논의

고령화 인구는 전 세계적으로 전례 없는 속도로 계속 증가하고 있습니다. 노화는 세포 기능 저하, 손상 축적, 시스템 붕괴 및 궁극적인 사망으로 이어지는 만성 질환의 가능성 증가와 관련이 있습니다[3–7]. 노년기의 연령 관련 병리의 유병률은 삶의 질과 의료 비용에 상당한 영향을 미칩니다. 따라서, 노화를 지연시키고 건강수명을 연장하기 위한 노인보호제로 이용될 수 있는 효과적인 노화방지 활성을 갖는 개입이 시급히 필요하다.

Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 lipofuscin 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼 소거 능력이 강하고 비타민 C보다 환원 능력이 높으며 정자 현탁액에서 SOD의 활동을 개선하고 MDA 함량을 줄이며 정자 막 기능에 일정한 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력이 있으며 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼 유발 콜라겐 분해를 방지하는 능력이 있으며 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 우수한 복구 효과도 있습니다.

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세포 노화는 상호 연결된 복잡한 생물학적 과정의 네트워크에 의해 제어됩니다[8, 9]. 최근 연구에 따르면 노화 생물학적 과정에 개입하면 포유류를 포함한 모델 유기체의 건강한 수명이 상당히 증가할 수 있습니다[10, 14]. 발아 효모 Saccharomyces cerevisiae의 시간적 노화는 인간 유사분열 후 세포 노화의 개입을 결정하기 위한 잘 확립된 모델 시스템입니다[16-19].

우리는 (1) 투명한 96-웰 ​​플레이트에서 배지 및 테스트 화합물과 함께 배양된 효모 세포; (2) 죽은 세포에만 들어가는 세포 비침투성 형광 염료 프로피디움 요오드화물(PI)[23-25]; 및 (3) 정량적 세포 생존 판독을 위한 마이크로플레이트 판독기. 참고로 OD600nm에서 세포 밀도(및 세포 성장) 측정은 동일한 플레이트에서 수행할 수 있습니다. 96-웰 플레이트의 죽은 효모 세포의 경우 0.05–12 OD에 해당하는 최적의 세포 밀도 범위 내에서 PI 형광과 OD600nm 흡광도 사이에 높은 선형 상관관계가 있음을 발견했습니다. 이 체계적인 접근 방식은 처리량이 많은 분석에서 세포 생존 능력을 정량화하는 데 활용할 수 있습니다.

PICLS와 관련된 몇 가지 중요한 혁신이 있습니다. (i) PICLS는 현재 CLS 정량화를 위한 유일한 무성장 방법입니다. 중요한 시간 및 리소스 요구 단계가 프로토콜에서 잘리므로 PICLS는 CLS 측정을 위한 화학 약품 및 배양 조건에 대한 최초의 진정한 고처리량 스크리닝(HTS)입니다. (ii) PICLS의 방법적 아이디어는 일반적으로 (a) 죽은/생존 세포의 비율 및 (b) 세포의 총량이 동일한 플레이트에서 광 강도로 동시에 직접 결정되는 플레이트 기반 방법으로 공식화될 수 있습니다. 측정 장치(일반적으로 사용 가능한 플레이트 판독기). 이 작업에서는 96-웰 플레이트를 사용했지만 384-웰 플레이트도 적용 가능한 것으로 보입니다(더 적은 양의 배양으로 인해 감도가 약간 낮아질 수 있음). 죽은 세포와 살아남은 세포를 구별하고 일반적인 세포 밀도 측정을 방해하지 않는 채널에서 형광 또는 흡수(예: OD600nm에서 흡수를 통해)를 갖는 모든 착색제가 사용될 수 있습니다. 우리는 죽은 세포를 선택적으로 표시하는 요오드화 프로피디움을 적용했지만 이것은 PICLS에 중요하지 않습니다.

그림 7 2,5-무수-D-만니톨 유사체가 효모의 수명에 미치는 영향을 테스트합니다. 원영양 효모 균주(CEN.PK113-7D)는 2,5-무수-Dmannitol(2,5-AM), D-과당의 농도가 다른 합성 한정 배지에서 성장했습니다. , D-만니톨, D-말토오스 및 D-소르비톨을 96-웰 플레이트에서 30도 . 세포 성장 OD600nm는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 24시간, 48시간 및 72시간의 서로 다른 시점에서 측정되었으며 2,5-AM, 과당, 만니톨, 말토스 및 소르비톨의 서로 다른 농도에 대해 그래프를 그렸습니다. B 다양한 농도의 2,5-AM, 과당, 만니톨, 말토즈 및 소르비톨 배양 세포의 연대기적 수명(CLS)은 요오드화 프로피듐 형광 기반 방법을 사용하여 결정되었습니다. 상이한 연대기적 연령 지점에서의 세포 생존을 정량화하고 성장 시점 72시간을 1일로 간주하였다. C 노화된 세포의 CLS는 YPD 액체 배지에서 생장 방법에 의해 결정하였다. 성장 시점 72시간을 1일로 간주했습니다. 다양한 연령 시점에서 3-μL 배양액을 200μL YPD 배지가 들어 있는 두 번째 96-웰 플레이트로 옮겼습니다. YPD 액체 배지에서 파생물 OD600nm는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 30도에서 24시간 동안 배양한 후 측정되었습니다. 그래프는 1일에 대해 플롯됩니다. D 96-웰 플레이트의 YPD 액체 배지에서 30도에서 24시간 동안 인큐베이션한 후 사진을 찍었습니다. E 다양한 연령 시점에서 3-μL 배양액이 YPD 한천 플레이트에서 발견되었습니다. 파생물은 30도에서 48시간 동안 배양한 후 사진을 찍었습니다. 모든 데이터는 평균±SD로 나타냅니다. *피<0.05, **P<0.01, and  ****P<0.0001 based on two-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons tests (B and C). n.s, non-significant 

우리는 이 물질이 자가형광을 부분적으로 소멸시키기 때문에 일반적으로 형광 분석에 검은색 마이크로플레이트가 권장된다는 점에 주목합니다. 그러나 투명 마이크로플레이트에서 방법을 평가한 결과 검은색 마이크로플레이트와 유사한 효과를 발견했습니다. 검은색 마이크로플레이트는 높은 비용과 관련이 있으므로 대규모 고처리량 스크리닝 프로젝트에 중요한 이점입니다.

우리는 효모의 CLS에 미치는 영향을 재현함으로써 라파마이신 투여 및 칼로리 제한[10–16]과 같은 알려진 노화 방지 개입으로 개발된 방법을 검증했습니다. 이러한 결과는 우리의 방법이 새로운 노화 방지 개입을 식별하는 데 효과적임을 시사합니다. 우리는 새로운 노화 방지 화합물을 식별하기 위해 화학 작용제를 스크리닝하기 위해 새로 개발된 프로토콜을 활용했습니다(그림 8). 우리는 효모의 CLS를 확장하는 2,5-anhydro-D-mannitol(2,5-AM)을 확인했습니다. 결과에 따라 2,5-AM을 개별적으로 또는 다른 노화 방지 개입과 함께 사용할 것을 제안합니다.

2,5-AM은 과당의 유사체이며 두 당 모두 해당 경로에 들어갈 수 있습니다. 당분해는 포도당이 먼저 헥소키나제에 의해 인산화되어 포도당-6-인산(G6P)을 형성하는 대사 과정입니다. 포스포글루코이소머라아제는 G6P를 과당-6-인산(F6P)으로 상호전환하며, 이는 미토콘드리아 TCA 주기에 들어가는 피루브산을 포함하여 다른 하류 당분해 중간체로 추가 대사됩니다. 포도당처럼 과당도 헥소키나제에 의해 인산화되어 F6P를 형성합니다. Phosphofructokinase는 F6P를 fructose-1,6-bisphosphate(FBP)로 변환하며, 이는 다른 하류 분해 중간체로 추가 대사됩니다. 2,5-AM은 또한 헥소키나제에 의해 인산화되어 2,5-AM- 6-포스페이트(2,5-AM6P)를 형성할 수 있습니다[39–41]. 또한 포스포프럭토키나제는 2,5-AM6P를 2,{25}}AM- 1,6-비스포스페이트(2,5-AMBP)로 변환합니다. 그러나 2,5-AMBP는 더 이상 하류 당분해 중간체로 대사될 수 없습니다[39-41].

2,5-AM은 과당 유사체이므로 과당이 효모의 수명을 연장할 수 있는지도 조사했습니다. 그러나 우리는 효모의 CLS를 연장시키는 과당의 노화 방지 활성을 관찰하지 못했습니다. 만니톨과 맥아당은 또한 해당과정에 들어갈 수 있고 하류의 해당과정 중간체로 대사될 수 있습니다. 우리는 또한 만니톨과 맥아당이 효모의 수명에 미치는 영향을 조사했습니다. 과당, 만니톨 및 맥아당도 효모의 CLS를 확장할 수 없습니다.

아직 대사되지 않은 또 다른 당인 소르비톨은 이전에 매우 높은 농도(1M에 해당하는 18%)에서 CLS에 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다. [20, 45], 우리는 2,{{7 }}AM은 배양 배지의 삼투압 증가로 인한 것일 수 있습니다. 우리의 실험은 소르비톨이 2,{9}} AM의 경우 효과적인 낮은 농도에서 효모의 CLS를 증가시키지 못하는 것으로 나타났습니다. 소르비톨은 효모의 CLS를 증가시키기 위해 더 높은 농도를 필요로 하기 때문에 2,5-AM의 노화 방지 메커니즘은 삼투압 효과와 무관합니다. 이러한 결과는 2,5-AM의 노화 방지 활동이 특정적이고 유사한 화학 구조를 가진 여러 다른 유사체와 유사하지 않음을 보여주었습니다.

그러나 2,5-AM이 수명을 연장하는 방법은 아직 조사해야 합니다. 2,5-AM이 노화 특징을 직접 변조하는지 여부를 조사하는 것은 흥미로울 것입니다[8]. TORC1과 AMPK는 노화 과정에 관여하는 포도당 감지 복합체입니다[32, 43]. 그러나 AMPK가 억제되면 TORC1의 억제에 의해 연장된 시간순 수명이 감소합니다. 포도당과 당분해 중간체는 TORC1과 AMPK의 활성을 조절합니다[34, 46, 47]. 2,5-AMBP는 FBP를 글리세르알데히드-3-포스페이트(G3P) 및 디하이드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로 전환하는 것을 촉매하는 알돌라제의 활성을 억제하는 것으로 나타났습니다[39, 40]. DHAP는 triosephosphate isomerase에 의해 G3P로 상호 변환됩니다. 최근의 증거에 따르면 DHAP는 TORC1을 활성화하는 중요한 포도당 신호 분자입니다[48].

당분해 fux는 G3P 및 DHAP 합성이 영향을 받을 때 손상되어 ATP 생산이 줄어듭니다. 흥미롭게도 AMPK는 세포의 에너지 상태가 손상될 때 활성화되고 TORC1을 억제하여 세포 성장을 억제합니다[46, 47]. 따라서 AMPK와 TORC1의 길항 관계는 건강한 세포에 대한 세포 항상성 균형을 보장하기 위한 효율적인 대사 적응입니다. 그러나 우리는 2,5-AM이 세포 성장에 미치는 영향을 관찰하지 못했습니다(그림 6 및 7). 이러한 발견은 세포 성장을 손상시키는 포도당 제한 효과를 배제했지만(그림 5) 느린 성장 표현형으로 수명을 연장했습니다[49]. 그러나 라파마이신에 의한 수명 연장은 세포 성장을 손상시키는 것보다 더 높은 용량을 필요로 하지 않습니다(그림 4). 따라서 TORC1/AMPK를 통해 또는 TORC1/AMPK와 독립적으로 2,5-AM의 노화 방지 활동 가능성을 배제할 수 없습니다.

aldolase에 대한 2,{1}}AMBP의 억제 효과와 달리 마지막 해당 효소인 pyruvate kinase를 활성화시키는 것으로 보고되었다[39-41]. 피루베이트 키나아제는 포스포에놀피루베이트에서 NAD 플러스(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)를 생성하는 공급원 중 하나인 피루베이트로의 전환을 촉매합니다. NAD 플러스는 건강한 세포를 유지하고 수명을 연장하는 데 중요한 여러 세포 과정과 기능을 조절하는 중요한 대사산물입니다[50, 51]. 피루베이트는 또한 미토콘드리아 반응의 주요 기질로, 본질적으로 세포 생존과 건강한 노화를 위해 아미노산, 핵산 및 ATP를 포함한 필수 요소를 합성하기 위해 다양한 빌딩 블록 대사 산물을 생성합니다[52-55]. 실제로, 미토콘드리아 활동의 감소는 노화 및 연령 관련 질병과 관련이 있습니다[53-56]. 최근 2,5-AM은 급성 골수성 백혈병(AML) 암을 치료하기 위한 잠재적 치료제로 제안되었습니다[57].

참고로 우리는 "피클"이라는 말장난을 염두에 두고 새로운 방법을 PICLS(PI 기반 CLS 방법)라고 명명했습니다. 우리의 새로운 프로토콜의 모든 요소는 이미 다른 곳에서 독립적으로 설명되었지만 "발효" 조합은 측정을 간단하고 저렴하게 만들고 최종적으로 높은 처리량을 준비합니다.

결론적으로 우리는 효모의 시간적 수명을 측정하는 정량적 방법을 개발했으며 2,{1}}AM을 새로운 항노화 화합물로 확인했습니다. 현재 2,5-AM의 항노화 작용 메커니즘을 규명하기 위한 연구가 진행 중이다.

재료 및 방법

효모 균주, 배지 및 화학물질

원영양 CEN.PK113-7D 균주 유전적 배경이 이 연구에서 사용되었습니다[35, 36]. 표준이 풍부한 배지 YPD(1% Bacto 효모 추출물, 2% Bacto 펩톤 및 2% 포도당), YPD 한천(2.5% Bacto 한천) 및 6.7g/L 효모 질소 염기와 황산암모늄을 함유하는 합성 정의(SD) 배지 아미노산(DIFCO) 및 2% 포도당이 없습니다. Rapamycin(Enzo) 원액은 dimethyl sulfoxide(Sigma)에서 제조되었습니다. DMSO의 최종 농도는 어떤 분석에서도 1%를 초과하지 않았습니다. 2,5-Anhydro-D-mannitol(Santa Cruz), D-fructose(Sigma), D-mannitol(Sigma), D-maltose(Sigma) 및 D-sorbitol(Sigma) 작동 농도 분말을 매체에 직접 용해하고 필터 멸균.

효모 성장 조건

효모 균주는 30도에서 YPD 한천 배지의 냉동 글리세롤 스톡에서 회수되었습니다. 효모를 220 rpm으로 진탕하면서 30도에서 밤새 SD 배지에서 성장시켰다. 밤새 성장한 세포를 신선한 SD 배지에서 OD600nm~0.2로 희석하여 연대순 수명 실험을 시작했습니다.

연대순 수명 분석

CLS(Chronological Lifespan) 실험은 이전에 설명한 대로 총 20{{10}} µL 효모 배양액이 있는 {{0}}웰 플레이트에서 수행되었습니다[58]. 세포 접종물을 라파마이신의 연속 이중 희석 농도(0–10nM)가 들어 있는 96-웰 플레이트로 옮겼습니다. 칼로리 제한 분석을 위해 2%, 0.5% 및 0.25% 포도당을 포함하는 SD 배지에서 세포 접종물을 준비하고 96-웰 플레이트로 옮겼습니다. 마찬가지로, 세포 접종물을 2,5-무수-D-만니톨, D-과당, D-만니톨, D-말토오스, D-소르비톨. 세포를 30도에서 배양하고 성장을 다른 시점에서 측정했습니다. 성장 시점 72시간은 CLS 분석을 위한 1일로 간주되었습니다. 세포 생존은 (i) 요오드화 프로피듐 형광 기반 방법, (ii) YPD 액체 배지에서의 파생물 및 (iii) 얼룩 분석의 세 가지 접근 방식으로 다양한 연령 시점에서 정량화되었습니다.

(i) 요오드화 프로피듐 형광 기반 방법:프로피듐 요오드화물(PI) 형광 기반 접근법을 개발하기 위한 자세한 절차는 결과 섹션에 언급되어 있습니다. CLS 분석을 위해 서로 다른 연령 시점의 {{0}}µl 효모 세포를 두 번째 96-웰 ​​플레이트로 옮겼습니다. 세포를 세척하고 어두운 곳에서 15분 동안 PI(5 μg/ml)가 포함된 100 μl 1x PBS에서 배양했습니다. 정량 분석을 위해 양성 및 음성 샘플 대조군이 포함되었습니다. 양성 대조군(100도에서 15분 동안 끓인 세포)을 PI 염색하고 동일한 96-웰 플레이트에서 처리했습니다. PI로 염색된 세포가 없는 샘플은 음성 대조군으로 사용되었습니다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 100㎕ PBS에 재현탁시켰다. 샘플의 형광 판독값(여기 535 nm, 방출 617 nm) 및 OD600nm를 마이크로플레이트 판독기(BioTek)로 측정했습니다. 각 샘플의 형광 강도는 OD600nm로 정규화되었습니다. 염색되지 않은 음성 샘플의 배경 신호에서 각 샘플의 정규화된 형광 강도를 뺍니다. 양성 대조군 샘플(삶은 죽은 세포)의 수득된 형광 강도는 0% 세포 생존으로 간주되었다. 우리는 세포가 배지에서 자랄 수 있도록 세포의 죽음 b를 확인했습니다. 양성 대조군 샘플(끓인 세포)을 사용하여 형광 강도를 정규화하여 상이한 연령 시점 샘플의 세포 생존을 계산하였다.

여기서 Iij(535nm∕617nm)는 535nm에서 여기되고 617nm에서 방출되는 플레이트 좌표 i 및 j로 웰에서 측정된 형광 강도이고, ID(535nm∕617nm)는 100% 죽은 세포에 대해 측정된 형광 강도입니다. IC(535nm∕617nm)는 PI가 없는 세포에 대해 측정한 형광강도이고, 각 OD 값은 세포수를 정규화하여 600nm에서 각 세포에 대해 측정한 흡광도이다.

(ii) YPD 액체 배지에서의 성장:다양한 연령 시점의 효모 고정 배양물(3-μL)을 200μL YPD 배지가 들어 있는 두 번째 96-웰 ​​플레이트로 옮기고 30도에서 24시간 동안 배양했습니다. 노화된 세포의 파생물(OD600nm)을 마이크로플레이트 판독기로 측정했습니다. 각 연령 시점에 대한 세포 생존의 정량화는 이전에 기술된 바와 같이 1일(100% 세포 생존으로 간주됨)에 상대적으로 결정되었습니다[19, 20, 58].

(iii) 스포팅 분석:다양한 연령 시점의 효모 고정 배양물(3 μL)을 YPD 한천 플레이트에 점적하고 30도에서 48시간 동안 배양했습니다. BioRad GelDoc 이미징 시스템을 사용하여 YPD 한천 플레이트에서 노화된 세포의 파생물을 촬영했습니다.

데이터 분석

평균값, 표준편차, 상관관계(R2), 유의성, 그래프 등 모든 결과에 대한 통계분석은 GraphPad Prism v.9.3.1 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 결과는 일반 일원 분산 분석과 양방향 분산 분석을 사용하여 통계적으로 비교하고 Dunnett의 사후 검정 또는 Sidak의 사후 검정으로 다중 비교를 수행했습니다. 모든 그래프 플롯에서 P 값은 *P로 표시됩니다.<0.05,  **P<0.01, ***P<0.001, and ****P<0.0001 were considered significant. n.s, non-significant.

감사의 말저자의 MA 및 FE는 이 백서에 설명된 작업의 일부를 포함하는 두 개의 특허 출원(10202201534P 및 10202201536U)의 발명자입니다.

저자 기여MA는 프로젝트를 구상하고 실험을 수행하고 데이터를 분석했습니다. FE는 프로젝트를 공동 구상하고, 데이터를 평가하고, 전략을 고안했습니다. MA와 FE가 논문을 작성했고 모든 저자가 논문을 검토하고 최종 버전에 동의했습니다.

펀딩이 작업은 Bioinformatics Institute(BII), A*STAR Career Development Fund(C210112008) 및 Global Healthy Longevity Catalyst Awards 보조금(MOH-000758–00)의 지원을 받았습니다.

선언

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