경구 저산소증 유발 인자 Prolyl Hydroxylase Inhibitor Enarodustat는 당뇨병성 신장 질환의 초기 단계에서 신장 에너지 대사의 변화에 ​​대응합니다

연락처: emily.li@wecistanche.com

소개

일본 도쿄 의과대학 의과대학 신장내분비학부; 젊은 과학자를 위한 연구 펠로우쉽, 일본 과학 진흥 학회, 도쿄, 일본; 생물학 및 약리학 연구실,

일본 다카츠키 소재 일본 담배 주식회사 중앙제약연구소; 일본 도쿄 의과대학 대학원 시스템 약리학과; 합성 생물학 연구소, RIKEN 생물 시스템 역학 연구 센터, 일본 스이타; 및 WPI 국제 신경 지능 연구 센터, 도쿄 대학 고급 연구 연구소(UTIAS), 도쿄 대학, 일본 도쿄.

HIF 안정제로 알려진 저산소증 유발 인자(HIF) 프롤릴 하이드록실라제 억제제는 내인성 에리트로포이에틴 생산을 증가시키고 빈혈에 대한 새로운 치료제 역할을 합니다.만성병 환자신장질병. HIF는 저산소증에 대한 적응 반응으로 에너지 대사와 관련된 다양한 유전자의 발현을 유도합니다. 그러나 HIF 안정화에 의해 내부 조직을 재프로그래밍하는 대사가 어떻게 병태생리에 영향을 미치는지는 불분명합니다.신장 질병. 이전 연구에 따르면 고혈당 및 이상지질혈증과 같은 전신 대사 장애는 신장 대사의 변화를 일으켜 당뇨병성 신장 질환을 비롯한 신장 기능 장애를 유발합니다. 여기서는 경구용 HIF 안정제인 에나로두스타트(enarodustat, JTZ-951)가 스트렙토조토신으로 유도된 당뇨병 쥐와 알록산으로 유도된 당뇨병 쥐를 사용하여 당뇨병성 신장 질환의 초기 단계에서 신장 에너지 대사에 미치는 영향을 분석합니다. Transcriptome 분석은 enarodustat이 당뇨병성 신장 대사의 변화를 방해한다는 것을 보여주었습니다. Transcriptome 분석은 당뇨병성 신장 조직에서 지방산과 아미노산 대사가 상향 조절되고 에나로두스타트에 의해 하향 조절되는 반면 포도당 대사는 상향 조절되는 것으로 나타났습니다. 이러한 대칭적 변화는 대사체 분석에 의해 확인되었습니다. 당뇨병 동물의 신장 조직에서는 해당과정과 트리카르복실산 순환 대사산물이 축적되고 아미노산이 감소하는 반면, 이러한 대사 장애는 에나로두스타트에 의해 완화되었습니다. 또한, 에나로두스타틴은 글루타티온 대 글루타티온 이황화 비율을 증가시키고 당뇨병 동물의 신장 조직에서 산화 스트레스를 완화합니다. 따라서 HIF 안정화는 초기 단계에서 발생하는 신 에너지 대사의 변경을 중화합니다.당뇨병 환자신장질병.

신장 기능에 아주 좋은 씨스탄체

번역문

저산소증 유발 인자(HIF) 프롤릴 하이드록실라제 억제제(HIF 안정제로 알려짐)는 내인성 에리트로포이에틴 생산을 증가시키고 빈혈에 대한 새로운 치료제 역할을 합니다.만성병 환자신장질병. 쥐 및 생쥐 당뇨병 모델에서 신장 조직의 전사체 및 대사체 분석 결과 경구 HIF 안정제인 enarodustat(JTZ{0}})가 당뇨병성 신장 질환의 초기 단계에서 신장 에너지 대사 변화를 방해하는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 HIF 안정제에 의한 이러한 신장 대사 재프로그래밍이 어떻게 진행에 영향을 미치는지 명확히 하기 위해 추가 연구가 필요하지만 임상 환경에서 신장 에너지 대사에 대한 HIF 안정제의 효과를 외삽하기 위한 중요한 데이터를 제공합니다.당뇨병 환자신장질병.

도입

저산소증 유발 인자(HIF) 프롤릴 하이드록실라제 억제제는 내인성 에리트로포이에틴 생성을 증가시키고 만성 질환에서 빈혈에 대한 새로운 치료제 역할을 합니다.신장질병. 세포에는 저산소증에 대한 방어 기제가 부여되며 HIF는 이 방어의 마스터 레귤레이터입니다. 신장은 생리학적으로 저산소증에 노출되며 만성 저산소증은 말기 신장 질환으로 이어지는 최종 공통 경로로 인식됩니다. HIF가 저산소 반응과 관련된 다양한 유전자의 발현을 유도한다는 점을 고려할 때, HIF 안정제는 다발성 경화증의 진행에 영향을 미칠 수 있습니다.신장질병뿐만 아니라 만성 빈혈 개선신장질병. 흥미롭게도 HIF는 해당 유전자와 피루브산 탈수소효소 키나제의 발현을 유도하여 피루브산 탈수소효소가 피루브산을 사용하여 미토콘드리아 트리카르복실산(TCA) 주기에 연료를 공급하는 것을 억제합니다. 저산소 환경에 노출된 세포의 적응을 위해. 그러나, HIF 안정화에 의한 신조직의 대사 재프로그래밍이 신장 조직의 병태생리에 어떻게 영향을 미치는지는 여전히 불분명합니다.신장 질병. 당뇨병성 신장 질환(DKD)은 말기 신장 질환의 주요 원인입니다. 고혈당 및 이상지질혈증과 같은 전신 대사 장애는 신장 대사 변화를 유발하여 DKD를 비롯한 신기능 장애를 유발합니다. 이전 연구에서는 미토콘드리아 기능 장애 및 DKD 진행과 관련이 있을 수 있는 당뇨병성 신장 피질 조직에서 대사 플럭스 및 포도당 및 TCA 주기 대사 산물의 축적이 증가하는 것으로 나타났습니다. 우리는 HIF가 저산소증에 대한 적응 반응으로서 산소 소비를 억제하기 위해 세포의 대사 플럭스를 감소시킨다는 점을 고려하여 HIF 안정제가 당뇨병성 신장 피질 조직의 대사 변화를 역전시킬 수 있다고 가정했습니다. 따라서 전사체 및 대사체 분석을 활용하여 경구 HIF 안정제인 enarodustat(JTZ-951)가 DKD의 초기 단계에서 발생하는 신장 대사 변화에 미치는 영향을 포괄적으로 이해하기 위해 개념 증명 연구를 수행했습니다.

결과: Enarodustat는 TCA 주기에서 신장 근위 세뇨관 세포의 해당 과정으로의 대사 재프로그래밍을 유도합니다.

신피질은 주로 근위세뇨관으로 구성되어 있기 때문에 우리는 먼저 시험관 내에서 신근위세뇨관 세포의 대사 플럭스에 대한 enarodustat의 효과를 조사했습니다. 먼저 Mito Stress Test(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) 및 Glycolytic Rate Assay(Agilent)는 인간 근위 세뇨관 상피 세포주인 배양된 HK{0}} 세포에서 수행되었습니다(그림 1a). Enarodustat는 미토콘드리아 호흡(TCA 주기)을 크게 감소시키고 기초 해당 작용을 증가시켜 TCA 주기에서 해당 작용으로의 대사 재프로그래밍을 나타냅니다(그림 1, 보충 그림 S1). 또한 HIF-1에 대해 small interfering RNA(siRNA)를 사용하여 실험을 수행했습니다(그림 2, 보충 그림 S2). siRNA에 의한 HIF-1 녹다운은 enarodustat에 의해 유도된 대사 변경(기저 호흡, 최대 호흡, 예비 호흡 능력 및 아데노신 삼인산[ATP] 생산)을 역전시켰으며, 이는 대사 재프로그래밍이 주로 HIF를 통한 것임을 보여주었습니다-1 안정화(그림 2, 보충 그림 S2). 세포가 TCA 주기에 연료를 공급하기 위해 피루브산을 사용하는 중요한 요소인 피루브산 탈수소효소 활성도 이전에 발표된 관찰과 호환되는 enarodustat에 의해 감소되었습니다(그림 2f).

스트렙토조토신 유도 당뇨병 쥐의 배경 자료

시험관 내 실험의 결과에서 우리는 HIF 안정제가 TCA 주기에서 해당과정으로의 대사 재프로그래밍을 통해 당뇨병성 신피질 조직의 대사 변화를 완화할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 우리는 먼저 위에서 언급한 가설을 테스트하기 위해 개념 증명 실험의 모델로 스트렙토조토신(STZ) 유도 당뇨병 쥐를 선택했습니다. 이 모델에서는 당뇨병이 빠르게 유도되어 단시간 내에 신장 조직의 에너지 대사에 대한 당뇨병 및 HIF 안정제의 순 효과를 관찰할 수 있습니다. STZ 유발 당뇨병 쥐 실험에서 연구 프로토콜 및 기본 데이터는 그림 3a에 나와 있습니다. 우리는 쥐를 그룹 A(sham), 그룹 B(DKD), 그룹 C(DKD þ enarodustat)의 3개 그룹으로 나누었습니다. 14일째의 혈장 포도당, 당화 헤모글로빈 HbA1c, 트리글리세라이드 및 총 콜레스테롤 수치는 그룹 A와 비교하여 당뇨병 그룹에서 유의하게 증가했지만 그룹 B와 C 사이에는 유의한 차이가 없었습니다(그림 3d-g). 혈장 크레아티닌 수치는 군간에 차이가 없었지만, A군에 비해 B군에서 요중 알부민 배설이 유의하게 증가하고 사구체 비대가 나타났으며, enarodustat는 이러한 변화를 역전시키는 경향이 있었다(Figure 4). 혈액 요소 질소 수준은 당뇨병으로 인한 탈수를 반영하는 당뇨병 그룹에서 더 높았다. 요약하면, 우리 연구에서 STZ 처리된 쥐의 신장은 DKD의 초기 단계를 나타냅니다. 이 쥐의 신장 피질 조직을 사용하여 전사체 및 대사체 분석을 수행했습니다.

신장 피질 조직의 전사체 분석

신장 피질 조직의 전사체 분석 결과는 그림 5와 6에 나와 있습니다. 주성분 분석 및 계층적 클러스터링 분석은 그룹 A, B 및 C가 각각 다른 클러스터로 분리되었음을 나타냅니다(그림 5a 및 b). 차별적으로 발현된 유전자는 │log2 fold-change(FC) │ 0.5 이상 및 Q 값 < 0.05에="" 의해="" 선택되었습니다.="" 유전자="" 온톨로지="" 및="" 표준="" 경로="" 분석은="" 지방산="" 대사와="" 관련된="" 유전자가="" 그룹="" a에="" 비해="" 그룹="" b에서="" 상향="" 조절된="" 것으로="" 나타났습니다.="" 대조적으로="" 그룹="" c에서="" hif-1="" 네트워크를="" 포함한="" 포도당="" 대사="" 및="" 저산소="" 반응과="" 관련된="" 유전자가="" 상향="" 조절됨="" 그룹="" b와="" 함께(그림="" 5c="" 및="" d).="" 또한="" 전사체="" 데이터를="" 사용하여="" 유전자="" 세트="" 농축="" 분석(gsea)을="" 수행했습니다(그림="" 6,="" 표="" 1="" 및="" 2).="" 지방산="" 및="" 아미노산="" 대사의="" 유전자="" 세트는="" 그룹="" a와="" 비교하여="" 그룹="" b에서="" 상향="" 조절되었습니다(그림="" 6).="" 대조적으로,="" 이들="" 유전자="" 세트는="" 하향조절되었고,="" 포도당="" 대사의="" 유전자="" 세트는="" 그룹="" b와="" 비교하여="" 그룹="" c에서="" 상향조절되어,="" 에나로두스타트가="" 당뇨병에="" 의해="" 유도된="" 대사="" 변경을="" 역전시켰음을="" 보여주었다(그림="" 6).="" 더욱이,="" tca="" 주기의="" 유전자="" 세트는="" 그룹="" b와="" 비교하여="" 그룹="" c에서="" 하향조절되었으며(표="" 2),="" 이는="" 우리의="" 시험관내="" 연구에서="" 관찰된="" 근위="" 세뇨관에서="" 에나로두스타트="" 유도="" 대사="" 재프로그래밍의="" 개념과="" 호환됩니다.="" 요약하면,="" 에나로두스타트는="" 전사체="" 관점에서="" 당뇨병성="" 신장="" 대사="" 변화에="">

신피질 조직의 대사체 분석

우리는 각 그룹에서 무작위로 선택한 쥐의 신장 피질 조직에서 116개의 에너지 관련 대사 산물의 절대 농도(각 그룹에 대해 n =4)를 측정했습니다(보충 표 S1, 보충 그림 S3). 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA)을 수행하여 클래스 판별의 중요성을 평가했습니다(그림 7). 우리는 투영(VIP) 점수에서 PLS-DA 가변 중요도가 $1인 대사산물을 사용하여 대사산물 집합 농축 분석(MSEA)을 수행했습니다. 글리신, 세린, 메티오닌, 아스파르테이트, 글루타메이트, 아르기닌, 프롤린, 그룹 A와 B 사이의 b-알라닌이 주목되었습니다. 아미노산 대사의 차이도 그룹 B와 C 사이에서 관찰되었습니다. 또한 해당 분해 및 포도당 신생합성과 같은 포도당 대사 과정은 그룹 B와 C 사이에서 다른 경향을 보였습니다(그림 7).

에너지 대사 경로 맵에서 전사체 및 대사체 데이터 시각화

에너지 대사 변경에 대한 포괄적인 이해를 위해 전사체 및 대사체 데이터를 시각화했습니다(그림 8). 해당과정과 TCA 순환 대사산물은 A군에 비해 B군에서 축적되는 것으로 나타났는데, 이는 DKD에서 과도한 포도당 유입과 지방산 대사의 상향 조절 때문일 수 있다. 아미노산 농도는 그룹 A와 비교하여 그룹 B에서 감소했으며, 이는 아미노산 대사의 상향 조절을 반영합니다(그림 8a). 대조적으로, 해당과정 대사산물의 축적은 해당과정의 촉진된 흐름으로 인해 enarodustat에 의해 완화되었습니다. Enarodustat는 또한 TCA 주기 대사 산물과 아미노산의 당뇨병 유발 변화를 역전시켰습니다(그림 8b). 또한, 에나로두스타트는 당뇨병성 신장 조직에서 이황화글루타티온(GSSG)의 축적을 완화하여 더 높은 글루타티온/GSSG 비율을 보여 에나로두스타트가 DKD에서 산화 스트레스를 완화함을 시사했습니다(그림 8a 및 b). 산화 스트레스의 감소는 신장 피질 조직에서 지질 과산화 마커 malondialdehyde의 수준에 의해 확인되었습니다. enarodustat는 당뇨병 신장 피질 조직에서 malondialdehyde 축적을 역전시켰습니다(보충 그림 S4). 요약하면, 전사체와 대사체 데이터의 통합은 에나로두스타트가 DKD의 초기 단계에서 발생하는 신장 에너지 대사 변경을 방해한다는 것을 입증했습니다.

대칭적 대사 변화(당뇨병 대 에나로두스타트)가 대체 모델에서 확인됨

우리는 쥐 모델에서 우리의 발견을 확인하기 위해 또 다른 당뇨병 동물 모델인 알록산 유도 당뇨병 마우스에서 전사체 분석을 수행했습니다. 마우스 모델에 대한 연구 프로토콜 및 배경 데이터는 그림 9에 나와 있습니다. 소변 알부민 배설은 enarodustat에 의해 역전된 그룹 A와 비교하여 그룹 B에서 유의하게 증가했습니다(그림 9d). 또한 포괄적인 3-차원 분석(Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails, and Computational analysis[CUBIC]–신장)16을 적용하여 신장의 사구체를 시각화했습니다. 사구체 비대증은 그룹 A와 비교하여 그룹 B에서 눈에 띄었으며, 이는 enarodustat에 의해 역전되었습니다(그림 9e). 알록산 유도 당뇨병 쥐에서 신장 조직의 전사체 분석은 STZ 유도 당뇨병 쥐 모델에서와 동일한 방식으로 대칭적인 대사 변화(당뇨병 대 에나로두스타트)를 보여주었습니다(그림 10): 지방산 대사는 당뇨병에 의해 상향 조절된 반면, 포도당 신진 대사는 enarodustat에 의해 상향 조절되었습니다. 또한, 아미노산 대사는 당뇨병에 의해 상향 조절되고 에나로두스타트에 의해 하향 조절되었습니다. 따라서 에나로두스타트는 알록산 유도 당뇨병 마우스 모델과 STZ 유도 당뇨병 쥐 모델에서 DKD의 초기 단계에서 발생하는 신장 에너지 대사 변화를 중화시켰다.

논의

이 연구에서 우리는 경구 HIF 안정제인 enarodustat(JTZ{0}})가 당뇨병의 쥐 및 마우스 모델에서 DKD의 초기 단계에서 발생하는 신장 에너지 대사 변경을 중화함을 입증했습니다. 전사체 및 대사체 분석은 신장 조직에서 대칭적인 대사 변화를 보여주었습니다(당뇨병 대 에나로두스타트): 지방산 및 아미노산 대사는 DKD에서 상향 조절된 반면, 에나로두스타트는 이러한 경로를 하향 조절하고 추가로 포도당 대사를 상향 조절했습니다(그림 5-10).

HIF 안정화가 DKD의 병태생리에 보호 효과가 있는지 여부는 완전히 설명되지 않았습니다. 이전 연구에 따르면 당뇨병 신장 조직은 저산소증에 노출되고17 당뇨병 신장 조직에서 HIF 발현은 저산소 상태에 반응하는 데 불충분하며, 이는 부분적으로 산화 스트레스에 의해 유발됩니다.18 염화 코발트에 의한 HIF 안정화는 산화 스트레스 상태를 개선하고 단백뇨를 감소시키고 단백뇨를 감소시킵니다. STZ 유발 DKD에서 세뇨관 간질 손상.19 동물 연구 결과에서도 HIF 안정화가 비만 발병을 방지하고,20 인슐린 감수성을 개선하고,20 혈청 콜레스테롤 수치를 낮추는 것으로 나타났습니다.21 이러한 결과는 HIF 안정화의 보호 효과를 시사합니다. DKD. 대조적으로, von Hippel-Lindau 결실에 의한 초생리학적 HIF 안정화는 신장 섬유증을 유도하는 것으로 보고되었습니다.22 DKD 진행에서 HIF 안정화의 역할은 HIF의 다면발현 효과와 다양한 DKD 표현형의 존재를 고려할 때 상황에 따라 달라질 수 있습니다. 이 연구의 목적은 당뇨병성 신장에서 에너지 대사에 대한 HIF 안정화의 순 효과를 명확히 하는 것이었습니다. 이전 보고서에 따르면 DKD에서 에너지 대사 변화가 발생합니다. Sas et al.10은 미토콘드리아 기능 장애와 관련이 있을 수 있는 당뇨병성 신피질 조직에서 에너지 대사 플럭스의 증가와 포도당 대사 산물의 축적을 보여주었습니다. You et al.23은 TCA 순환 대사산물인 fumarate가 당뇨병성 신장 조직에 축적되어 DKD의 진행에 직접적으로 기여한다고 보고했습니다. 우리는 이전에 TCA 주기 대사산물이 당뇨병성 신장 조직에 축적되었으며, 이는 나트륨-포도당 공동수송체 2 억제 또는 칼로리 제한에 의해 역전됨을 보여주었습니다. 또한 Qi et al.24은 pyruvate kinase M2(PKM2)를 포함한 해당 경로의 효소가, DKD가 있는 환자와 비교하여 DKD가 없는 제1형 당뇨병 환자에서 상향 조절되었습니다. PKM2 활성화는 부분적으로 해당 작용 흐름을 증가시켜 해당 작용 대사 산물의 축적을 역전시키고 미토콘드리아 기능을 회복했습니다.24,25 이러한 이전 보고서는 해당 작용 및 TCA 순환 대사 산물의 축적이 DKD의 진행에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 PKM2를 포함한 촉진된 해당 작용에 의해 완화될 수 있음을 시사합니다. 활성화. 우리 연구에서, 에나로두스타트에 의한 HIF 안정화는 에너지 대사 변경을 역전시키고 당뇨병성 신장 피질 조직에서 해당과정 및 TCA 주기 대사산물의 축적을 완화했습니다(그림 8). PKM2를 포함한 해당 효소의 발현도 enarodustat에 의해 상향 조절되었습니다(보충 그림 S4B). 또한, 에나로두스타트는 GSSG 축적을 완화하고 글루타티온/GSSG 비율을 증가시켰는데, 이는 에나로두스타트가 DKD의 산화 스트레스를 완화했음을 시사합니다(그림 8). 산화 스트레스의 이러한 enarodustat 유도 감소는 또한 신장 피질 조직의 malondialdehyde 수준의 변화에 ​​의해 확인되었습니다(보충 그림 S4A). 이러한 결과는 HIF 안정화가 적어도 대사적 관점에서 DKD의 병태생리학에 보호 역할을 해야 함을 시사합니다. HIF 안정화에 의한 대사 재프로그래밍이 DKD 진행에 직접적인 영향을 미치는지 여부를 조사할 수 없다는 것은 확실합니다. HIF의 다면발현성 역할로 인해 신진대사 변화가 신장 결과에 미치는 순 효과를 식별하는 것이 불가능할 수 있기 때문입니다. 그러나 본 연구에서는 신장 에너지 대사의 정상화와 관련하여 당뇨병에 의해 유발된 경미한 요 알부민 배설 및 신장 병리학적 이상(사구체 비대 및 사구체 기저막 비후)이 에나로두스타트에 의해 완화되었다. 우리는 alloxan 유발 당뇨병 마우스 모델의 마이크로 어레이 데이터에서 발현 변화가 소변 알부민 수준 (257 프로브, 232 유전자)과 상관 관계가있는 유전자를 추출하고 경로 농축 분석을 수행했습니다 (보충 그림 S5). 그 결과, 미토콘드리아 막 및 호흡 전자 수송과 관련된 경로가 소변 알부민 수준과 관련하여 상향 조절되어 미토콘드리아 부담이 소변 알부민 배설과 밀접한 관련이 있음을 나타냅니다. 따라서, HIF 안정제에 의한 당뇨병 신장 조직의 대사 정상화가 미토콘드리아 부담을 감소시키고 DKD의 진행을 완화할 가능성이 있다. 우리의 데이터는 다음과 같이 대사적 관점에서 DKD의 병태생리학을 제안합니다. 고혈당은 신장 근위 세뇨관에서 포도당 재흡수를 위한 에너지 요구를 생성합니다. 따라서 미토콘드리아의 TCA 회로는 DKD의 초기 단계(지방산 및 아미노산 대사의 상향 조절)의 에너지 수요를 충족시키기 위해 강제로 활성화됩니다. 그리고 HIF 안정제는 DKD 진행에 대한 보호 역할을 할 수 있는 TCA 회로에서 해당 과정(지방산 및 아미노산 대사의 하향 조절 및 해당 작용의 상향 조절)으로의 대사 재프로그래밍에 의해 이러한 미토콘드리아 부담을 완화할 수 있습니다. 신장 조직의 미토콘드리아 부담이 DKD의 병태생리에 직접적으로 영향을 미치는 방법을 명확히 하기 위해서는 단일 세포 omics를 포함한 추가 연구가 필요합니다. 또 다른 흥미로운 질문은 HIF 안정제가 근위 세뇨관에서 포도당 흡수에 직접적인 영향을 미치는지 여부입니다. 우리의 시험관 데이터는 ATP 생산이 TCA 주기에서 해당과정으로의 대사 재프로그래밍을 통해 에나로두스타트에 의해 상당히 감소된다는 것을 보여주었습니다(그림 1 및 2). ATP가 나트륨-포도당 공동수송체 2에 의한 포도당 재흡수에 필요함을 고려하여, 우리는 먼저 포도당 재흡수가 에나로두스타트에 의해 비활성화될 수 있다는 가설을 세웠다. 그러나 소변 포도당 수준은 두 동물 모델에서 그룹 B와 그룹 C 사이에서 유의하게 다르지 않았습니다(보충 그림 S6). 아마도, 에나로두스타트에 의한 ATP 생성 감소는 시험관 내 효과에 비해 생리학적 상황에서 훨씬 더 가볍습니다. 따라서 HIF 안정화는 적어도 우리의 동물 실험에서 나트륨-포도당 공동수송체 2를 통한 포도당 흡수에 영향을 미치지 않습니다. 우리 연구에는 2가지 한계가 있었습니다. 첫째, 우리는 STZ 유도 당뇨병 쥐와 알록산 유도 당뇨병 마우스를 초기 DKD 모델로 활용하고 당뇨병 상태의 단기 효과를 관찰했습니다. 그러나 임상 환경에서 HIF 안정제는 말기 DKD의 빈혈 환자에게 투여됩니다. HIF 안정화가 말기 DKD에서 신장 대사 변화에 미치는 영향을 이해하려면 더 많은 연구가 필요합니다. 둘째, 이 연구는 대사체 데이터에서 대사체 농도의 분산과 관련하여 충분한 통계적 검정력이 부족한 반면, 전사체 데이터는 에너지 대사의 전체 그림을 명확하게 할 만큼 충분히 큰 통계적 검정력을 가졌다. 많은 대사 산물이 그룹 간에 유의한 차이를 나타내지 않았기 때문에 PLS-DA를 수행하고 MSEA에 대해 PLS-DA VIP 점수가 1 이상인 대사 산물을 선택했습니다. 대사체 데이터만 사용하여 대사 변화를 교차 검증하기는 어렵지만, 대사체 분석 결과는 전사체 데이터와 호환되어(그림 7 및 8), 신장 에너지 대사에 대한 전사체 변경의 관찰된 효과에 대한 추가 지원을 제공합니다. 결론적으로 경구용 HIF 안정제인 enarodustat(JTZ{57}})는 DKD의 초기 단계에서 신장 에너지 대사 변화를 방해합니다. 우리의 연구는 HIF 안정화가 DKD에서 조절되지 않은 신장 에너지 대사를 표적으로 하는 잠재적인 개입으로 작용할 수 있음을 시사합니다.

행동 양식

미토 스트레스 테스트 및 해당 속도 분석

HK{0}} 세포를 {{1}웰 마이크로플레이트에 1 * 10의 밀도로 시딩했습니다.⁴세포/웰. 다음날, Mito Stress Test Kit(103015-100; Agilent) 또는 Glycolytic Rate Assay Kit(103344- 100; Agilent)를 사용하여 Seahorse XFe96 Analyzer(Agilent)로 대사 플럭스를 실시간으로 측정했습니다. 배양 배지에서 글루코스, 피루브산 및 글루타민의 농도는 각각 10mmol/l, 1mmol/l 및 2mmol/l이었다.

siRNA 형질감염

HIF{0}} 녹다운은 인간 HIF1A(HSS104774[#1] 및 HSS104775[#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에 대해 Stealth RNAi에 의해 수행되었습니다. Stealth RNAi siRNA Negative Control Med GC Duplex #2(12935112; Thermo Fisher Scientific)를 음성 대조군으로 사용했습니다.

웨스턴 블로팅

염색에 사용된 1차 항체는 항-인간 HIF{1}} 항체(토끼 폴리클로날, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) 및 항-인간 액틴 항체(토끼 폴리클로날, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. 미주리주 루이스). 2차 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항토끼 IgG 항체({10}}, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)였습니다.

동물 실험

Crl: CD(Sprague Dawley) 쥐 및 Crl: CD1(암 연구 연구소) 마우스는 Charles River Laboratories Japan Inc.(Yokohama, Japan)에서 입수했습니다. 모든 실험은 University of Tokyo Institutional Review Board(승인 번호 P{1}})의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 국립 보건원 지침(실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침)에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 그림 3과 9에 나와 있습니다.

전사체 분석

GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit(RTN7{{1{12}}}}, Sigma-Aldrich)를 사용하여 신장 피질 조직에서 총 RNA를 분리했습니다. 총 RNA(100ng)는 Low Input Quick Amp Labeling Kit(Agilent)를 사용하여 표지된 다음 SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray(쥐용, Agilent) 및 SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}각각 x60K 마이크로어레이(마우스용). 모든 마이크로어레이 실험은 DNA Chip Research Inc.(Tokyo, Japan)에서 수행했습니다. 원시 데이터는 Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)에서 R 패키지 limma로 처리되어 분위수 정규화 방법을 사용하여 배경 보정 및 데이터 정규화를 수행했습니다. 쥐 실험에서 ComBat(Bioconductor)에 의해 배치 효과가 제거되었습니다. 차별적으로 발현된 유전자는 │log2 FC│ 0.5 이상 및 Q 값 < 0.05에="" 의해="" 결정되었습니다.="" basespace="" correlation="" engine(illumina,="" san="" diego,="" ca)을="" 사용하여="" 유전자="" 온톨로지="" 및="" 표준="" 경로="" 분석을="" 수행했습니다.="" 마이크로어레이="" 데이터는="" gse131221(쥐)="" 및="" gse139317(마우스)="" 시리즈로="" national="" center="" for="" biotechnology="" information="" gene="" expression="" omnibus에="">

유전자 세트 농축 분석

GSEA는 선험적으로 정의된 유전자 세트가 2개의 생물학적 상태 간에 통계적으로 유의하고 일치하는 차이를 보이는지 여부를 결정하는 계산 방법입니다. GSEA는 GSEA v.3.0(Broad Institute, Cambridge, MA)을 사용하여 수행되었습니다. 잘못된 발견 비율이 < 0.25인="" 경로는="" 중요한="" 것으로="">

대사체 분석

대사체 측정은 Human Metabolome Technologies Inc.(Tsuruoka, Japan)에서 수행했습니다. 대사산물 농도는 내부 표준물질의 면적에 대한 각 대사산물의 피크 면적을 정규화하고 3-점 보정에서 얻은 표준 곡선을 사용하여 계산했습니다. 보충 방법도 참조하십시오.

대사체 세트 농축 분석

대사체학 데이터의 분석은 통합 웹 기반 플랫폼인 MetaboAnalyst 4를 사용하여 수행되었습니다.0. PLS-DA를 수행하고 관련 VIP 점수를 계산했습니다. PLS-DA VIP 점수가 1 이상인 대사산물을 MSEA에 사용했습니다.

신장 병리에서 사구체 영역의 정량화

우리는 각 샘플의 과요오드산-Schiff 염색 이미지에서 무작위로 3개의 병리학적 사진을 찍고 Fiji(ImageJ의 분포; National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 모든 사구체 영역을 각각 측정했습니다.

CUBIC-신장

이전 논문에 따라 CUBIC을 사용하여 신장 조직에서 사구체의 포괄적인 3-차원 영상을 수행했습니다. 간단히 말해서, 고정된 마우스 신장을 지질 제거를 위해 CUBIC-L에 담그고 면역형광 염색을 실시했습니다. 마지막으로 CUBIC-R plus에 샘플을 배치하여 굴절률을 일치시켰습니다. 투명 신장의 포괄적인 3D-차원 이미지는 맞춤형 라이트 시트 형광 현미경(MVX10-LS; Olympus, Tokyo, Japan)으로 획득했습니다. 염색에 사용된 1차 항체는 항포도신 항체(rabbit polyclonal, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich)였다. 2차 항체는 Alexa Flour 555- 접합된 당나귀 항-토끼 IgG(1:100, A{16}}; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)였습니다.

통계 분석

다중 비교의 경우 {{0}}분산 분석에 이어 해당하는 경우 사후 Tukey 다중 비교 테스트가 적용되었습니다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 7 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA)로 수행되었습니다. P < 0.05는="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="" 간주되었습니다.="" 데이터는="" 평균±sd로="">

폭로

MN은 KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc.(JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim으로부터 명예, 자문료 또는 연구 자금을 받았습니다. , 그리고 알렉시온. TT는 JT로부터 연구비를 받았습니다. Enarodustat(JTZ-951)은(는) JT, Tokyo, Japan에서 제공했습니다. EAS와 HRU는 RIKEN이 소유한 특허의 공동 발명자입니다. 이 연구의 일부는 Olympus Corporation 및 Bitplane에서 지원하는 종류의 소프트웨어와 협력하여 수행되었습니다. 다른 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.

감사의 말

귀중한 토론을 해주신 Dr. Shuhei Yao와 Shinji Tanaka에게 감사드립니다. 또한 기술 지원에 대해 Dr. Tsuyoshi Inoue, Dr. Satoru Fukuda, Ms. Kahoru Amitani에게도 감사드립니다. 이 작업은 부분적으로 도쿄 대학 동위 원소 과학 센터의 지원하에 수행되었습니다. 이 작품은 일본 과학 진흥 학회(JSPS) 연구 펠로우(JSPS KAKENHI 보조금 19J11928 SH)에 대한 보조금 지원, 과학 연구(B)를 위한 보조금 지원(미네소타에 JSPS KAKENHI 보조금 18H02824) ), 과학 연구를 위한 보조금(C)(JSPS KAKENHI 보조금 17K09688, TT), 혁신 분야에 대한 과학 연구 보조금(MN에 대한 KAKENHI 보조금 26111003).