를 조절하여 신장 질환의 진행에 영향을 미친다는 것을 시사합니다.²¹MG53(TRIM72라고도 함)은 세포막 복구에 중요한 기능을 갖는 TRIM(근육이 풍부한 삼중 모티프) 단백질입니다.22,23 TRIM 계열 단백질은 면역 신호 조절에서 조직 복구에 이르기까지 다양한 기능을 가지고 있습니다.²⁴MG{0}}매개된 막 복구는 골격근의 급성 손상 완화에 관여하며,²⁵신장,²⁶마음,²⁷ 폐, 28개의 뇌,^29,30그리고 피부.³¹우리의 이전 연구는 AKI 보호의 핵심 구성 요소인 신장에서 낮은 수준의 MG53 발현을 확인했으며 MG53(mg53/)이 결핍된 마우스는 스트레스 유발 AKI에 더 취약했습니다.²⁶우리는 또한 최근 순환에서 MG53의 지속적인 상승이 조직 손상 복구 및 재생을 향상시킨다는 것을 입증했습니다. 진행성 CKD 동안 신장 섬유증을 조절하는 신장 특이적 및 외부 순환 MG53의 상대적 역할은 아직 알려져 있지 않습니다.

최근, 특히 NF-kB 신호전달의 조절을 통해 염증 억제를 통해 조직 보호를 조절하는 MG53의 새로운 역할이 진화했습니다. 예를 들어, MG53은 TLR4/NF-kB 경로를 억제하여 LPS에 의한 신경독성과 신경염을 약화시키고, 심장 MG53은 KChIP2 발현을 조절하여 심장 비대 동안 전기생리학적 리모델링을 제어합니다. IRF3/NF-kB 활성화의 억제와 대식세포에서 비정상적인 세포내 Ca2 신호의 억제를 통해 과도한 인터페론-b 생산을 특징으로 하는 치명적인 인플루엔자 A 바이러스 감염 동안 부적응 과염증 반응을 예방합니다.35 게다가, 인플루엔자 A의 치사량 투여 시 바이러스 감염에서 MG53은 바이러스 역가 자체에 직접적인 영향을 미치지 않고 음성 조절을 통해 사이토카인 폭풍(인터페론-b, 인터루킨{19}} 및 인터루킨{20}}b)을 완화함으로써 사망률과 폐 손상을 예방하는 것으로 나타났습니다. NLRP3 inflammasome 및 폐의 pyroptosis 예방.36 게다가, 외인성 MG53의 고용량 만성 치료는 NF-kB 억제와 관련이 있었습니다. – 노화된 심장에서 염증 매개

우리는 MG53이 NF-kB의 전사 활성을 조절하여 신장 염증을 조절하고 그렇게 함으로써 만성 염증의 결과로 발생하는 신장 섬유증을 약화시킬 수 있다고 가정했습니다. 이 연구는 이 가설을 해결하기 위해 수행되었습니다.

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행동 양식

동물 연구

동물에 대한 모든 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드를 준수하고 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜을 따랐습니다. 연령 일치 야생형(WT) 또는 mg53^-/-129S1/SvImJ 균주의 비말단체를 사용하여 연령 의존적 및 일측성 요관 폐쇄(UUO) 유발 신장 섬유증의 조절에서 MG53의 역할을 확립했습니다. C57B6/J 마우스(9-10주)는 Jackson Labs에서 구입했습니다.

신장 손상 연구를 위해 마우스(9-12주)에 UUO를 적용하여 신장 섬유증을 유도했습니다. 깊은 마취면을 보장하기 위해 마우스를 이소플루란(1.5% –2.{5}}%)을 통해 마취했습니다. UUO 절차는 공개된 프로토콜에 따라 왼쪽 요관을 5-0 외과용 실크로 두 번 연결하여 수행되었습니다.38 가짜 마우스에는 복부 피부 절개만 있었습니다. 폐쇄성 신장 손상에 대한 rhMG53의 효과를 평가하기 위해, UUO 마우스의 1개 그룹은 UUO 수술 직후(0일)부터 꼬리 정맥 주사를 통해 rhMG53(2 mg/kg)을 투여받은 후 7일 동안 매일 2회 투여했습니다. 9일과 11일에 추가 용량. UUO 마우스의 대조군은 동일한 일정에 따라 식염수 주사를 받았습니다. UUO 수술 후 12일째에 마우스를 죽이고, 인산염 완충 식염수로 신장을 제자리에서 관류하고, 조직학 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 UUO 신장 및 반대쪽 신장의 조직 샘플을 수집했습니다.

별도의 연구에서 WT 및 mg53^-/-마우스는 UUO 또는 가짜 수술을 받았고 수술 후 7일째에 사망했습니다. MG53은 세포 기반 치료 접근법을 사용하여 쥐에게 주어졌습니다.39 RAW 264.7 대식세포는 24시간 동안 독시사이클린(DOX) 의존성 Ad tPA-MG{8}}체리 바이러스 입자로 감염되었습니다. 감염된 세포(마우스당 {{1{12}}}}/1{17}}0ml 염수의 농도에서)는 수술 직후(주사 0일) 마우스에 꼬리 정맥 주사되었습니다. 마우스는 0일, 1일, 3일 및 6일에 Ad-tPA-MG53 형질도입된 RAW 세포를 4회 주사했습니다. mg/ml in 5% sucrose solution)을 음용수에 7일 동안 넣은 후 죽입니다. 조직학, RNA 및 단백질 분석을 위해 UUO 신장 및 반대쪽 신장의 조직 샘플을 수집했습니다.

통계 분석 데이터는 평균 -SD로 표시됩니다. 그룹 내 비교는 2개의 실험적 기초 연구를 비교할 때 Student's t-test를 사용하여 수행되었습니다. H Li et al.: MG53은 신장 섬유증에서 NF-kB를 조절합니다. 2 Kidney International(2{15}}21) -, --- 그룹 및 1-2개 이상의 그룹에 대한 분산 분석(Graphpad Prism 8.2; GraphPad)에 이어 Bonferroni 또는 Holm-Sidak 다중 비교 테스트 임시. P < 0.05의="" 값은="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="">

보충 방법 조직학적 평가, 혈청 크레아티닌 측정, 플라스미드 구성, 세포 배양 및 1차 관상 상피 세포 분리, 아데노바이러스 준비 및 세포 감염, NF kB p65 핵 전위 분석, 면역조직화학 및 공초점 이미지, NF-kB 루시퍼라제 리포터 분석, 사이토카인을 포함한 전체 방법 효소 결합 면역 흡착 분석, 조직 분획, 면역 블로 팅, 공동 면역 침전, 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (보충 표 S1) 및 rhMG53 생산은 보충 방법에 있습니다.

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결과

MG53을 제거한 생쥐에서 연령 의존적 신장 섬유증 발병

우리는 mg53에서 신장 기능과 섬유증에 대한 노화의 영향을 비교했습니다.^-/-및 WT 마우스. 우리는 MG53이 있거나 없는 어린 쥐(2개월)의 혈청 크레아티닌 수준이 유의하게 다르지 않았지만, 나이가 많은(16-20개월) mg53-/-생쥐는 연령 일치 WT 대조군보다 유의하게 더 높은 혈청 크레아티닌을 나타냈다(그림 1a). 삼색소 염색에 기초하여, 우리는 mg53이-/-생쥐는 WT 생쥐에 비해 신장 섬유증이 더 많았으며 5개월부터 시작하여 20개월까지 계속되었습니다(그림 1b 및 c). 면역조직화학 염색을 사용하여 2-개월 및 5-개월 된 마우스 신장에서 백혈구, 단핵구 및 대식세포의 침윤에 대한 MG53 절제의 영향을 평가했습니다(그림 1d 및 e). 어린 WT 및 mg{8}}/- 마우스의 신장은 유사한 수준의 신내 백혈구를 가졌지만 5-개월된 마우스의 WT 신장보다 mg53/신장에서 훨씬 더 많은 염증 세포가 발견되었습니다.

더욱이, 신장 섬유증 부위에서 흔히 발견되는 2가지 세포외 기질 단백질인 평활근 액틴과 피브로넥틴에 대한 면역조직화학은 3-에서 8-배까지 신장의 사구체와 세뇨관간질에서 염색이 강화된 것으로 나타났습니다. {4}}월령 mg53-/- 생쥐와 10-월령 WT 생쥐 비교(보충 그림 S1).

UUO는 mg{0}}/- 마우스에서 악화된 신장 염증 및 섬유증을 유도합니다. 면역블롯팅에 의해 검출된 신장 MG53 수준은 UUO 후 7일에 상당히 증가했습니다(그림 2a). mg53- /- UUO 신장은 WT UUO 신장보다 30% 추가로 삼색소로 염색된 영역과 함께 과장된 섬유증을 나타냈습니다(그림 2b).

MG53은 NF-kB 활성화 및 p65 핵 위치를 조절합니다

NF-kB(p65)의 활성은 UUO 모델에서 평가되었습니다. 총 p65(t-p65)의 수는 WT 및 mg53/마우스의 UUO 신장에서 유의하게 증가했지만 p65의 인산화로 평가된 NF-kB 활성화는 mg53/UUO에서 더 컸습니다(16-배). WT UUO 신장보다 신장({10}}배)이 가짜 수술 동물과 비교됩니다(그림 3a). 폐색된 신장에서 형질전환 성장인자 b1(TGF-b1), 플라스미노겐 활성화제 억제제{16}}(PAI{17}}) 및 콜라겐 I형 알파 1(Col1a1)의 상대적인 RNA 수준을 분석했습니다.40 WT 및 mg53 / (그림 3b)의 UUO 신장에서 가짜 동물 및 유사한 유도 (TGF-b1, w10 배; PAI{25}}, w40 배; Col1a1, w40 배)에서 낮은 수준의 유전자 발현을 감지했습니다. 정상 조건에서 신장 피질에서 MG53의 공간적 분포를 조사하기 위해 신장 조직 분획을 분석하였다. 우리는 정기적으로 추출된 전체 핵 단백질보다 10-배 더 많은 총 세포질 단백질을 얻었습니다. t-p65 수준은 WT와 mg{36}}/- 마우스 사이의 세포질 분획에서 유사했지만 mg{38}}/- 마우스의 핵 분획에서 더 컸습니다(그림 3c). MG53은 세포질 분획에서 검출되었습니다(튜불린을 세포질 마커로 사용). 예기치 않게 상당한 양의 MG53이 핵 분획에서 검출되었습니다(핵 분획 마커로 히스톤 H3 사용).

이 발견을 확인하기 위해 골격근 분획에서 MG53 위치를 조사했습니다(보충 그림 S2). 우리는 MG53이 세포질과 sarcolemmal 막(막 분획의 마커로서 나트륨-칼륨 아데노신 트리포스파타제)22,23,25에 국한되었지만 골격근에서 농축된 핵 MG53도 감지한 이전 연구를 재현했습니다.

MG53은 p65와 상호 작용하여 종양 괴사 인자-a-유도 전사 활성을 제어합니다. 조직 분획 결과를 확인하기 위해 다음과 같은 면역 조직 화학적 연구를 수행했습니다. 배양된 WT 근위 관상 상피 세포에서 p65는 주로 세포질에서 발견되었지만 MG53이 없는 경우 핵에 국한되었습니다(그림 4a). 이들 세포를 8시간 동안 LPS(5mg)로 처리했을 때, 전염증성 사이토카인 분비는 WT 세포보다 mg53/세포에서 유의하게 더 컸다(도 4b).

이러한 데이터는 MG53이 염증성 사이토카인 발현을 조절하기 위해 p65와 상호작용할 수 있음을 시사했기 때문에, p65와 MG53 사이의 직접적인 상호작용은 Flag-p65 및 HA-MG53으로 공동형질감염된 HEK293 세포를 사용한 공동면역침전 분석에 의해 평가되었습니다. 약한 상호 작용을 시연했습니다(그림 4c). GFP-p65 및 RFP-MG53 플라스미드의 공동 형질감염 및 공초점 분석은 p65 및 MG53의 공동 국소화를 확인했습니다(그림 4d). 그런 다음 pHM6 벡터로 일시적으로 형질감염된 안정적인 NF-kB/{22}}GFP-Luc 전사 리포터 세포주로부터 루시퍼라제 활성을 측정하여 MG53이 TNF-자극 후 NF-kB(p65) 전사 활성에 영향을 미치는지 여부를 정량화했습니다. 또는 HA-MG53. 리포터 세포는 컨센서스 NF-kB 전사 반응 요소(kB 사이트) 업스트림의 4개 사본과 함께 최소 사이토메갈로바이러스 프로모터에 의해 구동되는 형질도입된 렌티바이러스 발현 반딧불이 루시퍼라제 리포터를 포함합니다. TNF-α가 없는 경우, MG53 단백질을 발현하는 리포터 세포에서 매우 낮은 고유 루시퍼라제 활성이 검출되었습니다. MG53은 TNF-α 유도 NF-kB(p65) 전사 활성을 약 40% 억제했습니다(그림 4e).

MG53의 과발현은 TNF-a 처리 시 NF-kB p65 핵 전위를 방지했습니다. NF-kB p65는 신장 근위 세뇨관 상피에서 TNF-a 처리 시 핵으로 전위되었습니다.41 MG53 처리가 NF-kB p65 핵 전위를 약화시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해 TNF-α 자극 시 DOX 의존성 Ad-tPA-MG53 바이러스 형질도입 또는 재조합 인간 MG53(rhMG53) 처리를 통해 HKC{13}} 세포에서 MG53을 과발현했습니다. MG{20}}특이 모노클로날 항체를 사용하여 DOX 의존 유도 후 면역블롯팅으로 MG53을 검출했습니다. MG53은 Ad-tPA-MG53 형질도입된 HKC{27}} 세포에서 매우 높은 수준으로 존재했으며,

1ng rhMG53/mg 세포 용해물에 해당합니다. 대조적으로, HKC-8는 훨씬 적은 양의 rhMG53을 차지하여 발현했습니다(그림 5a). HKC-8에 ​​의한 FL 형광 표지 rhMG53의 흡수는 공초점 현미경으로 확인되었습니다(보충 그림 S3). TNF-α 처리 후, 피크 p65 활성화까지의 시간은 15-30분이었습니다(그림 5b). 기본 조건에서 NF-kB p65는 주로 세포질에 존재했으며 MG53의 과발현은 이를 변경하지 않았습니다(그림 5c 및 d). 그러나 TNF-α 자극 후 p65는 MG53을 과발현하지 않는 HKC{20}} 세포의 핵으로 전위되었습니다. 이에 비해 p65의 핵 전위는 MG53을 과발현하는 세포에서 33%(rhMG53이 제공된 세포)에서 50%(DOX가 제공된 형질도입된 세포)로 떨어졌습니다(그림 5c 및 d).

UUO 수술 직후 꼬리 정맥 주사를 통해 투여된 1 - 106 세포를 사용하여 조작된 RAW 세포를 UUOmouse 모델로 입양 전달했습니다. 마우스를 무작위로 일반 식수(-DOX)를 받은 그룹과 식수에서 DOX(2 mg/ml)를 받은 그룹으로 나누었습니다. UUO 마우스는 총 4회의 주사를 위해 격일로 RAW를 받았습니다. 수술 후 7일째에 신장을 적출하였다.

조작된 RAW를 주입한 후 DOX 유도를 주입한 마우스는 세포를 받지 않은 마우스 또는 조작된 RAW 세포를 주입했지만 Dox 유도는 하지 않은 마우스와 비교하여 신장 섬유증이 현저히 감소(30%까지)되었습니다(66% 섬유증 면적, 그림 6a 및 b).

적은 수의 RAW/Ad-tPA-MG53 개체군만이 실험이 끝날 때까지 세망내피 시스템의 감시에서 살아남았습니다. 면역 조직 화학 염색은 DOX 처리가 신장에서 RAW 매개 MG53 발현을 유도함을 확인했습니다(그림 6c). 흥미롭게도 RAW 주입 마우스와 DOX 유도 MG53의 UUO 신장은 RAW를 투여받지 않은 사람이나 DOX 없이 RAW를 투여받은 사람보다 더 낮은 p{10}}/t-p65 비율(약 40%)을 나타냈습니다(그림 6d 및 e). 감소된 p-p65 수준은 UUO 신장의 p-p65(S536) 면역조직화학 염색으로 확인되었습니다(그림 6f). 우리는 Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX에 의해 전달되는 순환 MG53과 신장 근위 세뇨관 세포에 의한 흡수가 p-p65(S536) 감소에 참여하고 UUO 신장 염증을 감소시킬 수 있다고 생각합니다. UUO 전용 신장과 비교하여 DOX 없이 RAW를 주입한 마우스(MG53 유도 없음)의 UUO 신장에서 TGF-b1, PAI{31}} 및 Col1a1 발현이 유의하게 증가했습니다. 이러한 profibrotic 유전자의 상승은 주입된 세포에서 면역 적격 마우스로의 강한 동종이식 반응의 유도에 기인할 수 있습니다. 그러나 RAW를 주입하고 DOX(MG53 유도)를 투여한 마우스의 UUO 신장은 DOX 처리를 하지 않은 마우스보다 PAI{38}}가 현저히 낮고 TGF-b1 및 Col1a1 수치가 상대적으로 낮습니다(그림 6g).

rhMG53의 전신 투여는 UUO를 받은 마우스에서 NF-kB 활성화 및 섬유증 발달을 완화합니다

우리는 rhMG53이 앞서 설명한 조작된 RAW 세포 요법과 유사한 항섬유화 효과를 나타내는지 여부를 테스트했습니다. 우리의 이전 약동학 데이터는 rhMG53.42의 짧은 순환 반감기(설치류에서 약 90분)를 나타냈습니다.

rhMG5326,37을 잘 사용하므로 그림 7a에 표시된 투여 전략을 사용했습니다. UUO 마우스는 수술 후 첫 7일 동안 매일 비히클(식염수) 또는 rhMG53(2mg/kg)을 무작위로 제공받았고 이후 12일째에 사망할 때까지 격일로 제공되었습니다. 가짜 및 반대쪽 신장은 대략 동등한 t-p65를 나타냈습니다. 및 피브로넥틴 발현 수준, p-p65 수준은 가짜 신장과 비교하여 반대측 신장에서 약간 증가했습니다. UUO 후, 신장 t-p65가 증가했습니다. 식염수 처리 동물과 비교하여 rhMG 처리 동물의 UUO 신장에서 p{15}}/t-p65 비율은 약 37% 감소한 반면 IkBa는 약 27% 증가했습니다(그림 7b 및 씨). 또한, 피브로넥틴은 약 33% 감소했습니다(그림 7b 및 c). 면역 조직 화학은 치료 후 UUO 신장에 rhMG53이 존재함을 확인했습니다(그림 7d). 총 섬유증은 rhMG{26}}처리된 UUO 신장에서 감소했습니다(그림 7e). 그러나 TGF-b1, PAI{30}} 및 Col1a1의 RNA 발현은 식염수 또는 rhMG53으로 처리된 마우스에서 유사했습니다(그림 7f).

cistanche는 신장 기능 장애 치료에 효과적입니다.

논의

MG53은 초기에 원형질막 복구 기계의 두드러진 구성요소로 확인된 근육이 풍부한 TRIM 단백질입니다.22,26,42,43 그러나 MG53의 작용은 골격근에만 국한되지 않으며 MG53은 myokine.32 우리는 이전에 MG53이 원격 기관의 조직 손상 동안 염증을 제어할 수 있음을 보여주었습니다.27,29,33,35-37 본 연구는 MG 매개 기관 보호의 범위를 신장으로 확장합니다. 우리는 MG53이 염증성 및 섬유화성 전사 인자 NF-kB의 사이토카인 유도 활성화를 차단함으로써 신내 염증 및 신장 섬유증을 약화시킬 수 있다고 결론지었습니다. 이 결론은 다음 관찰을 기반으로 합니다: (i) 정상 마우스에서 MG53의 유전적 결실.

신장 섬유증의 증가 및 백혈구 및 대식세포에 의한 신장 침윤을 동반한 생쥐가 노화됨에 따라 신장 기능의 감소를 초래했습니다. (ii) 뮤린 UUO 신장 손상 모델에서 MG{0}}결핍 마우스의 폐색된 신장은 MG{1}충족 마우스보다 더 많은 섬유증과 염증을 나타냈습니다. (iii) LPS 처리된 근위 세뇨관 상피 세포에 의한 TNF-α 및 인터루킨{3}}생산은 MG53의 존재 하에 약화되었습니다. (iv) 근위 세뇨관 상피 세포주에서 MG53의 처리 또는 과발현은 -kB의 p65 성분의 핵 전위를 차단함으로써 TNFα-유도 NF-kB 활성화를 감소시켰다(MG53은 비록 약하지만 p65에 직접 결합하는 것으로 밝혀졌다); (v) NF-kB의 활성화에 필요한 단계인 p65의 인산화는 대식세포에서 MG53을 과발현하도록 유도된 재조합 MG53으로 처리된 UUO 마우스의 폐색된 신장에서 감소했습니다. 또한, 재조합 MG53을 주사한 UUO 마우스의 폐쇄된 신장에서 NF-kB 활성화 억제제인 ​​IkBa가 증가했습니다.

정상 마우스에서 MG53의 유전적 결실은 신장에 대한 노화의 부작용을 허용했습니다. 이것은 내인성 MG53의 존재가 노화 동안 보호의 기준 수준을 제공함을 시사합니다. 유사하게, 내인성 MG53의 손실은 폐쇄로 인한 AKI를 악화시켰습니다. UUO 신장은 MG53을 축적했으며, 이는 아마도 골격근의 원격 마이오카인 활동을 반영할 수 있습니다. 손상 중에 근육 MG53이 신장에 어떻게 동원될 수 있는지는 불분명합니다. 그러나 손상된 신장은 종종 저산소증을 일으키고 산화 스트레스를 겪습니다.^44,45MG53을 모집하는 데 도움이 될 수 있는 신호. 그렇다면, 이 "근육-신장-면역 세포" 축은 신장 손상을 약화시키는 데 활용될 수 있습니다.²⁶급성 또는 만성 손상 동안 MG53 생산이 상향 조절될 수 있습니다.

NF-kB는 신장 손상 및 노화에서 염증 및 섬유화증의 탁월한 전사 드라이버입니다.^14,17,47,48우리는 MG53의 효과가 NF-kB를 통해 매개될 수 있는지 여부를 조사하라는 요청을 받았습니다. 왜냐하면 신장 균질물의 핵 구획에 MG53의 존재가 전사 간섭의 가능성을 시사했기 때문입니다. MG53의 핵 현지화는 전례가 없습니다. 심근 MG53을 과발현하는 유전자 변형 모델에서 핵 MG53은 전사 수준에서 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체-알파의 발현을 조절하고 심장 지질 대사에 영향을 미쳤습니다.49 게다가, 우리는 최근 rhMG53이 NF-kB 활성화를 억제하여 노화 관련 심부전을 완화한다는 것을 입증했습니다. 노화된 심근세포에서 전염증성 사이토카인, 세포자멸사 및 산화 스트레스 감소를 통해.³⁷

MG53이 p65 핵/세포질 동원을 어떻게 조절하는지에 대한 분자 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. MG53은 핵 국소화 신호를 포함하지 않지만 핵 수출 단백질 exportin에 의해 인식되는 모티프인 3개의 추정 N-말단 류신이 풍부한 핵 수출 신호를 포함합니다.⁵⁰MG53과 p65 사이의 직접적인 상호작용은 NF-kB 활성화에 대한 MG53의 유일한 또는 주요 파괴 효과로서 다소 약했습니다. MG53이 NF-kB 중요 구성요소의 동적 핵세포질 이동에 영향을 미치는 것으로 보이지만 정확한 메커니즘은 아직 결정되지 않았습니다.

MG{0}}매개 재생신보호의 중요한 결과는 NF-kB 매개 염증의 약화를 통해 섬유성 재형성을 감소시키는 것으로 보입니다. 신장 섬유화증은 다양한 ECM 단백질의 병리학적 침착을 포함하는 복잡한 과정입니다.51 MG53은 ECM 단백질 fibronectin에 분명한 영향을 미치는 것으로 보입니다. 피브로넥틴은 MG53이 결핍된 UUO 신장에서 증가하고 MG53으로 처리된 UUO 마우스에서 감소했습니다. MG53의 존재 및 부재하에서 다른 ECM 단백질의 발현은 이해하기가 더 어렵습니다. 우리는 이전에 시험관 내 연구에서 rhMG53이 TGF-b1/Smad 신호 전달을 부정적으로 조절하고 ECM 단백질 합성을 억제한다는 것을 입증했습니다.31 생체 내, TGF b1, PAI{12}} 및 Col1a1 전사체는 UUO 신장에서 mg53 / 결핍 동물. 이러한 전사체는 바이러스로 유도된 마우스의 투여를 통해 MG53을 과발현하도록 유도된 UUO 동물에서 감소했습니다.

그러나 재조합 MG53이 주어졌을 때 효과가 나타나지 않았습니다. 이는 달성된 신장내 MG53 수준이 재조합 MG53과 반대로 대식세포 벡터가 제공된 동물에서 훨씬 더 컸기 때문에 단순히 충분한 투여의 경우일 수 있습니다. 또한 단백질 수준은 측정되지 않았으며 전사 후 이벤트는 UUO에서 ECM을 수정할 수 있습니다. 특정 ECM 단백질을 조절하는 MG53의 새로운 역할을 설명하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 결론적으로, 이 연구는 미오카인이 신장과 같은 원격 기관에서 기준선 염증을 조절하는 데 도움이 될 수 있으며, 신장 손상이 있을 때 염증을 약화시키고 조절하는 데 도움이 될 수 있음을 보여주었습니다. 그림 8은 재보호에서 MG53의 역할에 대한 작업 모델을 제시합니다. 손상 관련 분자 패턴(TNF-a와 같은 DAMP) 및 병원체 관련 분자 패턴(LPS와 같은 PAMP) 자극 및 허혈성 스트레스 동안 NF-kB 시그널로솜은 신장에서 활성화됩니다. MG53은 NF-kB 신호전달의 인산화 및 활성화를 억제하고 IkBa를 안정화하며 p65 핵 동원을 감소시켜 전 염증성 프로그램의 활성화를 차단함으로써 신장을 보호합니다. 내인성 MG53이 이러한 효과를 중재할 수 있지만, 우리는 UUO에서 손상을 줄이는 외인성 MG53의 능력을 기반으로 실현 가능한 MG53을 사용하여 더 강력한 보호를 제공할 수 있다고 제안합니다. 이 myokine이 임상적으로 어떻게 악용될 수 있는지 이해하기 위해 추가 조사가 필요합니다.

cistanche의 이점: 간 보호 및 항섬유증

폭로

JM은 인간 질병 치료를 위한 rhMG53을 개발하는 TRIM-edicine, Inc.의 지분을 보유하고 있습니다. MG53 사용에 대한 특허는 Rutgers University와 Ohio State University가 보유하고 있습니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.

감사의 말

이 작업은 국립 보건원(NIH) R{0}}DK106394(JM, BHR 및 P-HL) 및 NIH R{3}}AG062896(P-HL 및 BHR)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 또한 오하이오 주립 대학(P-HL)의 교내 Lockwood 기금과 국립 번역 과학 발전 센터(NCATS, P-HL, 상 번호 UL1TR002733)의 상으로 부분적으로 지원되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NCATS 또는 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

저자 기여도,

PD, P-HL, JM 및 BHR은 연구를 구상 및/또는 설계했습니다. HL, PD, P-HL, ZL 및 XZ는 실험을 수행하고 데이터를 수집하고 데이터 분석을 수행했습니다. PD, P-HL 및 BHR은 결과를 해석했습니다. 그리고 P-HL과 BHR은 원고의 초안을 작성, 수정 및 승인했습니다. 모든 저자는 최종 버전을 읽고 승인했습니다.

보충 자료

보충 파일(PDF) 보충 방법.

표 S1.프라이머 시퀀스. 그림 S1. mg53-/- 마우스는 향상된 ECM 단백질 침착을 나타냅니다. 연령 일치(10개월) 야생형(WT) 및 mg{6}}/- 신장 조직을 40 6-디아미디노{9}}페닐인돌(DAPI, 파란색, 왼쪽 패널), a- 평활근 액틴(SMA, 녹색, 두 번째 패널), 피브로넥틴(빨간색, 세 번째 패널) 및 병합된(오른쪽 패널). 바 ¼ 25mm. 신장 섬유증 면적의 정량화(그룹당 n=3). 데이터는 수단 -SD로 표시됩니다. 학생의 t-검정. ***P <>

그림 S2.핵과 세포질 사이의 골격근 MG53의 분포. 야생형(WT) ormg{3}}/- 마우스에서 유래한 골격근을 분획하고 맞춤형 항-MG53 항체(3mg 용해물) 및 세포 구획 마커(20mg 용해물)로 면역블롯팅했습니다. Sodium-potassium adenosine triphosphatase는 세포막 표지자로, 히스톤 H3는 핵 표지자로, tubulin은 세포질 표지자로 사용됩니다.

그림 S3.HKC-8 신장 근위 세뇨관 세포는 AlexaFluor 647로 표시된 rhMG53을 특이적으로 흡수합니다. rhMG53(Trimedicine) 및 소 혈청 알부민(BSA; ThermoFisher Scientific)은 제조업체의 프로토콜에 따라 Alexa Fluor(AF) 항체 라벨링 키트(Life Technologies)로 라벨링되었습니다. HKC-8 세포는 표지된 단백질 BSA-AF647(왼쪽 ) 및 rhMG53-AF647(오른쪽), 24시간 동안. Z 스택 이미지는 LSM780 공초점 현미경(Zeiss)에서 가져왔습니다. 이미지는 접시 바닥에 있는 세포를 보여줍니다. 바 ¼ 25mm.

그림 S4.유도성 MG53분비를 매개하기 위해 RAW 세포를 조작합니다. (A) RAW 세포를 24시간 동안 Ad-tPA-MG53으로 감염시키고 tPA-MG53 발현을 유도하기 위해 추가로 24시간 동안 독시사이클린[Dox] 또는 Dox(þDox, 1 mg/ml) 없이 처리하였다. 공초점 이미지는 대식세포 유사 RAW 세포(F4/8{17}} 염색, 녹색, 상단 패널)에서 MG53 발현(맞춤형 항-MG53 항체, 빨간색, 하단 패널)의 유도를 보여주었습니다. 바 ¼ 25mm. (B, C) 감염된 RAW 세포(B) 및 상응하는 배양액으로부터 tPA-MG53 및 MG53의 유도된 발현에 대한 세포 용해물(0.6, 3, 6 mg의 양)의 웨스턴 블롯 분석 배지 농축액(2, 5, 1{31}}ml 용량)(C). 다양한 양의 rhMG53(0.2, 1, 0.05 및 0.025ng의 양)이 표준으로 로드되었습니다. Mw, 분자량 마커.