보존된 시스테인이 풍부한 분비 단백질 MaCFEM85는 MsWAK16과 상호 작용하여 식물 방어를 활성화합니다.

추상적인: Metarhizium anisopliae숙주 식물에서 내생식물로 작용할 때 식물의 성장과 저항성을 향상시킬 수 있는 곤충병원성 곰팡이입니다. 그러나 단백질 상호작용이나 활성화 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 곰팡이 세포외막(CFEM) 단백질에서 흔히 발견되는 단백질은 식물 저항 반응을 억제하거나 활성화하는 식물 면역 조절제로 확인되었습니다. 여기에서 우리는 주로 원형질막에 국한된 CFEM 도메인 함유 단백질 MaCFEM85를 확인했습니다. 효모 2-하이브리드(Y2H), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 풀다운 및 이중 분자 형광 보완 분석을 통해 MaCFEM85가 a의 세포외 도메인과 상호작용한다는 것을 입증했습니다.메디카고 사티바(알팔파) 막 단백질, MsWAK16. 유전자 발현 분석에 따르면 MaCFEM85와 MsWAK16은M. 아니소플리에그리고M. 사티바, 각각 공동 접종 후 12시간에서 60시간까지. 추가 효모 2-하이브리드 분석 및 아미노산 부위별 돌연변이는 CFEM 도메인과 52번째 시스테인이 MaCFEM85와 MsWAK16의 상호 작용에 특히 필요하다는 것을 나타냅니다. 방어 기능 분석에서는 JA가 상향 조절되었지만 모델 숙주 식물 Nicotiana benthamiana에서 MaCFEM85 및 MsWAK16의 일시적인 발현에 의해 Botrytis cinerea 병변 크기 및 Myzus persicae 번식이 억제되는 것으로 나타났습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 M. anisopliae와 숙주 식물의 상호 작용을 뒷받침하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

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키워드: 벽 관련 키나제; CFEM; 메타히지움 아니소플리애(Metahizium anisopliae); 식물면역; 메디카고 사티바

1. 소개

식물과 미생물 사이의 상호작용은 널리 퍼져 있으며 과거와 현재 진행 중인 공진화의 결과입니다. 이러한 상호 작용은 각 참가자에게 유익하거나 중립적이거나 불리한 결과를 가져올 수 있습니다[1-3]. 유익한 근권 미생물군은 토양 매개 질병을 예방하거나 영양분 흡수를 향상시켜 식물 성장을 촉진하고 전반적인 건강을 향상시킬 수 있습니다[4,5]. 광범위한 유익한 미생물은 영양분 흡수, 성장, 병원체 및 곤충 방어와 같은 식물 능력을 향상시킬 수 있습니다[6,7]. Metarhizium Sorokın은 식물에 서식하는 능력을 가진 중요한 곤충병원성 균류이지만 [8], 이 속의 구성원이 식물 병원체 저항성을 향상시킬 수 있다는 증거도 있습니다. 예를 들어, 실험실 연구에서는 Fusarium solani(Mart.) Sacc가 60% 억제되는 것으로 나타났습니다. Metarhizium robertsii(이전에는 M. anisopliae로 알려짐)가 있는 대조군과 M. robertsii가 없는 대조군을 비교했습니다[9]. 일부 Metarhizium 계통은 식물 방어 유전자의 발현을 변경하여 해충 및 질병에 대한 식물 저항성을 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. M. Roberts의 내생균 집락화는 옥수수 잎에서 자스몬산(JA)과 살리실산(SA) 방어 경로 모두의 발현을 활성화합니다. 더욱이, 이러한 군집화는 식물 성장 촉진 및 Agrotis 입실론(Hufnagel) 유충 발달 억제와 관련이 있습니다[10]. Metarhizium guizhouense는 Lansium parasiticum의 과일 껍질에서 -1,3-glucanase와 chitinase를 활성화시켜 Botrytis sp.의 성장을 억제했습니다. 및 Fusarium sp. Aglaia dookkoo Griff의 열매 [11]. 또한 M. anisopliae를 땅콩 묘목에 적용한 경우 WRKY, MYC, TGA 및 에틸렌 반응 전사 인자를 포함한 다양한 전사 인자가 활성화되었으며, 탈수 반응 요소에 결합하는 질산염 수송체 및 단백질도 차별적으로 발현되었습니다 [12] . 이는 M. anisopliae가 식물에 서식하면서 식물 방어 유전자를 조절한다는 것을 의미합니다. 그러나 Metarhizium 감염 후 식물 방어 반응의 기본 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 상대적으로 적습니다. 효과기는 미생물이 식물 저항성을 조절하는 일반적인 수단입니다[13]. 식물 저항성의 활성화는 일반적으로 산화 폭발과 호르몬, 대사산물 및 기타 신호의 유도를 특징으로 합니다. 식물 호르몬인 SA와 JA는 두 가지 별도의 방어 신호 전달 경로를 중재하여 식물 저항성을 유도하는 데 중요한 역할을 합니다. SA 신호 전달 경로는 주로 식물 알레르기 반응과 병원체에 대한 전신 획득 저항에서 기능하지만, 쏘는 곤충 먹이에 의해 유도되는 간접적인 식물 방어 반응에도 관여할 수 있습니다[15]. SA의 축적은 지질 전달 단백질(LTP) 및 페닐알라닌 암모니아 분해효소(PAL)를 코딩하는 유전자의 발현 증가와 관련이 있으며, 이는 플라보노이드 및 리그닌과 같은 하류 특수 대사산물의 합성 및 축적을 매개합니다[17]. JA 신호 전달 경로는 기계적 손상, 곰팡이 병원체 및 해충에 대한 직간접적인 반응으로 기능합니다. 연구에 따르면 JA 신호전달은 광범위한 생물학적 기능을 갖는 테르페노이드, 페닐프로파노이드 및 알칼로이드와 같은 특수 대사산물의 합성에 규제 효과가 있는 것으로 나타났습니다[18]. Taxus 종의 파클리탁셀[19,20], Centella Asiatica(L.) Urban의 테르페노이드[21], 인삼의 사포닌[22]을 포함하여 일부 특수 대사산물은 methylJA(MeJA) 처리 후 식물 세포에 축적되는 것으로 나타났습니다. . SA와 키토산(CHT)을 유도제로 적용하면 토마토에서 리그닌 축적과 방어 효소 반응이 유도되어 Ralstonia solanacearum(Smith) Yabuuchi 감염의 발생률이 감소했습니다. 또한 밀의 JA 및 SA 수준은 유발인자 PeaT를 적용하여 크게 축적되어 귀리 진딧물 Sitobion avenae(Fabricius)에 대한 방어 반응을 향상시켰습니다. 이는 식물 면역이 식물 호르몬과 대사산물을 통해 이러한 효과기에 의해 조절될 수 있음을 나타냅니다.

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곰팡이 세포외막(CFEM) 단백질에 공통적으로 존재하는 단백질은 광범위한 곰팡이에 존재합니다. 이는 일반적으로 길이가 60개 아미노산(aa)이고 특징적으로 간격을 둔 8개의 시스테인을 포함하는 도메인을 암호화합니다[25]. CFEM 도메인은 숙주-병원체 상호작용에서 세포외 수용체, 신호 변환기 또는 접착 분자로 기능하는 표피 성장 인자(EGF) 유사 도메인과 유사합니다[26]. CFEM 도메인을 포함하는 단백질은 효과기 역할을 하여 식물 저항 반응을 조작할 수 있습니다. 밀잎 녹병균 Puccinia triticina Erikas에서 CFEM 효과기 후보 PTTG_08198는 세포 사멸의 진행을 가속화하고 활성 산소종(ROS) 축적을 촉진했습니다[27]. 탄저병 곰팡이인 Colletotrichum graminicola(Ces.) GW Wils에는 Nicotiana benthamiana Domin에서 BAX에 의해 유도된 프로그램된 세포 사멸을 억제하는 것으로 밝혀진 5개의 효과기(CgCFEM6, 7, 8, 9 및 15)가 포함되어 있습니다[28]. 식물공생 균근균 Laccaria bicolor (Maire) PDOrton은 공생 조직에서 Lac310796, Lac296573 및 Lac296572와 같은 여러 CFEM 단백질을 분비하는 것으로 보고되었습니다 [29]. 이들 단백질의 복잡한 기능은 균근 공생에서 더 이상 연구되지 않았지만, 이전 결과는 CFEM 단백질이 균류와 식물 사이의 신호 전달에 기능할 수 있음을 시사합니다. M. anisopliae는 숙주 식물에서 곤충병원성 또는 내생균으로 기능할 수 있습니다[30]. 그러나 CFEM 단백질의 역할은 아직 보고되지 않았습니다. 우리는 이전에 M. anisopliae, MaCFEM85(GenBank ID: MZ682609)에서 CFEM 도메인 함유 단백질을 확인했습니다[31]. 여기에서는 MaCFEM85와 Medicago sativa 벽 관련 키나아제 MsWAK16 사이의 관계에 대해 보고합니다. 우리는 MaCFEM85 서열을 분석하고 실험을 수행하여 MsWAK16과의 상호 작용에 중요한 잔류물을 확인했습니다. 마지막으로 N. benthamiana를 모델 식물로 사용하여 MaCFEM85 및 MsWAK16의 일시적인 발현 유무에 관계없이 Botrytis cinerea 및 진딧물 Myzus persicae에 대한 식물 방어 반응을 평가했습니다.

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2. 결과

2.1. MaCFEM85는 비병원성 곰팡이 CFEM과 가장 밀접하게 관련되어 있으며 혈장 막에 국한되었습니다.

MaCFEM85와 병원성 및 비병원성 모델 곰팡이의 다른 CFEM 단백질 간의 관계를 분석하기 위해 계통수를 구축했습니다. 여기에는 Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum(Schl)., Neurospora crassa Shear & BODodge 및 Beauveria bassiana(Bals.)가 포함됩니다(섹션 4 참조). MaCFEM85는 B. bassiana의 CFEM 단백질과 가장 밀접하게 관련되어 있으므로 진화적으로 병원성 진균보다 비병원성에 더 가깝습니다(그림 1a).

그림 1a

2.2. MaCFEM85는 M. sativa와의 상호 작용 중에 상향 조절되었습니다.

벽 관련 수용체 유사 키나아제(WAK)는 수용체 유사 단백질 키나아제(RLK) 수퍼패밀리 내의 하위 그룹을 나타내며 세포외 도메인, 막횡단 나선 및 세포내 키나제 도메인을 포함합니다. 이들은 식물 성장, 발달, 스트레스 반응 및 병원체 저항성 신호 전달 경로를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. MaCFEM85 및 MsWAK16의 발현 패턴을 조사하기 위해 공동 배양 후 M. anisopliae 균사와 M. sativa 뿌리에서 RNA를 추출했습니다. MaCFEM85와 MsWAK16은 모두 12~60시간의 공동 인큐베이션 동안 상당히 높은 수준으로 발현되었습니다(그림 1c,d). 0시부터 36시간까지 MaCFEM85 발현은 점차 증가하여 36시간에 최고조에 달했습니다. M. anisopliae 단독으로 자란 것에 비해 M. anisopliae와 M. sativa의 조합에서 × 593배 더 높게 발현되었습니다. MaCFEM85 발현은 48~60시간 동안 약간 감소했지만 단독으로 자란 M. anisopliae보다 훨씬 더 높은 수준으로 여전히 발현되었습니다. MsWAK16은 또한 상당히 상향조절되었으며, 발현은 36시간에 최고조에 달했습니다. M. anisopliae에 감염된 M. sativa에서 MsWAK16은 M. anisopliae가 없는 M. sativa보다 × 89.06배 더 높게 발현되었습니다. 36시간부터 60시간까지 MsWAK16의 수준은 약간 감소했지만 그 발현은 접종되지 않은 식물에 비해 여전히 상당히 높았습니다.

2.3. MaCFEM85는 시험관 내 및 생체 내에서 MsWAK16과 상호 작용합니다.

M. anisopliae 처리에 반응하는 MaCFEM85의 잠재적 기능 메커니즘을 조사하기 위해 MaCFEM85와 상호 작용하는 숙주 단백질을 사전에 식별하기 위해 효모 2-하이브리드(Y2H) 스크린을 수행했습니다. MsWAK16(MsWAK16-ED)의 세포외 도메인과 MaCFEM85 사이의 상호 작용은 pGBKT7의 MaCFEM85를 BD 벡터로 사용하고 pGADT7의 MsWAK16을 AD 벡터로 사용하여 일대일 효모 2-하이브리드 분석으로 검사했습니다. 형질전환된 효모는 모두 SD-T/L 결핍 배지에서 잘 자랐고, 양성대조군과 실험군은 SD-T/L/H/A + X{17}}gal 결핍 배지에서 성공적으로 자랐다. 이는 MaCFEM85가 MsWAK16-ED(그림 2a)와 상호 작용할 수 있음을 나타냅니다.

그림 2. MaCFEM85와 MsWAK16 간의 상호 작용 검증.

시험관 내 검증을 위해 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 태그가 붙은 MsWAK16-ED(60 kDa의 생성물을 코딩함)를 pGEX6-P2에 삽입하고 폴리히스티딘(His) 태그가 붙은 MaCFEM85( 17kDa의 제품을 인코딩)이 pET에 삽입되었습니다.-21b. His 및 GST 항체를 사용한 면역블로팅은 재조합 단백질 MaCFEM85-Hi가 GST-MsWAK16-ED 먹이와 상호작용했지만 GST 단독과는 상호작용하지 않았으며 GST-MsWAK16- ED가 His와 상호작용했음을 보여주었습니다. -MaCFEM85(그림 2b). MaCFEM85와 MsWAK16 사이의 상호 작용을 추가로 확인하기 위해 MaCFEM85-YFPN 및 MsWAK16-YFPC 구조를 사용하여 BiFC(이분자 형광 보완) 분석을 수행했습니다. 담배 잎에서 MaCFEM85-YFPN과 MsWAK16-YFPC의 동시 발현은 노란색 형광 신호를 생성하여 MaCFEM85가 MsWAK16과 상호작용함을 나타냅니다(그림 2c).

2.4. MaCFEM85 및 MsWAK16 상호 작용을 위한 주요 사이트

MsWAK16-ED와의 상호작용에 필요한 MaCFEM85 영역을 정의하기 위해 온라인 소프트웨어 SMART를 사용하여 단백질 도메인을 예측했습니다(그림 3a). MaCFEM85에는 19-86 aa 지역에 CFEM 도메인이 포함되어 있습니다. 3차 구조도 예측되었습니다(그림 3b). 이 도메인의 8개 시스테인은 4개의 이황화 결합(CYS26 및 CYS69, CYS30 및 CYS64, CYS43 및 CYS50, CYS52 및 CYS85)을 생성하여 단백질의 안정성을 유지합니다(그림 3b). MaCFEM85의 추정 상호작용 부위를 검증하기 위해 7개의 돌연변이 버전의 단백질을 생성하여 pGBKT7에 미끼 단백질로 삽입했습니다. 각 재조합 벡터는 Y2H Gold 균주에서 AD-MsWAK16-ED와 함께 공동 형질감염되었습니다. CYS52가 돌연변이된 균주는 선택적 배지에서 성장하지 않았으며(그림 3c, 빨간색 윤곽선) 이는 MaCFEM85와 MsWAK16-ED의 상호 작용에 CYS52가 필요함을 나타냅니다.

2.5. MaCFEM85와 MsWAK16의 상호 작용은 식물 면역 반응을 활성화합니다

2.5.1. B. cinerea에 대한 질병 저항성에서 MaCFEM85 및 MsWAK16의 역할 평가

병원체 방어 반응에 MaCFEM85 및 MsWAK16이 관여할 수 있는지 알아보기 위해 MaCFEM85, MsWAK16 또는 MaCFEM85 및 MsWAK16의 과발현이 B. cinerea에 대한 저항성을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사했습니다. 우리는 N. benthamiana 잎에서 이러한 벡터를 일시적으로 표현했습니다. Western blot 분석에서는 MaCFEM85와 MsWAK16이 단독으로 또는 함께 발현되었을 때 비슷한 수준으로 발현되었으며, 이는 MaCFEM85와 MsWAK16이 담배에서 성공적으로 발현되었음을 보여줍니다(그림 4a). 질병 분석은 또한 MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 또는 GFP 대조군이 침투된 N. benthamiana를 사용하여 수행되었습니다. 대조군 식물과 비교하여 MaCFEM85, MsWAK16 또는 MaCFEM{19}}MsWAK16이 침투된 잎에서 병변은 상당히 작았습니다(접종 후 2일에 ~30%)(그림 4b). 이러한 데이터는 N. benthamiana에서 MaCFEM85의 일시적인 발현이 B. cinerea에 대한 저항성을 증가시켰으며 MaCFEM85 및 MsWAK16이 B. cinerea에 대한 방어 반응을 긍정적으로 조절했음을 보여줍니다.

그림 3. MaCFEM5와 MsWAK16 사이의 상호 작용 사이트 식별.

그림 4. MaCFEM85 및 MsWAK16의 일시적 발현에 의한 식물 저항성 유도.

2.5.2. N. benthamiana의 진딧물 방어에서 MaCFEM85 및 MsWAK16의 역할 평가

MaCFEM85 및 MsWAK16의 역할을 추가로 조사하기 위해 MaCFEM85 및 MsWAK16을 일시적으로 발현하는 N. benthamiana 식물을 M. persicae로 감염시키고 개체군을 평가했습니다. 이 실험을 위해, 각각의 N. benthamiana 잎의 큰 면적에 MaCFEM85 및 MsWAK16을 함유하는 재조합 이진 벡터 pYBA1132가 농약침투되었습니다. GFP가 대조군으로 사용되었습니다. 침투 12시간 후, 20 M. persicae 성충을 각 잎에 가두어 침투된 부위를 진딧물에 노출시켰습니다. 다음 3일 동안 성체 진딧물 사망률과 약충의 수를 기록했습니다. 그런 다음 님프가 제거되었습니다. MaCFEM85, MsWAK16 또는 MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0.30081을 발현하는 식물을 먹는 M. persicae 개체군 사이에는 사망률 위험에 큰 차이가 없었습니다. ) (그림 4c). 그러나 24, 48, 72시간에 각 성충 진딧물이 생산한 평균 자손 수는 MaCFEM85, MsWAK16 또는 MaCFEM85+MsWAK16을 발현하는 진딧물에 비해 GFP 대조군을 발현하는 N. benthamiana에서 훨씬 더 높았습니다(그림 4d).

2.5.3. 호르몬 축적 및 호르몬 관련 유전자 발현에서 MaCFEM85 및 MsWAK16의 역할 평가

eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 및 MaCFEM85+MsWAK16을 발현하는 N. benthamiana 식물의 방어 반응 간의 차이를 분석하기 위해 JA, SA 및 총 플라보노이드 수준과 관련 유전자의 발현을 측정했습니다. 결과는 eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 및 MaCFEM85+MsWAK16을 발현하는 식물 간에 JA 및 SA 수준이 다르다는 것을 보여주었습니다(그림 5a). eGFP를 발현하는 식물과 비교하여 MaCFEM85를 발현하는 식물에서 JA 수준이 상당히 낮았습니다. SA 수준은 약간 증가했지만 차이는 크지 않았습니다. 대조적으로, MsWAK16을 발현하는 식물은 eGFP 대조군과 비교하여 JA 수준에서 유의미한 차이를 보인 반면, SA 수준은 대조군보다 유의하게 낮았습니다(그림 5a). JA 및 SA 수준은 eGFP와 비교하여 MaCFEM85+MsWAK16을 발현하는 식물에서 각각 크게 증가하고 감소했습니다.

그림 5. 호르몬 수치와 호르몬 반응 유전자 발현

총 플라보노이드 함량은 다른 모든 처리 그룹에 비해 MaCFEM85+MsWAK16을 발현하는 식물에서 상당히 높았습니다(그림 5a). 생합성 유전자 발현 수준은 MsWAK16 및 MaCFEM85+MsWAK16을 발현하는 식물에서 유사했습니다. 예를 들어, JA 반응과 관련된 유전자, 즉 COI1, MYC2 및 PDF1.2는 GFP를 발현하는 식물에 비해 상당히 상향 조절되었습니다(그림 5b). 유사하게, SA 관련 유전자 NPR1, WRKY70 및 PR1은 MsWAK16 및 MaCFEM85+MsWAK16을 발현하는 식물에서 상당히 차등적으로 발현되었습니다. NPR1은 상향 조절된 반면, WRKY70 및 PR1은 대조군에 비해 하향 조절되었습니다(그림 5b). 우리는 또한 플라보노이드 합성과 관련된 Shikimic acid 및 phenylpropanoid 합성 경로에서 주요 유전자의 발현을 조사했습니다. 일반적으로, MaCFEM85 단독의 발현은 담배에서 이들 유전자의 유의미한 더 높은 발현을 유도하지 못했습니다. 그러나 이들 유전자는 GFP 대조군과 비교하여 MsWAK16 또는 MsWAK16+MaCFEM85를 발현하는 담배에서 상향조절되었습니다(그림 5c).

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3. 토론

3.1. 보존된 CFEM 단백질 모티프는 곰팡이 종에서 다양한 기능을 제공합니다

CFEM 도메인은 곰팡이에 고유하며 일반적으로 곰팡이 세포외 막 단백질에서 발생합니다. 이 영역은 자낭균문(Ascomycota)과 담자균문(Basidiomycota)의 가장 최근의 공통 조상에서 유래되었습니다[33]. 최근 연구에 따르면 곰팡이 병원체의 CFEM 단백질은 식물 면역 조절 인자로 작용하여 감염 유형에 따라 숙주 식물의 면역 억제 또는 활성화를 일으킬 수 있는 것으로 나타났습니다[28,34,35]. M. anisopliae의 CFEM 도메인 함유 단백질에 대한 보고는 거의 없었으며, 이는 다른 곰팡이와의 진화적 비교의 맥락에서만 가능합니다[36]. 이 연구에서 우리는 병원성 및 비병원성 진균 모두에서 M. anisopliae CFEM 단백질을 다른 알려진 CFEM 단백질과 비교했습니다. 우리는 MaCFEM85의 가장 가까운 상동체가 해당 종의 12개 CFEM 단백질 중 하나인 Beauveria bassiana에서 발견되는 Cfem5임을 확인했습니다(보충 그림 S1). BbCfem5는 철분 획득에 필수적입니다[37]. 또한 예측된 3차 구조를 기반으로 MaCFEM85의 CFEM 도메인은 Candida albicans(CPRobin) Berkhout에서 발견된 표면 항원 단백질 2(CSA2)와 매우 유사하며, 여기서 65개 잔기(서열의 96%)가 99.8로 모델링되었습니다. % 신뢰도 [31]. 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 동물 병원체입니다. CSA2는 헤모글로빈에서 헴을 추출하고 세포벽에서 혈장으로 헴을 운반함으로써 성장과 병원성에서 중요한 역할을 합니다[38-40]. 우리는 MaCFEM85가 곤충 숙주의 M. anisopliae 독성에 관여할 수 있다고 가정합니다. 동물 병원성 감염과 식물 면역 활성화에서 MaCFEM85의 이러한 결합된 기능은 이 단백질을 흥미로운 미래 연구 초점으로 만듭니다.

3.2. 이황화 결합은 단백질 기능에 중요한 구조입니다

단백질 구조의 구조적 완전성은 기능 능력과 직접적인 관련이 있습니다. 시스테인 쌍에 의해 형성된 이황화 결합은 단백질 접힘 및 구조적 안정성을 촉진하며 특정 수용체 ​​또는 리간드의 인식 및 결합을 위한 핵심 부위를 형성하는 것으로 간주됩니다[41]. 예를 들어, 식물 병원체 Cladosporium fulvum effector 단백질 AVR4에서 세 가지 보존된 이황화 결합 중 하나를 파괴하면 프로테아제 민감성과 키틴 결합 능력이 감소합니다 [42]. 세 가지 다른 C. fulvum 단백질(ECP1, ECP2 및 ECP5)에서 시스테인에 대한 알라닌의 단일 치환은 토마토 과민 반응을 약화시키며, 이는 시스테인이 안정성과 과민 반응 유도 활성을 유지하는 데 중요하다는 것을 나타냅니다[43]. 더욱이, Magnaporthe oryzae의 성숙한 단백질 MC69에서, 두 개의 보존된 시스테인 잔기(Cys36 및 Cys46)의 돌연변이 유발은 분비에 영향을 주지 않고 MC69 기능을 손상시킬 수 있으며, 이는 특히 MC69의 병원성에서 이황화 결합의 중요성을 암시합니다[44]. CFEM 도메인은 크기와 시스테인 잔기의 패턴이 3~4쌍의 이황화 결합을 포함하는 EGF 유사 도메인과 유사한 것으로 보입니다. EGF 단백질은 숙주-병원체 상호작용에서 세포 표면 수용체, 신호 변환기 또는 접착 분자로 기능할 수 있습니다[45]. 이 연구에서 우리는 MaCFEM85의 CFEM 도메인에 4쌍의 이황화 결합을 형성하는 8개의 보존된 시스테인이 포함되어 있음을 발견했을 뿐만 아니라(그림 3b), CFEM이 MaCFEM85와 MsWAK16 사이의 상호 작용에 중요한 도메인이라는 것도 확인했습니다. 또한 시스테인 잔기의 알라닌으로의 부위 지정 돌연변이를 통해 위치 52의 시스테인 잔기가 상호 작용에 필요한 핵심 부위임을 발견했습니다 (그림 3c). 이러한 결과는 CFEM85-WAK16 상호작용의 생리학적 기능에 대한 추가 연구의 기초를 제공합니다.

3.3. MaCFEM85와 MsWAK16 활성화 식물 방어의 상호 작용

미생물-식물 상호작용에서 식물 방어 반응은 일반적으로 미생물 이펙터 단백질에 의해 활성화됩니다. 유도 방어는 저항성을 촉진하기 위한 생물학적 해충 방제의 중요한 도구가 되고 있습니다. CFEM 단백질은 식물 면역 활성화 또는 억제 조절에 관여하는 효과기로 확인되었습니다[28,46]. 그러나 이러한 면역 인자의 조절을 식물 질병 및 해충 저항성에서의 특정 역할과 연결하는 발표된 연구는 부족합니다. 이 연구에서 우리는 M. sativa에서 MaCFEM85와 세포벽 관련 키나아제 MsWAK16 사이의 상호 작용을 확인하기 위해 곤충병원성 및 내생균인 M. anisopliae를 사용했습니다. 결과는 이 상호 작용이 B. cinerea 접종 후 병변 비율을 감소시키고(그림 4b) M. persicae의 개체군 성장률을 감소시키는 것으로 나타났으며(그림 4d), 이는 MaCFEM85와 MsWAK16 사이의 상호 작용이 진딧물에 대한 M. sativa 저항성을 증가시켰음을 나타냅니다. JA, SA 및 에틸렌(ET) 수준의 변화는 식물 저항성 유도를 평가하는 지표로 사용될 수 있습니다[47,48]. 여기에서 우리는 MaCFEM85가 MsWAK16과 상호 작용하여 호르몬 조절을 통해 식물 저항성에 영향을 미치고 M. persicae의 번식률을 억제한다는 것을 입증했습니다 (그림 4d). 유사한 연구가 이전에 보고되었습니다. 예를 들어, Brevibacillus laterosporus 이펙터 단백질 PeBL1은 토마토에서 JA 및 SA 축적을 유도하고 해당 식물을 먹은 M. persicae의 2세대 및 3세대 개체군의 성장률을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 이펙터를 뿌린 토마토 식물은 M. persicae에 대한 기피 효과가 있습니다 [49]. 일반 콩(Phaseolus vulgaris L.)에 유도 단백질 PeBC1을 적용하면 녹색 복숭아 진딧물에 뚜렷하고 심각한 준치사 효과가 나타납니다. PeBC1로 처리된 식물은 JA 및 SA와 관련된 유전자의 상당한 상향 조절을 보여줍니다. Beauveria bassiana elicitor PeBb1은 담배에서 M. persicae의 번식력을 감소시키고 JA 및 ET 관련 유전자의 발현을 유도합니다[51]. 본 연구에서, 담배에서 MaCFEM85 및 MsWAK16의 일시적인 발현은 JA 반응 관련 유전자 COI1, MYC2 및 PDF1.2(그림 5b)를 크게 상향 조절하고 JA 및 총 플라보노이드 함량을 증가시켰습니다(그림 5a). 이는 결과와 유사합니다. 위에서 설명한 대로 문헌에 나와 있습니다. 그러나 우리는 침투 후 12시간 동안 담배에서 높은 수준의 SA를 감지하지 못했고 MsWAK16 또는 MaCFEM85+MsWAK16을 일시적으로 발현하는 식물은 SA 수준이 크게 감소하고 SA 반응과 관련된 유전자의 하향 조절을 나타냈습니다(그림 5a,b) . 이는 다양한 식물 호르몬의 자극이 시너지 활동뿐만 아니라 누화 및 피드백으로 이어질 수 있어 식물이 다양한 자극에 적절하게 반응할 수 있음을 보여주었습니다. JA 수준은 증가했지만 SA 수준은 낮음이 이전에 식물에서 보고되었습니다. 예를 들어, SA 축적에 결함이 있는 A. thaliana에서는 JA 수준이 야생형 A. thaliana보다 25-배 더 높았고 JA 반응 유전자가 활성화되었습니다[52]. 또한 일부 박테리아는 식물의 JA 수준을 증가시켜 SA 축적을 억제하여 SA로 인한 피해를 피할 수 있다고 보고되었습니다. 예를 들어, Pseudomonas syringae는 JA 경로를 부정적으로 조절하는 독소인 coronatine을 통해 COI1 수용체를 표적으로 삼습니다. 이는 전사 인자 ANAC019, ANAC055 및 ANAC072[54]의 MYC{44} 유도된 상향 조절을 촉진하여 ICS1(SA 합성의 핵심 유전자)의 전사를 억제하여 SA 생성 및 신호 전달을 하향 조절합니다. 본 연구에서 MaCFEM85와 MsWAK16 사이의 상호 작용은 JA 축적과 JA 반응 유전자의 상향 조절을 증가시켰지만 SA 축적과 SA 관련 유전자의 전사를 억제했습니다. 이는 MaCFEM85와 MsWAK16 사이의 상호작용이 JA를 유도하여 진딧물에 대한 식물 저항성을 향상시킨다는 것을 나타냅니다.

MaCFEM85 및 MsWAK16을 일시적으로 발현하는 N. benthamiana에서는 JA 수준이 증가하고 B. cinerea 병변 크기는 이전 연구와 일치하여 감소했습니다(그림 4b). JA는 곤충 및 괴사성 병원체에 대한 식물 저항성에 관여합니다[52,55]. 괴사성 병원체인 B. cinerea는 JA 및 ET 축적에 의해 억제되었습니다[56]. A. thaliana ET 결핍 돌연변이 ein2-1 및 JA 반응 돌연변이 coi1-1에서 하류 방어 유전자인 PDF1.2의 수준이 크게 감소하고 B. cinerea에 대한 민감도가 향상되었습니다. 57]. 우리는 MaCFEM85 및 MsWAK16을 일시적으로 발현하는 N. benthamiana에서 JA 축적 및 JA 관련 유전자의 전사가 유의하게 증가하는 반면 SA의 축적 및 SA 관련 유전자의 전사는 억제된다는 것을 발견했습니다. MaCFEM85 및 MsWAK16 발현은 또한 B. cinerea에 대한 억제 효과를 보여주었습니다. 이는 JA가 MaCFEM85 및 MsWAK16에 의해 활성화되었으며 B. cinerea에 대한 식물 저항성에 주도적인 역할을 한다는 것을 나타냅니다.

4. 재료 및 방법

4.1. 곰팡이 균주, 식물 재료 및 배양 방법

Metarhizium anisopliae 분리 균주 Ma 9를 감자-설탕-한천(PSA) 배지(물에 삶은 껍질을 벗긴 감자 추출물 200g, 자당 20g 및 한천 15g/L)에서 배양했습니다. 10일 후에 신선한 포자낭 분말을 수집했습니다. 니코티아나 벤타미아나 식물은 14/10시간 명암 주기(27/25oC)를 갖는 인공 기후 챔버에서 재배되었습니다. Agrobacterium 매개 형질전환을 통한 일시적인 유전자 발현을 위해 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101을 Luria Broth(LB) 배지(10g 트립톤, 5g 효모 추출물 및 10g NaCl/L)에서 배양했습니다. 효모 균주 Gold(OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, China)를 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPDA) 배지(효모 추출물 10g, 펩톤 20g, 포도당 20g 및 아데닌 헤미황산염 0.03g/L)에서 배양했습니다. 각 벡터와 균주에 대해 적절한 항생제, 즉 리팜핀, 카나마이신 또는 암피실린(각각 25, 50 또는 50μg/mL)이 사용되었습니다. 본 연구에 사용된 균주와 플라스미드는 보충 표 S1에 나열되어 있습니다. 메디카고 사티바 종자를 75% 에탄올로 1분 동안 표면 멸균한 후, 50% NaClO(5.5%)로 15분 동안 멸균했습니다. 씨앗을 완전히 섞은 후 멸균수로 5분씩 3회 세척했습니다. 종자를 4℃ 암실에서 24시간 이상 배양한 후 밤새 실온에서 1% 물 한천 플레이트에서 발아시켰습니다. 발아 3일 후, 발달 중인 묘목을 접시당 20개의 묘목이 포함된 9-cm 멸균 페트리 접시의 여과지로 옮겼습니다. 처리군과 대조군은 각각 15개 접시에 할당되었습니다. 그런 다음 묘목을 107/mL를 함유하는 10mL의 M. anisopliae 포자 현탁액으로 관개하고 대조구를 10mL 멸균수로 관개했습니다. 0, 12, 24, 48, 60시간에 각 시간 간격마다 3개의 페트리 접시에서 무작위로 묘목을 채취했습니다. 샘플은 액체질소에서 냉동되었으며 -80 ◦C에 보관되었습니다.

4.2. qRT-PCR 및 플라스미드 구성

제조업체의 지침에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 M. anisopliae(균사) 및 M. sativa(뿌리)에서 총 RNA를 추출했습니다. 생성된 RNA의 품질과 풍부함은 NanoPhotometer®(Implen, Münich, Germany)를 사용하여 측정되었습니다. 제조업체의 지침에 따라 5× All-In-One RT Master Mix(Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA 합성(최대 2ug RNA)을 수행했습니다. qRT-PCR은 US EVER BRIGHT® INC.의 2xSYBR Green qPCR Master Mix와 ABI QuantStudio 5 시스템을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 각 유전자에 사용되는 프라이머는 보충 표 S2에 나열되어 있습니다. Maury [58], Msactin [59] 및 Nbactin [60]은 발현 데이터의 정규화를 위한 내부 참조 유전자로 사용되었습니다. 반응은 다음 조건에서 수행되었습니다: 95℃에서 5분, 95℃에서 15초, 60℃에서 40초를 40회 반복했습니다. 각 샘플에 대해 세 가지 기술적 복제물이 있었습니다. 상대 발현은 2−ΔΔCt 방법을 사용하여 계산되었습니다[61]. 통계적 유의성은 일원 분산 분석(ANOVA)과 SPSS v20.0(SPSS)의 Duncan의 다중 범위 테스트를 사용하여 결정되었습니다.

4.3. N. benthamiana에서 단백질의 일시적인 발현

MaCFEM85 코딩 서열(CDS)은 cDNA를 주형으로 사용하여 초충실도 DNA 중합효소로 증폭되었습니다. 세포내 국소화 분석을 위해 MaCFEM85에 대한 CDS를 포함하는 PCR 산물을 각각 pYBA{3}}eGFP(EcoRI 및 SalI로 분해) 및 pcambia{4}}체리(EcoRI 및 SacI)에 클로닝했습니다. 모든 구조는 시퀀싱(Tsingke Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China)을 통해 검증되었습니다. 본 연구에 사용된 프라이머는 보충 표 S2에 나열되어 있습니다. N. benthamiana에서 MaCFEM85-eGFP 및 MaCFEM85-mCherry의 일시적인 발현을 위해 A. tumefaciens 균주 GV3101을 각 플라스미드로 형질전환하고 PCR로 검증했습니다. Agrobacterium은 진탕하면서 28oC에서 밤새 배양되었습니다. 실온에서 5분간 5000rpm 원심분리를 통해 세포를 수집하고 멸균 이중 증류수로 3회 세척한 후 10mM MgCl2 완충액(10mM MES 및 10mM 아세토시린곤 함유, pH 5.7)에 재현탁시켰습니다. 세포 현탁액을 OD600을 0.5로 조정한 후 1-mL 주사기를 사용하여 4-~5-주령 N. benthamiana 잎의 밑면에 침투시켰습니다. 각 잎에는 50 μL A. tumefaciens가 침투되었습니다. 식물 당 3개의 잎을 처리하였고, 각 처리 그룹에는 3개의 식물을 처리하였다. 처리된 잎을 30시간 후에 수집하고 Zeiss LSM980 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 시각화하여 세포 내 위치를 확인했습니다.

남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능

4.4. 계통발생학적 분석

MEGA X의 이웃 결합 방법을 사용하여 계통수를 구성했습니다. 1000개의 부트스트랩 복제는 P-거리 모델을 사용했습니다. 트리를 생성하는 데 사용된 아미노산 서열은 관련 곰팡이(예: Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia theobromae, Gliocladium roseum)의 NCBI 데이터베이스에 대한 BLASTP 검색을 통해 얻었습니다. , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana 및 Paecilomyces lilacinus) MaCFEM85를 쿼리로 사용합니다.

4.5. 효모 2-하이브리드 분석

Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System(Clontech Laboratories, Inc., 현재 Takara Bio USA, Inc.)을 사용하여 MaCFEM85와 MsWAK16 간의 상호 작용을 확인했습니다. 신호 펩타이드가 없는 MaCFEM85를 pGBKT7에 미끼로 도입하고 MsWAK16의 세포외 도메인(MsWAK{6}}ED)을 먹이로 pGADT7에 삽입했습니다. 제조업체의 지침에 따라 Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™(ZYMO Research, CA, USA)을 사용하여 효모 수용 세포 준비 및 형질전환을 수행했습니다. 미끼와 먹이 플라스미드는 효모 균주 Gold로 공동 형질전환되었습니다. 단백질-단백질 상호작용은 SD 이중 드롭아웃 배지(DDO, SD/-Trp-Leu) 및 SD 4중 드롭아웃 배지(QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade) 플레이트에서의 성장을 기반으로 분석되었습니다.

4.6. BiFC 분석

BiFC 구조물을 생성하기 위해, pUC-SPYNE 및 pUC-SPYCE 벡터를 BamHI로 분해하여 선형화했습니다. MaCFEM85 및 MsWAK16의 전장 CDS를 각각 클로닝하고 재조합 효소를 사용하여 선형화된 플라스미드에 삽입하여 MaCFEM85-YFPN 및 MsWAK16-YFPC 구성물을 얻었습니다. MaCFEM85 및 MsWAK16을 포함하는 플라스미드는 음성 대조군(MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE 및 pUC-SPYNE + pUC-SPYCE)으로 빈 벡터를 사용하여 공동 형질전환되었습니다. . 모든 벡터는 위에서 설명한 대로 Agrobacterium 매개 형질전환을 통해 N. benthamiana에 도입되었습니다. Zeiss LSM980 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 잎 표피 세포에서 형광 신호를 관찰했습니다. 벡터 구성에 사용되는 프라이머는 보충 표 S2에 나열되어 있습니다.

4.7. GST 풀다운 분석

GST 풀다운 분석의 경우 MsWAK16-ED를 pGEX-6P-2 벡터에 삽입하고 MaCFEM85를 pET-21b에 삽입했습니다. 정제된 융합 단백질(GST- MsWAK16- ED)과 pGEX-6P-2 무부하 단백질(GST)을 미끼 단백질로 사용하고 정제된 pET-21 b-MaCFEM85 융합 단백질(His-MaCFEM85)을 먹이로 사용하였다. GST 풀다운 분석은 제조업체의 지침에 따라 Mag-Beads GST Fusion 단백질 정제 시스템(Sangon Biotech, Shanghai, China)을 사용하여 수행되었습니다. 간략하게, Mag-Beads를 1X 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 5회 세척하여 알코올 보호제를 방출한 다음 10mL의 GST 또는 GST-MsWAK16-ED를 첨가했습니다. 비드를 실온에서 30분 동안 반전시켜 혼합하였다. 상등액을 제거한 후 Mag-Beads를 1X PBS로 5회 세척했습니다. His-MaCFEM85를 이미 GST와 결합된 Mag-Beads에 첨가하고 혼합물을 회전시키면서 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. 그런 다음 비드를 1X PBS로 5회 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거했습니다. 이어서, 비드에 고정된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 멤브레인(100 V, 1시간)으로 옮긴 후 웨스턴 블롯을 통해 분석했습니다. 막을 PBS + Tween(PBST)으로 각각 10분 동안 3회 세척했습니다. 막을 5% 탈지유로 실온에서 2시간 동안 차단한 후 ProteinFind 항-His 마우스 단일클론 항체(TransGen Biotech, Beijing, China)(1:3000 희석) 또는 ProteinFind 항-GST 마우스 단일클론 항체와 함께 2시간 동안 배양했습니다. h 4 ◦C에서. 그런 다음 막을 ProteinFind 염소 항-토끼 IgG(H+L)(HRP) 항체(TransGen Biotech, Beijing, China)(1:5000 희석)에 실온에서 1시간 동안 담갔습니다. 제조업체의 지침에 따라 EasySee® Western Blot Kit(TransGen Biotech, Beijing, China)를 사용하여 막을 시각화했습니다.

4.8. MaCFEM85의 주요 사이트 식별

MaCFEM85와 MsWAK16의 상호 작용에 필요한 크기를 결정하기 위해 PCR 증폭을 수행하여 MaCFEM85의 여러 잘린 형태를 생성했습니다. CFEM 도메인(MaCFEM85-CFEM; aa 잔기 19–86) 및 CFEM 도메인이 없는 C 말단(MaCFEM85-C, aa 잔기 87–170)이 벡터에 삽입되었습니다. 미끼 단백질로서의 pGBKT7 (보충 표 S1). 위치 26, 30, 43, 52 및 26/30/43/50/52/64/69/85(ΔCFEM8526, ΔCFEM8530, ΔCFEM8543, Δ)에서 시스테인을 알라닌으로 돌연변이시키는 폴리펩티드 합성을 사용하여 또 다른 5개의 변이체를 구축했습니다. CFEM8552 및 ΔCFEM858 모두 각각). 이러한 변형은 MsWAK16-ED를 사용하여 Y2H 실험을 수행하는 데 사용되었습니다. 형질전환된 효모 세포를 X- -갈락토시다제(X{37}}Gal)를 함유하는 합성 드롭아웃 SD/-Trp-Leu 플레이트 및 SD/-Trp-Leu-His-Ade 플레이트에서의 성장에 대해 분석했습니다.

4.9. 식물 저항성 분석

Myzus persicae는 Henan Quanying Biological Co., Ltd.에서 입수했습니다. 생물검정 시작 1주일 전, 150마리의 진딧물 성충을 3개의 N. benthamiana 식물에 배치했습니다(식물당 50마리의 진딧물). 72시간 후, 모든 성충을 부드러운 예술가의 붓으로 제거하고, 진딧물 성능 분석을 위해 N. benthamiana로 옮기기 전에 추가로 4일 동안 약충을 먹이도록 허용했습니다.

4.10. 진딧물 성능 분석

니코티아나 벤타미아나 도민. (Solanales: Solanaceae)를 사용하여 M. persicae 성능, B. cinerea에 대한 식물 질병 저항성 및 호르몬 관련 유전자의 발현을 평가했습니다. pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 또는 pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16을 보유하는 아그로박테리움은 적절한 항생제가 보충된 LB에서 28°C에서 36시간 동안 배양되었습니다. 세포를 3회 세척한 다음, 침투 완충액(10mM MgCl2, 10mM MES 및 100μM 아세토시린곤, pH 5.6)에 재현탁하여 OD600이 0.6이 되도록 했습니다. 동시 감염을 위해 MaCFEM85와 MsWAK16을 보유하는 박테리아를 OD600 1.2로 조정한 다음 동일한 부피로 혼합했습니다. 1-mL 바늘 없는 주사기를 사용하여 완전히 확장된 잎에 박테리아를 침투시켰습니다. 3개의 잎을 각 식물에 침투시켰고 각 처리를 3개의 식물에 적용하여 실험당 총 12개의 식물을 사용했습니다.

진딧물 성능 분석을 위해, 아그로박테리움을 적용한 후 12시간 후에 각 잎의 침윤 영역에 20마리의 진딧물 성충을 적용했습니다. 진딧물은 직경 5mm 클립 케이지를 사용하여 가두었습니다. 각 치료는 5회 반복되었습니다. 성충 진딧물 사망률과 새로 낳은 약충의 수를 3일 동안 매일 기록했습니다. B. cinerea를 PDAY에 5일 동안 배양하였다. Agrobacterium 침윤 12시간 후 새로 배양한 B. cinerea를 5-mm 곰팡이 케이크에 펀칭하고 균사체 성장 표면을 잎 표면의 침윤 부위에 부착시켰다. 질병 발생을 촉진하기 위해 질병 진행을 촉진하기 위해 식물을 트레이에 플라스틱 필름으로 덮어 22°C에서 습도를 유지했습니다. 48시간 후, 병변 크기를 측정하여 접종된 잎에서 질병 진행을 추정했습니다. 관련 유전자의 상대적 발현을 정량화하기 위해 침투 후 12시간 동안 각 식물에서 침투된 3개의 잎을 수집한 다음 액체 질소에서 냉동하고 -80도에서 보관했습니다. 전체 RNA 추출, cDNA 합성 및 qRT-PCR은 섹션 3.2에 설명된 대로 수행되었습니다. 살리실산(SA), 자스몬산(JA) 및 플라보노이드 수준은 처리당 15개의 침투된 N. benthamiana 잎에서 측정되었습니다. 잎을 모아 액체질소에 얼린 후 -80도에 보관했습니다. 식물 호르몬은 Plant Salicycl Acid 및 Plant Jasmonic Acid ELISA Kits(Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.)를 사용하여 정량하였고, 플라보노이드는 Micro Plant Flavonoids Assay Kit(Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.)를 사용하여 다음과 같이 정량했습니다. 제조업체의 지침.

4.11. 통계 분석

데이터는 SPSS v20.0에서 분석되었습니다. MaCFEM85 및 MsWAK16의 발현 수준의 유의미한 차이는 스튜던트 t-테스트를 ​​사용하여 결정되었습니다. SA, JA 및 플라보노이드 수준의 유의미한 차이는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 및 Duncan의 다중 범위 테스트(역치 p < 0.05)를 사용하여 결정되었습니다.

5. 결론

이 연구에서 우리는 M. anisopliae에서 새로운 분비 단백질인 MaCFEM85를 확인하고 특성화했습니다. MsWAK16과 상호작용하고 N. benthamiana 방어 반응을 활성화할 수 있는 보존된 이펙터인 것으로 밝혀졌습니다. 우리는 MaCFEM85의 위치 52에 있는 CFEM 도메인과 시스테인 잔기가 상호 작용에 중요하다는 것을 보여주었습니다. 이러한 상호 작용은 식물에서 JA 관련 면역 반응과 질병 저항성 및 곤충 저항성 메커니즘을 활성화할 수 있습니다.

참고자료

1. NS주 파울루치; 안타, GG; 갈라라토, 루이지애나; 비카리오, JC; 세사리, AB; 레게라, YB; 킬머레이, C.; 매사추세츠주 부에노; 가르시아, MB; Dardanelli, MS 식물-미생물 파트너십: 성장과 식물 건강에 대한 영향. 식물 미생물 공생: 기초 및 발전; 스프링거: 독일 베를린/하이델베르크, 2013년; 105~117쪽. [상호참조]

2. 솅크, PM; 카르발하이스, LC; Kazan, K. 식물-미생물 상호작용 풀기: 다종 전사체학이 도움이 될 수 있습니까? 동향 생명공학. 2012, 30, 177-184. [상호참조]

3. Sasse, J.; 마르티노이아, E.; Northen, T. 친구에게 먹이주기: 식물 삼출물이 뿌리 미생물군집을 형성합니까? 동향 식물 과학. 2018, 23, 25–41. [상호참조]

4. 루겐베르그, B.; Kamilova, F. 식물 성장 촉진 뿌리박테리아. 아누. 미생물 목사. 2009, 63, 541-556. [상호참조]

5. 쇼레쉬, M.; 하만, GE; Mastouri, F. 곰팡이 생물 방제제에 대한 전신 저항성 및 식물 반응을 유도했습니다. 아누. Phytopathol 목사. 2010, 48, 21–43. [상호참조]

6. JE 반 드 모르텔(van de Mortel); 드 보스, RC; 데커스, E.; 피네다, A.; 길로드, L.; 보우미스터, KJ; 반 룬, J.; 디케, M.; Raaijmakers, JM rhizobacterium Pseudomonas florescens SS101에 의해 Arabidopsis에서 유도된 대사 및 전사체 변화. 식물물리학. 2012, 160, 2173-2188. [상호참조]

7. 라린, A.; 버튼, F.; Schafer, P. 뿌리 미생물군집 형성에 있어 식물 뿌리-미생물 통신. 식물 몰. Biol. 2016, 90, 575-587. [상호참조]

8. RK 사산; Bidochka, MJ 곤충 병원성 곰팡이인 Metarhizium Roberts(Clavicipitaceae)는 또한 식물 뿌리 발달을 자극하는 내생 식물입니다. 오전. J.봇. 2012, 99, 101-107. [상호참조]

9. RK 사산; Bidochka, MJ 콩 식물 병원체 Fusarium solanif에 대한 내생 곤충 병원성 곰팡이 Metarhizium robertsii의 길항작용. sp. Phaseoli. 할 수 있다. J. 식물 Pathol. 2013, 35, 288-293. [상호참조]

10. 아마드, I.; Jiménez-Gasco, MdM; 루테, DS; 샤킬, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii는 옥수수 성장을 촉진하고 곤충 성장을 억제하며 식물 방어 유전자 발현을 변경합니다. Biol. 컨트롤 2020, 144, 104167. [상호참조]

11. 체린, T.; Petcharat, V. Metarhizium guizhouense의 과일 썩음균에 대한 홍콩 과일(Aglaia dookkoo Griff.)의 방어 반응 유도. Biol. 제어 2017, 111, 40–44. [상호참조]

12. 하오, K.; 왕, F.; 농, X.; 맥닐, MR; 리우, S.; 왕, G.; 카오, G.; Zhang, Z. 전사체 분석을 통해 유익하고 병원성인 진균의 존재에 대한 땅콩 Arachis hypogaea 뿌리의 반응. 과학. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. 파텔, ZM; 마하파트라, R.; Jampala, SSM 11장 - 식물 방어 메커니즘에서 곰팡이 유발 물질의 역할. 농업에 있어서 식물 유익 미생물의 분자적 측면에서; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Eds.; 학술 출판물: 미국 매사추세츠주 케임브리지, 2020; 143~158쪽. [상호참조]

14. 동 X.; Sa, JA 에틸렌 및 식물의 질병 저항성. 현재 의견. 식물생물학. 1998, 1, 316–323. [상호참조] [PubMed]

15. 톰마, BP; 에거몬트, K.; 아이오와주 페닌크스; 마우크-마니, B.; 보겔상, R.; 카무에, BP; Broekaert, WF 애기장대에서 별도의 자스모네이트 의존성 및 살리실산염 의존성 방어 반응 경로는 별개의 미생물 병원체에 대한 저항성에 필수적입니다. 진행 Natl. Acad. 과학. 미국 1998, 95, 15107-15111. [상호참조] [PubMed]

16. 팬츠, SR; 이리고옌, S.; 리우, J.; 베드레, R.; 크리스텐슨, SA; 슈멜츠, EA; 세드브룩, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium 페닐알라닌 암모니아 분해효소(PAL) Panicum 모자이크 바이러스 및 그 위성에 대한 항바이러스 방어를 촉진합니다. mBio 2021, 12, e03518-20. [상호참조]

17. 리우, R.; 쉬, S.; 리, J.; 후, Y.; Lin, Z. Astragalus membranaceus var.의 PAL 유전자 발현 프로파일. Mongholicus와 플라보노이드 생합성으로의 유입에 있어서 그 중요한 역할. 식물세포대표. 2006, 25, 705-710. [상호참조]

18. De Geyter, N.; 골라미, A.; 구르막티그, S.; Goossens, A. 자스모네이트에 의해 유발된 식물 2차 대사의 전사 기계. 동향 식물 과학. 2012, 17, 349-359. [상호참조]

19. Mirjalili, N.; Linden, JC Taxus cuspidata의 현탁 배양에 대한 기체상 구성 효과. 생명공학. 바이오엔지. 1995, 48, 123-132. [상호참조]

20. 리, 세인트; 장, P.; 장, M.; 푸, CH; 자오, CF; 동영스; 구오, AY; Yu, LJ 메틸 자스모네이트에 반응하는 탁수스 키넨시스(taxus chinensis) 세포의 전사 프로파일. BMC 게놈. 2012, 13, 295. [상호참조]

21. 투기지마나, F.; 엔큐브, EN; 펜실베니아주 스틴캠프; Dubery, IA 메틸 자스모네이트에 의한 센텔라 아시아티카 세포의 테르페노이드 합성 조작에 대한 대사체학에서 파생된 통찰력. 식물생명공학. 2015, 9, 125–136. [상호참조]

22. 루, M.; 웡, H.; Teng, W. Panax 인삼의 세포 배양에서 사포닌 생산에 대한 유도 효과. 식물세포대표. 2001, 20, 674-677. [상호참조]

23. 만달, S.; 카르, 나.; 무케르지, 알래스카; Acharya, Ralstonia solanacearum에 대한 Solanum lycopersicum의 P. Elicitor 유발 방어 반응. 과학. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]

24. 리, 엘.; 왕, S.; 양, X.; 프란시스, F.; Qiu, D. 단백질 유도자 PeaT1은 밀의 진딧물(Sitobion avenae)에 대한 저항성을 강화했습니다. 해충 관리. 과학. 2020, 76, 236–243. [상호참조] [PubMed]

25. Bujalowski, W. 육량체 DnaB 헬리카제의 생리학적 역할 확장. 동향 생화학. 과학. 2003, 28, 116–118. [상호참조]

26. 바크닌, Y.; 샤드찬, Y.; Levdansky, E.; 모로조프, M.; 로마노, J.; Osherov, N. 3개의 Aspergillus fumigatus CFEM 도메인 GPI 고정 단백질(CfmA-C)은 세포벽 안정성에 영향을 주지만 곰팡이 독성에는 역할을 하지 않습니다. 곰팡이. 그 가죽. Biol. 2014, 63, 55–64. [상호참조]

27. 자오, S.; 샹, X.; 비, W.; 유, X.; 리우, D.; 강지; 왕, X.; Wang, X. 밀 잎 녹병균 Puccinia triticina의 보존된 모티프를 가진 이펙터 후보의 게놈 전체 식별. 앞쪽. 미생물. 2020, 11, 1188. [상호참조]

28. 공, A.; 징, Z.; 장, K.; 탄, Q.; 왕, G.; Liu, W. 옥수수 탄저병 곰팡이 Colletotrichum graminicola에서 CFEM 단백질의 생물정보학적 분석 및 기능적 특성 규명. J. 통합. 농업. 2020, 19, 541-550. [상호참조]

29. 마틴, F.; 에어츠, A.; 아렌, D.; 브룬, A.; 단친, EG; Duchaussoy, F.; 기본, J.; 콜러, A.; 린퀴스트, E.; 페레다, V.; 외. Laccaria bicolor의 게놈은 균근 공생에 대한 통찰력을 제공합니다. 자연 2008, 452, 88–92. [상호참조]

30. 스테판, V.; Lara, RJ 내생식물로서의 곤충병원성 진균: 식물-내생식물-초식동물 상호작용 및 생물학적 방제에 사용하기 위한 전망. 현재 과학. 2015, 109, 46–54.

31. 카이, 엔.; 리우, R.; 얀, D.; 장, N.; 주, K.; 장, D.; 농, X.; 투, X.; 장, Z.; Wang, G. Metarhizium anisopliae의 CFEM 단백질에 대한 생물정보학 분석 및 기능적 특성 규명. J. 곰팡이. 2022, 8, 661. [상호참조]

32. 스티븐스, C.; Hammond-Kosack, KE; 및 Kanyuka, K. WAKsing 식물 면역, 약화되는 질병. J. 특급. 봇 2022, 73, 22–37. [상호참조]

33. 장, ZN; 우, 퀴리; 장, GZ; 주, YY; 머피, RW; 리우, Z.; Zou, CG 체계적인 분석을 통해 곰팡이에서 CFEM 도메인의 고유성과 기원이 밝혀졌습니다. 과학. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. 팡, A.; 가오, H.; 장, N.; 정, X.; 추, S.; 리, Y.; 조우, S.; 쿠이, F.; Sun, W. 새로운 이펙터 유전자 SCRE2는 쌀에 대한 Ustilaginoidea virens의 완전한 독성에 기여합니다. 앞쪽. 미생물. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]

35. 주, W.; 웨이, W.; 우, Y.; 저우, Y.; 펭, F.; 장, S.; 첸, 피.; Xu, X. 추정 GPI 고정 부위가 있는 CFEM 도메인 함유 단백질인 BcCFEM1은 Botrytis cinerea의 병원성, 분생포자 생산 및 스트레스 내성에 관여합니다. 앞쪽. 미생물. 2017, 8, 1807. [상호참조]

36. Xu, X.; 리, G.; 리, 엘.; 수, Z.; Chen, C. Pezizomycotina에 속하는 곰팡이의 추정 Pth11- 관련 G 단백질 결합 수용체에 대한 게놈 차원의 비교 분석. BMC 마이크로바이올. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]

37. 펭, YJ; 허우, J.; 장, H.; 레이, JH; 린, HY; 딩, JL; 펭, MG; Ying, SH 철분 획득에 대한 단백질을 포함하는 CFEM 도메인의 체계적 기여는 사상성 병원성 곰팡이인 Beauveria bassiana의 종간 상호작용에 필수적입니다. 환경. 미생물. 2022, 24, 3693–3704. [상호참조] [PubMed]

38. 로이, U.; Kornitzer, D. 곰팡이에서 Heme-iron 획득. 현재 의견. 미생물. 2019, 52, 77–83. [상호참조] [PubMed]

39. 오카모토-시바야마, K.; 키쿠치, Y.; 코쿠부, E.; 사토, Y.; Rbt5 단백질 계열의 구성원인 Ishihara, K. Csa2는 Candida albicans 균사 성장 동안 인간 헤모글로빈의 철분 활용에 관여합니다. FEMS 효모 Res. 2014, 14, 674-677. [상호참조]

40. 페레즈, A.; 페드로스, B.; 머구이, A.; 카사노바, M.; 로페즈-리보트, JL; Martinez, JP Candida albicans 돌연변이에 의한 8개 시스테인 함유 CFEM 도메인을 나타내는 곰팡이 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 생물막 형성. FEMS 효모 Res. 2006, 6, 1074-1084. [상호참조]

41. Hogg, PJ 단백질 기능의 스위치로서의 이황화 결합. 동향 생화학. 과학. 2003, 28, 210-214. [상호참조]

42. HA 반 덴 버그; 웨스터링크, N.; 프랑코이스, KJ; 로스, R.; Woestenenk, E.; 보렌, S.; 드 위트, PJ; 주스텐, MH; Vervoort, J. 토마토 병원체 Cladosporium fulvum의 AVR4의 천연 이황화 결합 파괴 돌연변이는 단백질 분해에 민감하고 Cf{3}}매개 저항을 우회하지만 키틴 결합 능력을 유지합니다. J. Biol. 화학. 2003, 278, 27340-27346. [상호참조] 43. Hu, K.; 카오, J.; 장, J.; 시아, F.; 열쇠.; 장, H.; 시에, W.; 리우, H.; 추이, Y.; Cao, Y.; 외. 세포벽 강화를 통한 질병저항성 유전자에 의한 다양한 농경학적 특성의 개선. Nat. 식물 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]

44. 사이토, H.; 후지사와, S.; 미츠오카, C.; 이토, A.; 히라부치, A.; 이케다, K.; 이리에다, H.; 요시노, K.; 요시다, K.; 마츠무라, H.; 외. Magnaporthe oryzae의 대규모 유전자 파괴를 통해 단자엽 및 쌍자엽 진균 병원체에 의한 감염에 필요한 분비 단백질인 MC69가 확인되었습니다. PLoS Pathog. 2012, 8, e1002711. [상호참조] [PubMed]

45. 쿨카르니, RD; 켈카르, HS; Dean, R. 곰팡이 막 단백질 그룹에 고유한 8개 시스테인 함유 CFEM 도메인. 동향 생화학. 과학. 2013, 28, 118–121. [상호참조] [PubMed]

46. ​​펭, J.; 우, L.; 장, W.; 장, Q.; 싱, Q.; 왕, X.; 리, X.; Yan, J. Lasiodiplodia theobromae의 곰팡이 세포외 막 단백질에서 공통적으로 나타나는 체계적 식별 및 기능적 특성 규명. 앞쪽. 식물 과학. 2021, 12, 804696. [상호참조]

47. 바리, R.; Jones, JD 식물 방어 반응에서 식물 호르몬의 역할. 식물 몰. Biol. 2009, 69, 473-488. [상호참조]

48. 베르마, V.; 라빈드란, P.; Kumar, PP 식물 호르몬에 의한 스트레스 반응 조절. BMC플랜트바이올. 2016년 16월, 86. [상호참조]

49. Javed, K.; Qiu, D. Brevibacillus laterosporus의 단백질 유발자 PeBL1은 토마토의 Myzus persicae에 대한 저항성을 향상시킵니다. 병원체 2020, 9, 57. [CrossRef]

50. 바싯, A.; 하난, A.; 나지르, T.; 마지드, MZ; Qiu, D. 일반 콩(Phaseolus vulgaris L.)에서 녹색 복숭아 진딧물(Myzus persicae)에 대한 저항성 유도에 관여하는 Botrytis cinerea에서 추출한 elicitor PeBC1의 분자 및 기능적 특성 분석. 곤충 2019, 10, 35. [교차참조]

51. 나지르, T.; 하난, A.; 바싯, A.; 마지드, MZ; 안와르, T.; 나와즈, I.; Qiu, D. 브라시카 라파 ssp의 Myzus persicae(매미목: 진딧물과)에 대한 Beauveria bassiana ARSEF 2860 균주에서 유래된 아직 특성화되지 않은 단백질 제거제 PeBb1의 추정 역할. 페키넨시스. 병원체 2020, 9, 111. [CrossRef]

52. 스포엘, SH; 쿠른니프, A.; 클라에센스, 에스엠; 코르셀리우스, JP; 반 펠트, JA; 뮬러, MJ; 부찰라, AJ; 일본 메트라우스; 브라운, R.; 카잔, K.; 외. NPR1은 세포질의 새로운 기능을 통해 살리실산염 의존성 방어 경로와 자스모네이트 의존성 방어 경로 사이의 누화를 조절합니다. 식물 세포 2003, 15, 760-770. [상호참조]

53. 신, XF; 그는, SY Pseudomonas syringae pv. 토마토 DC3000: 식물의 질병 감수성과 호르몬 신호를 조사하기 위한 모델 병원체. 아누. Phytopathol 목사. 2013, 51, 473-498. [상호참조] [PubMed]

54. 장, X.; 왕, C.; 장 Y.; 선, Y.; Mou, Z. 애기장대 매개체 복합체 서브유닛16은 살리실산염 매개 전신 획득 저항성 및 자스모네이트/에틸렌 유발 방어 경로를 적극적으로 조절합니다. 식물 세포 2012, 24, 4294-4309. [상호참조] [PubMed]

55. 도레스, SH; 나르바에즈-바스케즈, J.; 콘코니, A.; Ryan, CA 살리실산은 시스템민과 자스몬산에 의해 유도된 토마토 잎의 단백질분해효소 억제제 합성을 억제합니다. 식물물리학. 1995, 108, 1741-1746. [상호참조] [PubMed]

56. 피에테르세, CM; 레온-레이스, A.; 반 데르 엔트, S.; Van Wees, SC 식물 면역의 소분자 호르몬에 의한 네트워킹. Nat. 화학. Biol. 2009, 5, 308-316. [상호참조]

57. 아이오와주 페닌크스; 톰마, BP; 부찰라, A.; 메트로, 일본; Broekaert, WF Arabidopsis에서 식물 디펜신 유전자의 유도에는 자스모네이트 및 에틸렌 반응 경로의 동시 활성화가 필요합니다. 식물 세포 1998, 10, 2103-2113. [상호참조]

58. 팡, W.; Bidochka, MJ 정량적 실시간 RT-PCR을 사용하여 Metarhizium anisopliae의 발아, 분생포자 형성 및 발병에 관련된 유전자의 발현. 마이콜. 결의안. 2006, 110, 1165-1171. [상호참조]

59. 게리에로, G.; 레게이, S.; Hausman, JF Alfalfa Cellulose synthase 유전자 발현 비생물적 스트레스: RT-qPCR 정규화에 대한 히치하이커 가이드. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [상호참조]

60. 양Y.; 장 Y.; 리, 비.; 양, X.; 동영; Qiu, D. A Verticillium dahliae pectate lyase는 식물 면역 반응을 유도하고 병독성에 기여합니다. 앞쪽. 식물 과학. 2018, 9, 1271. [상호참조]

61. 리박, KJ; Schmittgen, TD 실시간 정량 PCR 및 2(-Delta Delta C(T)) 방법을 사용한 상대 유전자 발현 데이터 분석. 방법 2001, 25, 402-408. [상호참조]