신장 섬유증 발달에서 변형 성장 인자(TGF-)의 중심 역할
Mar 26, 2022
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1부: TGF{0}}매개 섬유증 모방 장치에서 인간의 원발성 신장 섬유아세포의 역할
황성혜, 이윤미 외.
1. 소개
신장 섬유증수많은 진행성 신장 질환의 최종 공통 경로인 세포외기질(ECM) 단백질 생산의 증가, 기질 분해의 감소, 세포-기질 상호작용의 기능 장애, 상주 세포의 변형 및 염증 세포 침윤이 특징입니다.변화하는 성장인자-(TGF-)는 세포 증식, 분화 및 면역 반응과 같은 생물학적 과정을 조절하는 다기능 이량체 펩타이드입니다[1]. 수많은 섬유화 인자 중 TGF-(변화하는 성장인자-) 중추적인 역할을 하며 항염 효과가 있다. TGF- 1(변화하는 성장인자-)- 결핍된 쥐는 대규모 염증으로 사망합니다. TGF를 과발현하는 형질전환 마우스- 1(변화하는 성장인자-)주로 항염증 활성을 통해 신장 섬유증 병리 발생으로부터 사실상 보호됩니다[2]. TGF-의 섬유화 및 항염증 특성(변화하는 성장인자-)TGF의 치료적 적용과 관련하여 양날의 검입니다.(변화하는 성장인자-)금지. TGF-를 차단하기 위해 현저한 노력을 기울였습니다.(변화하는 성장인자-)진행을 방해하는 행위신장섬유증[삼]. 전투를 위해 많은 접근 방식이 사용되었지만신장섬유증, 현재 사용 가능한 약물을 평가하는 실험 모델은 이상적이지 않습니다.
일반적으로 동물 연구는 약동학 및 약물 효능을 예측하는 전임상 시험에서 중추적인 역할을 합니다. 그러나 동물과 인간 사이에는 다양한 차이가 존재하므로 동물 기반 약물 효능 및 안전성 테스트의 정확성에 의문을 제기합니다. 4. 이전 보고서는 약물의 신독성 및 안전성을 평가하기 위해 약물 개발 중 전임상 동물 연구에 의존했습니다. 동물의 신장 기능은 인간 신장의 2배 이상입니다. 따라서 약물은 인간보다 동물에서 더 빨리 대사되어 동물 연구를 이용한 약물 독성 시험 결과를 설명하기가 어렵습니다. 또한 동물 실험의 결과는 동물의 생리 기능이 다르기 때문에 인간의 약물 반응을 예측하는 데 사용할 수 없습니다. 동물 기반신장 섬유증모델은 인간을 재현하는 데 어려움이 있습니다.신장 섬유증; 따라서 현재의 장애물을 극복하고 약물 발견 플랫폼을 최적화하기 위한 연구가 진행 중입니다[5].
이러한 문제를 해결하기 위한 새로운 개념으로 OoC(Organ-on-a-Chip) 기술이 등장했습니다. 이 플랫폼은 현재의 단점을 고려하여 설계되었으며 신장학 분야에서 큰 가능성을 보여주었습니다[6]. 또한 OoC 모델은 실험 동물 모델을 대체할 수 있는 큰 잠재력을 갖고 있으며, 종 간 차이에 대한 솔루션을 제공하고, 동물 학대 및 윤리적 논쟁을 종식시키는 데 도움이 될 수 있습니다[7]. 에서 중요한 세포인 내피 및 상피 세포와 함께 1차 신장 섬유아세포를 동시에 사용하는 시험관 내 모델은 거의 없습니다.신장섬유증. 각 세포의 역할섬유증별도로 연구 중입니다. 그러나 세포의 상호 작용에 관한 제한된 지식이 있습니다.
본 연구에서 우리는섬유증-인간의 1차 섬유아세포를 사용하여 장치를 모방합니다. TGF- 1(변화하는 성장인자-)치료는 다양한 효과를신장 섬유증모델. 특히, 섬유아세포는 이펙터 세포로서 중추적인 역할을 하고, 친섬유화 미세환경의 형성을 촉진하고, 성장 인자와 사이토카인을 분비합니다. 따라서 이 새로운 방법을 기반으로 섬유아세포는 신장 질환 연구에 이상적인 세포 모델 시스템을 제공할 수 있습니다. 섬유성 신질환 유래 섬유아세포가 3차원(3D)으로 배양된 세포의 무결성에 영향을 미치는지 여부를 평가했습니다. 마지막으로, 우리는 인간의 잠재력을 보여주는 원리 증명 연구를 제시합니다.신장 섬유증- 인간에 대한 반응을 예측하기 위한 모델로 장치를 모방신장 섬유증.
2. 결과
2.1.TGF- 1에 의한 알파 평활근 액틴(a-SMA) 및 케라틴-8(KRT{4}}) 식별(변화하는 성장인자-)홍콩-2 셀
초기 단계에서 우리는 알려진 마커를 조사했습니다.섬유증및 2차원(2D) 배양에서의 세포골격. 면역형광 염색 분석을 수행하여 섬유증의 -SMA 발현 및 세관 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT) 마커 및 세포골격 마커로서의 KRT8 수준을 추정하였다. 면역형광염색 결과 -SMA의 발현은 원래 약했고 KRT8 수준은 단층 HK{6}} 상피세포에서 높았다. TGF에 의한 형광 강도에는 유의한 변화가 없었습니다- 1(변화하는 성장인자-)(5 ng/mL) 또는 24시간 동안 HK{1}} 상피 세포의 특정 억제제 처리(그림 1).
그림 1. 면역형광은 알파-SMA 및 케라틴{2}}(KRT8)의 발현이 TGF- 1 처리에 의해 유지되었음을 보여줍니다.(변화하는 성장인자-)또는 HK{0}} 세포의 억제제.(A)알파-SMA 및 (B)CCK-8의 발현은 TGF- 1에 의한 HK-2세포에 영향을 미치지 않았습니다.(변화하는 성장인자-)(5ng/mL) 또는 억제제. 세포는 원래 웰당 1x10도의 밀도로 플레이팅되었고 (ac) 미처리 대조군 및 (df) 5ng/mL TGF로 자극되었습니다- 1(변화하는 성장인자-) 또는 (gi) 10μM 억제제(SB431542)를 24시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정. 그런 다음 세포를 20분 동안 항{5}}SMA 및 항-사이토케라틴{7}}으로 염색했습니다. 세포 핵을 확인하기 위해 Hoechst 염료 H33342로 공동 염색을 수행했습니다. 현미경 사진의 눈금 막대는 200um을 나타냅니다.
시스탄치 파우더는 신장 기능을 향상시킵니다.
2.2. TGF에 의해 감소된 KRT8 발현- 1(변화하는 성장인자-)칩에
다음으로 3D 배양된 HK-2에서 -SMA 및 KRT8의 발현 수준과 TGF- 1를 처리한 GFP-인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 총 길이를 평가했습니다.(변화하는 성장인자-)및 특정 억제제를 포함한다. 이를 달성하기 위해 먼저 HK{0}} 상피 세포와 GFP-HUVEC의 두 가지 세포 유형으로 구성된 조직 칩 패턴을 설정했습니다. 구성 확인 후 TGF가 있는 조직 칩을 노출했습니다- 1(변화하는 성장인자-)(5 ng/mL) 또는 24시간 동안 특정 억제제(10 um SB431542).
그림 2A-C에서 볼 수 있듯이 -SMA의 발현은 TGF- 1에 의해 특별히 변경되지 않았습니다.(변화하는 성장인자-)또는 특정 억제제 치료. 그러나, KRT8의 발현은 2-세포형 공동 배양 칩에서 감소하였다. 또한, TGF-β1 억제제의 첨가는 KRT8의 발현을 증가시켰다.
우리는 TGF에 의한 3D 관형 모세관 네트워크의 형성을 조사했습니다- 1(변화하는 성장인자-)내피 세포가 자발적으로 3D 관형 모세관과 같은 네트워크를 형성할 수 있기 때문에 HUVEC에서의 치료. 우리의 문화 여건에 따라 굵은 선의 형성이 현저히 감소했습니다. 그러나 TGF에서 모세관과 같은 가는 선이 증가했습니다- 1(변화하는 성장인자-)처리된 GFP-HUVEC. TGF의 경우- 1(변화하는 성장인자-)3차원 배양 칩에 inhibitor 처리를 하면 굵은 선과 굵은 선의 전체 길이가 TGF에 반대되는 경향을 보였다- 1(변화하는 성장인자-)치료. 무처리 대조군에 비해 굵은 선의 길이가 증가하는 것을 관찰하였다. TGF 후 GFP-HUVEC에서 두꺼운 선의 직경에서도 유사한 패턴이 관찰되었습니다- 1(변화하는 성장인자-)치료 및 억제제 치료. GFP-HUVEC의 직경은 TGF에 의해 억제되었습니다- 1(변화하는 성장인자-)그러나 대조군과 TGF에 비해 억제제에 의한 선의 굵기와 관계없이 증가함- 1(변화하는 성장인자-). 굵은 선의 전체 길이와 지름은 무처리 대조군 및 TGF{1}} 처리에 비해 TGF{0}} 억제제 처리에 의해 크게 증가했습니다. 특히, 얻어진 결과는 TGF-에서 작은 혈관의 밀도 증가를 나타냅니다.(변화하는 성장인자-)- 치료를 받지 않은 그룹과 비교한 치료 그룹. 대조적으로, TGF에서 두꺼운 혈관의 밀도는{1}}(변화하는 성장인자-)처리군은 처리되지 않은 대조군보다 낮았다(그림 2D, E).
그림 2. HK-2의 KRT8 표현식과 HUVEC의 전체 길이 및 직경.(A)면역형광은 -SMA의 발현이 유지되고 TGF의 처리에 의해 KRT8 발현이 극적으로 감소됨을 보여줍니다- 1(변화하는 성장인자-)홍콩-2에서. 세포를 플레이팅하고 5ng/mL TGF- 1로 자극했습니다.(변화하는 성장인자-)또는 10μm 억제제(SB 431542)를 24시간 동안 처리하고 4% 파라포름알데히드로 고정합니다. 세포를 20분 동안 항{4}}SMA 및 항-사이토케라틴{6}}으로 염색했습니다. 세포 핵을 확인하기 위해 Hoechst 염료 H33342로 공동 염색을 수행했습니다. -SMA(ac)의 발현은 변화가 없었으나 HK{14}} 세포의 KRT8(df) 및 HUVEC(gi) 발현의 GFP는 TGF에 의해 유의하게 변화되었습니다{16}}(변화하는 성장인자-)(5 ng/mL) 및 억제제(B, C). HUVEC의 전체 길이에서 TGF에 의해 얇은 혈관은 증가했지만 두꺼운 혈관은 감소했습니다- 1(변화하는 성장인자-). 얇은 용기와 두꺼운 용기 모두에서 직경이 증가했습니다. 이러한 결과는 억제제 SB431542(D, E)에 의해 역전되었습니다. 현미경 사진의 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
cistanche의 용도: 만성 신장 질환 치료
2.3. TGF- 1(변화하는 성장인자-)다중 구획 구조로 칩의 세 가지 셀 유형에 영향
TGF를 연구하려면{0}}(변화하는 성장인자-)제안된 3D 칩의 응답을 확인하기 위해 각 구획에 대해 개별적으로 면역 염색을 수행했습니다(그림 3). 1차 인간 신장 섬유아세포를 이 분석에 사용했습니다. 샘플은 FACS를 사용하여 분석되었고 섬유아세포 마커 항체에 대해 양성인 것으로 확인되었습니다. TGF- 1와 함께 세 가지 세포 유형의 배양 후(변화하는 성장인자-)24시간 동안 면역염색을 수행하여 -SMA 및 KRT8의 발현을 평가하였다. a-SMA의 발현은 TGF-1 처리에 의해 상향조절되었고, TGF- 1에서는 반대의 결과가 관찰되었습니다.(변화하는 성장인자-)억제제 치료. 반대로, KRT8의 발현은 TGF에 의해 하향조절되었습니다- 1(변화하는 성장인자-)TGF-에 반대되는 반응을 보였다.(변화하는 성장인자-)억제제(그림 4A-C).
그림 3. 제조 및 실험 일정의 장치 도식 데모가 있는 샘플 이미지.(A) 위의 두 이미지는 레이아웃을 보여줍니다. 왼쪽 이미지는 장치의 전체 하향식 사진을 보여줍니다. 하단 이미지는 단면을 보여줍니다. 액체 가이드의 치수를 자세히 설명하는 개략도. (B)이 그림은 실험 일정을 설명합니다섬유증- 모방 장치. 각 웰에 대한 4단계 로딩 과정 (1) 총 1.5 uL의 하이드로겔 1이 중앙 채널로 자발적으로 유도됩니다. (2)중앙 채널은 5uL의 하이드로겔로 채워집니다. (3) 총 10uL의 하이드로겔 3이 저수지 바닥에 패턴화됩니다. (4) 총 200μL의 미디어가 분배됩니다. 빨간색 눈금 막대{15}} mm.
그림 4D-G에서 볼 수 있듯이 TGF- 1에 의해 모세관 모양의 가는 선의 길이가 크게 증가했습니다.(변화하는 성장인자-)GFP-HUVEC에서의 치료. 그러나 TGF에서 굵은 선의 굵기가 감소했습니다- 1(변화하는 성장인자-)처리된 HUVEC. HUVEC의 얇고 두꺼운 용기에 대해 평균적으로 직경이 감소했습니다. TGF의 경우{0}}(변화하는 성장인자-)3D 배양 칩에 inhibitor 처리를 한 결과, 굵은 선과 굵은 선의 전체 길이는 TGF- 1 처리와 반대의 경향을 보였다. 또한, 굵은 선의 길이는 무처리 대조군에 비해 증가하였다.
그림 4. 1차 신장 섬유아세포가 있는 3D 배양 HK-2 및 HUVEC의 변경.전체 세포를 3D 칩당 5x10도의 밀도로 플레이팅하고 5ng/mL TGF{4}}로 자극했습니다.(변화하는 성장인자-)또는 10μm 억제제(SB 431542)를 24시간 동안 처리하고 4% 파라포름알데히드로 고정합니다. (A) 3D 칩의 세포를 anti-o -SMA 및 anti-cytokeratin-8으로 염색했습니다. TGF{13}}(5ng/mL)에 의해 -SMA(ac)의 발현이 증가하고 KRT8(df) 발현이 유의하게 감소했습니다. HUVEC의 총 길이 TGF-ß1에 의해 얇은 혈관이 급격히 증가하고 두꺼운 혈관이 감소했습니다.(변화하는 성장인자-)(D, E). 얇은 혈관과 두꺼운 혈관(F, G)의 경우 직경이 감소했습니다. 이러한 결과는 억제제 SB431542에 의해 역전되었습니다. 현미경 사진의 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81는 염증 매개체 및 성장 인자를 조절합니다
다음으로, 우리는 상등액에서 염증성 사이토카인과 성장 인자를 조사했습니다. IL-1 , FGF-2, TGF- 2(변화하는 성장인자-)및 TGF- 3(변화하는 성장인자-)동일한 총 세포 수를 가지고 있음에도 불구하고 잘 배양된 2D 섬유아세포보다 3D 배양 칩에서 단백질 분비가 극적으로 더 높았다. 그러나 TGF- 1(변화하는 성장인자-) 2D 또는 3D 배양 모델이 비슷한 농도의 TGF로 처리되었기 때문에 수준은 비슷했습니다- 1(변화하는 성장인자-)(그림 5A-E). 특히, 인간 1차 신장 섬유아세포로부터 FGF-2의 방출은 2D 단층 배양의 20.9 ± 0.4 pg/day/5×10도 세포 및 3094.8± 0.2 pg/day/5× 10도 세포(처리되지 않은 대조군에서 3D 배양 칩의 HUVEC 및 HK{17}} 포함). TGF에 의한 FGF의 분비{21}}(변화하는 성장인자-)자극은 2D 배양의 경우 31.0±0.2pg/day/5×10도 세포, 3D 배양의 경우 3683.9± 0.8pg/day/5×10도 세포였습니다. - 배양 칩. 2D 단층 배양에서 FGF{15}} 단백질 생산의 이러한 증가는 TGF에 의한 3D 배양 칩 모델의 증가와 병행되었습니다.{19}}(변화하는 성장인자-)치료(그림 5B).
그림 5. 신장 섬유증 모방 플랫폼으로서 2D 및 3D 배양 모델의 비교.세포를 2D 웰 또는 3D 칩당 5x10도의 밀도로 플레이팅하고 5ng/mL TGF- 1로 자극했습니다.(변화하는 성장인자-)또는 24시간 동안 10um 억제제(SB 431542). 1차 인간 신장 섬유아세포는 2D 배양 및 3D 배양 모델에 사용되었습니다. 섬유아세포는 HUVEC 및 HK{9}}와 함께 배양된 8×10* 밀도로 활용되었습니다. 1차 인간 신장 섬유아세포 대 HUVEC 비율 또는 F: H 비율은 평가를 위해 1:5였습니다.섬유증.HK{0}} 셀은 2×104의 밀도로 사용되었습니다. 상층액에서 (A)IL-1 ,(B) 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2) 및 (CE)TGF-베타 1, 2 및 3의 검출은 의 다중 분석에 의해 수행되었습니다. 사이토카인 및 다중 비드 면역검정. 각 막대는 평균± SE를 나타냅니다.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(변화하는 성장인자-).
cistanche tubolosa 혜택: 신장 질환 치료
또한, IL-1, IL-6, IL-8 및 TNF-와 같은 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 추정했습니다. 결과는 재조합 인간 TGF에 의해 크게 하향조절되었습니다- 1(변화하는 성장인자-)3차원 배양 칩에서 TGF의 항염증 특성으로 치료(변화하는 성장인자-). TGF{0}}에 의해 mRNA 발현이 상향 조절된다는 사실을 발견했습니다.(변화하는 성장인자-)억제제(SB431542). 또한, IL-6, IL{3}} 및 TNF-의 억제제 매개 발현은 처리되지 않은 대조군에 비해 특이적으로 하향조절되었습니다(그림 6A-D). 섬유증 인자인 VEGF의 mRNA 수준은 TGF에 의해 유의하게 증가했습니다- 1(변화하는 성장인자-)치료. VEGF의 mRNA 수준은 TGF{0}} 억제제에 의해 감소한 반면(그림 6E), 항섬유증 효과가 있는 IL{2}}의 mRNA 발현은 TGF에 의해 유도된 섬유증 상태에서 감소했습니다- 1 . 대조적으로, I{5}}mRNA 발현은 TGF{6}}억제제 처리에 의해 증가되었습니다(그림 6F).
그림 6. Real-time PCR은 3D 칩의 전체 mRNA 발현을 보여줍니다.세포를 3D 칩당 5x10도의 밀도로 플레이팅하고 5ng/mL TGF- 1로 자극했습니다.(변화하는 성장인자-)또는 24시간 동안 10um 억제제(SB431542). 3D 배양 칩에서 추출한 총 RNA입니다. (A)IL-1 ,(B)TNF- ,(C)IL-6 및 (D)IL-8의 mRNA 발현은 TGF{ {10}}(변화하는 성장인자-)치료. (E) 혈관신생 인자로서의 VEGF 발현이 증가하였다. (F) 항섬유화 인자인 IL-10 발현은 TGF- 1에 의해 유의하게 감소되었습니다.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(변화하는 성장인자-).
