만성 신장 질환의 진행에서 인산염의 단백질 독립적 역할
Mar 20, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
아이린 파리아 두에어1 외
추상적인:몇 가지 요인이신장 기능CKD 환자의 감소와 식이에서 인산염 함량의 역할은 여전히 논쟁거리입니다. 이 연구는 단백질과 무관한 인산염이 CKD의 진행과 관련이 있는 기전을 분석하는 것을 목적으로 합니다. AdultMunich-Wistar 쥐는 5/6 신장절제술(Nx)을 받고 저단백 식이를 제공받았고 두 그룹으로 나눴습니다. 인산염 함량(낮은 인산염, LoP, 0.2% ; 높은 인산염, HiP,0.95%)만 식단을 차별화했습니다. 60일 후, 생화학적 매개변수 및신장조직학을 분석했다. HiP 그룹은 더 높은 수준의 PTH, FGF{0}} 및 인산염의 부분 배설과 함께 더 나쁜 신기능을 나타냈습니다. 신장 조직의 조직학적 분석에서 그들은 또한 더 높은 비율의 간질 섬유증, α-액틴, PCNA 및신장대식세포에 의한 침투. LoP 그룹은 HiP 그룹과 비교할 때 자가포식 유출의 마커인 신세뇨관 세포에서 더 높은 beclin{0}} 발현을 나타냈습니다. 우리의 연구 결과는 유도에서 인산염의 작용을 강조합니다.신장간질 염증 및 섬유증, 신장 질환의 진행에 기여합니다. 신장 세포 자가포식 기전의 조절장애에 대한 인산염의 가능한 영향은 임상 연구를 통해 추가 조사가 필요합니다.
키워드:인산염;다이어트; CKD진행;신장섬유증; 자가포식;세포자멸사
주요 기여:인산염 식단을 제한함으로써 신장을 보호하는 메커니즘은 아직 결정되지 않았습니다. 이 연구에서 인산염 과부하는 염증 경로의 활성화 및 유도에 의해 CKD의 진행에 작용했습니다.신장간질 섬유증. 고인산혈증이 신장 세포 사멸 및 자가포식 동료에 미치는 영향은 추가 조사가 필요합니다.
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1. 소개
만성병 환자신장질병 (CKD) 공중 보건 문제로 간주됩니다. 유병률은 연령에 따라 증가하며 전 세계적으로 11~13%로 다양합니다[1]. CKD는 일반적으로 돌이킬 수 없는 상태이지만 혈압, 이상지질혈증 및 고혈당증의 조절, 지오텐신 전환 효소 억제제의 사용, 저단백 식이와 같은 몇 가지 접근법을 사용하여 질병 진행을 늦출 수 있습니다[2-7] . 이러한 전략들 중에서 저단백 식이요법은 지연을 위한 가장 논쟁의 여지가 많은 제안입니다.신장규정 준수, 안전성 및 효능에 대한 우려로 인해 기능이 저하됩니다. 식단에서 단백질을 줄이는 것의 이점에 대한 합의의 부족은 식단에서 단백질과 인산염 함량의 중첩 역할에 의존합니다. 단백질 공급원에는 인산염이 풍부하기 때문에 제한된 인산염 섭취량을 달성하려면 단백질 섭취량을 줄이는 것이 좋습니다. 인산염을 제한하지 않고 단백질을 제한하는 것은 가능하지만 그 반대는 어렵습니다.
실험 연구에서 저단백 식단의 효과는 사구체 손상과 단백뇨[8]로부터 CKD 모델을 보호하여 사구체 여과율을 더 잘 보존하도록 촉진했습니다[9]. 식이 단백질과 인산염은 높은 상관관계가 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 일부 실험 연구는 단백질 제한의 단독 효과를 평가하는 데 중점을 두었지만 의도하지 않은 인산염 제한으로 인해 편향되었을 수도 있습니다. 반면에 인산염이 풍부한 식단이 CKD 발달에 기여한다는 것은 분명히 입증되었습니다[10,11]. 고인산염 식단은 더 많은 간질을 유발하는 것으로 나타났습니다.신장요독증 쥐에서 최소 사구체 경화증과 함께 섬유증 및 세뇨관 위축. 흥미롭게도 손상은 인산염 제한 후에 둔화되었습니다[12]. 참고로, 식단의 단백질 함량은 이 연구에서 언급되지 않았습니다.
임상 시나리오에서 저단백 식단은 보존적 치료에서 점진적 투석 요법으로 전환하는 경우에도 요독 독소의 농도를 감소시키고 잔여 신기능을 보존했습니다[13].다이어트단백질제한은 또한 최근 메타 분석에서 CKD 진행을 지연시켰습니다[14]. 그러나 단백질 제한은 낮은 혈청 인산염 수치와 상관관계가 있기 때문에 이러한 식이의 유익한 효과는 부분적으로 인산염 제한으로 설명될 수 있습니다. 지금까지 가장 큰 전향적 연구인 MDRD[15]는 중등도의 신부전 환자에서 저단백 식이의 이점이 작은 반면, 중증 신부전 환자에서는 신질환의 진행에 영향을 미치지 않았다. 그럼에도 불구하고, 식단에서 인산염의 함량과 속도를 늦추는 데 개인의 기여가 미치는 영향은 이 실험에서 다루지 않았습니다.CKD진행 상황은 아직 알려지지 않았습니다.
인산염은 세포 보호 및 항섬유증에 관여하는 노화 방지 단백질인 신장 및 순환 Klotho[16]를 항산화 및 항세포자멸 효과[17]와 함께 저하시킬 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 또한 Klotho 결핍으로 인한 신세포의 자가포식 결함이 이미 입증되었습니다[18]. Autophagy는 세포 항상성을 유지하고 스트레스 조건에서 세포 생존력을 보존하는 데 중요한 기능을 가진 이화 작용 과정입니다. 일부 증거는 자가포식과 신장 섬유증 발병에 대한 강력한 섬유화 인자인 TGF-신호전달 [19]을 비롯한 다양한 경로를 통한 CKD 진행 사이의 관계를 시사합니다. TGF-는 세포 증식 및 분화, 세포자멸사를 조절하는 여러 생물학적 과정에 영향을 미치고 SMAD 단백질에 의해 매개되는 세포내 신호전달을 유도하는 특정 막관통 수용체에 결합하여 작용합니다[20]. Apoptosis는 괴사와는 다른 프로그램된 세포 죽음의 메커니즘입니다. 인산염은 내피[21], 조골[22] 및 복막 중피 세포[23]의 실험 모델에서 세포 사멸의 매개체로 설명되었습니다. 의 진행에 세포사멸이 관여한다는 증거가 있습니다.신장손상 [24], 그러나 신장 세포 사멸에 대한 인산염의 효과는 아직 밝혀지지 않았습니다.
고인산염식이 요법이 CKD 진행을 가속화하는 메커니즘이 아직 완전히 밝혀지지 않았기 때문에 우리는 이것이 기능 장애자가 포식 동료와 관련이 있을 수 있다고 가정했습니다. 따라서 현재 연구에서 우리는 식단의 인산염 함량에 따라 두 그룹의 Munich-Wistar 쥐를 평가하고(낮은 0.2% 대 높은0.95%) 저인산염 식단신장' 자가포식 마커를 포함한 조직학적 및 면역조직화학 변화, beclin{0}}.
2. 결과
저(LoP) 및 고인산염 식이(HiP) 그룹에서 얻은 혈역학적, 형태학적 및 생화학적 매개변수가 표 1에 나와 있습니다. 예상대로 5/{4}} 신장 절제술은 크레아티닌 청소율의 감소와 증가를 유도했습니다. 두 그룹 모두에서 혈청 요소와 크레아티닌에서. HiP 그룹의 동물은 더 높은 크레아티닌과 더 낮은 크레아티닌 청소율에 의해 입증되는 바와 같이 더 낮은 신장 기능을 나타냈습니다. 그들은 또한 더 낮은 헤마토크릿과 더 낮은 최종 중량을 나타냈다. HiP 그룹은 부갑상선 호르몬(PTH) 및 섬유아세포 성장 인자-23(FGF{6}})뿐만 아니라 혈청 및 인산염의 부분 배설 증가를 나타냈습니다. 참고로 꼬리압, 초기 체중, 소변 알부민 배설량은 그룹 간에 유사했습니다.
조직학적 소견은 그림 1-3에 나와 있습니다. 사구체 경화증(GS)은 두 그룹에서 거의 발견되지 않았습니다. 그러나 간질 섬유증의 비율은 HiP 그룹의 쥐에서 유의하게 더 높았습니다. 따라서, 이들 동물은 또한 표 2에 나타낸 바와 같이 ED{4}} 발현에 의해 평가된, 평활근 액틴 염색 영역 및 대식세포에 의한 더 높은 신장 침윤율을 가졌다. 인산화된 SMAD(p-SMAD) 발현, TGF-베타 경로 활성화의 마커는 그룹 간에 차이가 없었습니다.
증식 세포 핵 항원(PCNA)-양성 세포는 HiP 그룹에서 우세했으며, 이는 인산염 과부하가 보다 강렬한 신장 세포 증식을 촉진함을 시사합니다. 반대로, Apoptotic 세포의 수는 LoP 그룹에서 더 많은 경향이 있습니다. 마찬가지로, beclin 1-양성 세포는 LoP 그룹의 세뇨관 간질 병변에서 유의하게 더 높았으며, 이는 더 높은 인산염이 재생 자가포식 과정을 억제하는 효과가 있음을 나타냅니다.신장조직.
3. 토론
이 실험 연구는 식이 단백질 제한에 관계없이식이 인산염 제한이 CKD의 진행을 늦추는 효과적인 단계인지 조사했습니다. 우리는 5/6-신절제 동물 모델에서 인산염 함량이 서로 다른 식이요법({0}}.2 대 0.95%)의 효과를 조사했으며 모든 동물은 저단백 식이요법을 받았습니다. (12%). 우리의 연구 결과는 PTH, FGF-23의 증가 및 결과적으로 인산염의 분율 배설에도 불구하고 고인산염 식이가 고인산혈증과 관련이 있음을 보여주었습니다. 또한, HiP는 높은 액틴 발현, 대식세포 침윤 및 세포 증식 및 자가포식 억제와 관련된 신장 기능 장애 및 간질 섬유증의 증가를 유발했습니다.
25,546명의 CKD 비투석 환자를 대상으로 한 12개의 코호트 연구에 대한 메타 분석에서 혈청 인산염 수치와신장실패 및 사망 [25]. 더욱이, 13,772명의 투석 환자를 대상으로 한 후향적 코호트 연구에서 고인산혈증과 CKD-미네랄 및 골 장애의 기타 이상 사이의 연관성이 밝혀졌으며 잔류 물의 급격한 감소가 나타났습니다.신장기능 [26]. 인산 제한이 CKD 진행을 지연시키는 메커니즘은 아직 확립되지 않았습니다. 실험 연구에서 우리는 고정 부갑상선을 사용하여 부갑상선 절제술 및 5/{4}}신절제술을 받은 Wistar 쥐의 저인산 식이와 비교할 때 인산염이 풍부한 식이 요법이 더 손상된 신장 기능과 관련이 있음을 보여주었습니다. 호르몬(PTH) 보충 [11]. Kusano et al. [10] 요독증 쥐의 식이 단백질 함량과 관계없이 저인산({11}}.3%) 식단과 신장 기능 보호가 관련되어 있음을 보여주었습니다. 그러나 정상적인 인산염(0.5%) 식이를 섭취한 쥐는 매우 낮은 단백질(8.4%) 식이를 섭취한 경우에만 이러한 이점을 나타냈습니다. 종합하면, 이러한 결과는 식이 인산염의 역할이 식이 단백질보다 더 강력할 수 있음을 나타냅니다. 그러나 위에서 언급한 연구 중 어느 것도 인산염 관련 신장 손상과 관련될 수 있는 잠재적인 경로를 조사하지 않았습니다.
CKD의 진행에서 인산염 과부하의 작용은 여러 연구의 주제였습니다. Labels et al. 처음에 동물 모델에서 이 가능성을 제안했지만 식이 단백질이 조절되지 않아 인산염의 고립된 효과를 가렸을 가능성이 있습니다. CKD 시나리오에서 단백질 제한보다 인산염 비의존적 제한의 이점은 단백질 섭취 제한과 함께 혈청 인산염을 조절하는 위험이 영양실조를 유발하고 사망률을 높일 수 있기 때문에 매우 중요합니다.
인산염 식이 함량이 CKD 환자의 혈청 인산염 농도를 반드시 결정하는 것은 아니며[28], 이 요소의 혈청 농도와 무관한 식이 제한의 중요성을 강조합니다. 뼈와 심혈관계에 대한 인산염의 병리학적 효과는 고인산혈증을 치료하기 위한 중재에 동기를 부여합니다. 임상 실습에서 인산염 수치를 줄이기 위한 중재는 식이 제한과 인산염 결합제로 구성됩니다. 임상 평가변수에 대한 이 접근 방식의 이점은 소규모 표본 연구[29]에서 의심스러웠지만 인산염 과잉이 PTH와 FGF의 과잉 생산에 대한 책임이 있다는 지식에 직면하여{4}} 다음을 유지하는 것이 합리적입니다. CKD 환자에서 가능한 한 낮은 인산염 수치[30].
저단백 식단은 인산염의 낮은 생체 이용률을 유도하고 신세뇨관 세포에서 나트륨 의존성 인산염 재흡수의 매개체인 혈청 FGF-23를 감소시킵니다. 이것은 진행성 CKD에서 인산염 조절 메커니즘이 단백질 식이 함량에 대해 완전히 독립적인 방식으로 인산염 섭취에 의해 어떻게든 영향을 받을 수 있음을 시사합니다. 이러한 이유로 우리는 5/{7}}신절제술 모델에서 인산염 식이 함량이 CKD의 진행에 미치는 영향을 평가했습니다. 이전 실험 연구에서 인산염이 초저단백 식이({10}}.3g/kg)에 대한 항단백뇨 반응을 수정할 수 있음이 이미 입증되었으며, 이는 혈청 인산염 수치와 신장 기능과 무관한 제한된 단백질 식단 [33]. 11명의 CKD 환자(eGFR 30–55 mL/min/m2)를 포함하는 교차 연구에서 혈청 인산염의 일주기 리듬이 고인산염 식이요법으로 변경되었으며 이는 소변 인산염 배설, 부갑상선 호르몬 또는 FGF로 설명되지 않습니다. -23 [34]. 이 결과는 CKD 환자에서 독립적인 치료 목표로서 인산염 식이 제한의 중요성을 강화합니다.
혈역학적 상태는 두 그룹에서 동맥압이 유사했기 때문에 HiP 그룹에서 신장 기능의 악화와 관련이 있는 것으로 보이지 않습니다. 또한, 우리는 단백질 제한으로 설명할 수 있는 우리 모델에서 유의미한 사구체 손상을 찾지 못했습니다. 그러나 우리는 HiP 식단 그룹에서 더 많은 간질 섬유증을 관찰했습니다.
간질 섬유증은 인간 및 쥐의 신장 기능 상실과 잘 연관되어 있습니다.
이전 연구는 peptidyl-prolyl isomerase Pin 1을 통한 고인산염 식이에 의해 유도된 신장 섬유증의 발달과 관련이 있는 반면 [35], 다른 논문에서는 aKlotho 결핍의 유해한 역할을 지적했습니다.신장조직 섬유증 [36,37]. 실험 모델에서 Klotho의 유전적 결실은 노화, 성장 지연 및 석회화를 유발합니다[38]. FGF23-Klotho 신호는 신장 인산염 재흡수를 억제합니다. CKD 설정에서 Klotho 발현은 신세뇨관에서 감소합니다[39]. 더욱이, 인산염이 풍부한 식단은 허혈-재관류 급성 신장 손상 모델에서 aKlotho 결핍을 악화시켰고신장조직 섬유증, CKD 진행 가속화 [18]. Klotho의 신장 발현에 대한 인산염 식단의 영향은 이미 쥐 모델에서 입증되었습니다[40]. 아마도 다른 경로 중에서 인산염 과부하는 세뇨관 세포에서 Klotho 발현을 조절하여 신장 기능을 악화시킵니다. 향후 연구에서 추가로 조사해야 합니다.
세포자살과 섬유증은 TGF-[41,42]와 같은 사이토카인에 의해 매개됩니다. 우리는 속발성 부갑상샘기능항진증과 이에 따른 심장 재형성 과정에 대한 더 높은 TGF 발현의 연관성을 설명했습니다[43]. PTH 활성화와 섬유아세포의 증식, 콜라겐 합성 및 섬유증을 자극하는 TGF-신호전달 사이에 연관성이 있다고 가정합니다. TGF 및 PTH 수용체가 뼈 세포에 통합되어 뼈 리모델링 신호 전달을 조절한다는 실험적 증거도 있습니다[44]. TGF-/Smad 신호전달의 역할신장질병은 이미 설명되었습니다. TGF-는 막관통 수용체에 결합하고 Smads 단백질 인산화를 촉발하고 전사 효과를 위해 핵으로의 전위를 촉진합니다. 따라서, 이들은 TGF-패밀리 구성원의 신호 전달에 필수적입니다. 실제로, CKD가 있는 동물 모델에서 섬유성 신장에서 Smad2 및 Smad3 단백질의 과발현이 이미 입증되었습니다[45]. 흥미롭게도, 최종 당화 산물[46] 및 안지오텐신 II[47]와 같은 TGF-와 무관한 다른 매개체에 의한 Smads 활성화의 증거가 있습니다. CKD의 진행에 대한 고인산혈증의 영향은 실험 모델에서 PTH 대체에 의해 영향을 받지 않았기 때문에 [11], 우리는 인산염이 신장 Smad 신호에 직접적인 역할을 하는지 여부가 궁금합니다. 우리 모델에서, 신세뇨관 세포에서 p-Smad의 발현에 대한 고인산혈증의 영향은 없었다.
그러나 이것은 Smads 인산화와 무관한 TGF-경로 활성화 가능성을 배제하지 않습니다. 이 대체 경로를 조사하려면 추가 연구가 필요합니다.
뼈 조직의 평가에서 인산염 과부하는 조골 세포 유사 세포의 세포 사멸을 유도했습니다 [22]. Rojas et al. 이식된 환자의 뼈 생검에서 낮은 인산염과 부갑상선 호르몬이 있는 사람들에서 세포 사멸 세포의 수가 더 많으면 조골 세포를 증가시키고 세포 사멸을 예방하는 효과가 있음이 입증되었습니다[48]. 골 세포의 세포 사멸에 대한 PTH의 억제 효과는 이전에 입증되었습니다[49]. 뼈 조직에 대한 영향 외에도 세포자멸사 경로는 급성 신부전과도 관련이 있으며[48] CKD 진행의 가능한 매개체가 될 수 있습니다. 우리 모델에서 우리는 통계적 관련성 없이 LoP 그룹에서 세포 사멸을 겪는 세포의 우월한 비율을 관찰했습니다. 이러한 고려 사항은 고인산혈증으로 인한 세포자멸사 메커니즘 손상을 시사합니다. 그러나 우리는 인산염의 배타적 효과를 평가하는 것이 불가능하다는 점을 명심해야 합니다.신장동물도 PTH 및 FGF{0}} 상승이 발생하면 조직 세포사멸이 일어납니다.
현재 연구에서 우리는 자가포식소체 막 핵형성에 필요한 조절 단백질인 beclin{1}} 단백질을 측정하여 고인산염 식이에 의한 신기능 장애의 또 다른 가능한 기전인 자가포식 기능 장애를 해결했습니다[50]. Autophagy는 리소좀을 통한 세포 구성 요소의 분해를 포함하는 이화 작용 경로입니다 [51,52]. Beclin{5}} 인산화는 포스파티딜이노시톨{7}}포스페이트 키나제 복합체 활성화 및 자가포식소체 생합성 막 부위로의 동원에 대한 자가포식 특이적 신호로 간주되었습니다[53]. beclin-1의 녹다운은 자가포식을 억제하고[54], 허혈-재관류는 그 수준을 증가시킵니다[55]. beclin{13}}의 감소와 이에 따른 mTOR의 상향 조절은 악성 세포의 성장을 감소시켜 자가포식의 생존 촉진 효과를 강조합니다[52].
Klotho의 항섬유증 효과는 또한 AKI 모델에서 허혈성 손상이 약화되고 높은 인산염 수준에 의해 손상되는 경로인 상향 조절된 자가포식 과정과 연관되었습니다. 실험 연구에 따르면 자가포식 플럭스가 대식세포 침윤 및 인산염 유발 신장 섬유증을 완화하는 것으로 나타났습니다. 또한 인산염이 풍부한 환경은 시험관 내에서 관상 세포에서 미토파지를 유도합니다[56]. 우리의 데이터는 식단의 인산염 함량이 생체 내 신세뇨관에서 beclin{5}}의 발현도 조절한다는 것을 보여주었습니다. HiP 식단은 또한 PCNA 및 TUNEL 분석에서 각각 묘사된 바와 같이 더 많은 세포 증식 및 더 낮은 세포자멸사 비율을 향한 경향과 관련이 있었습니다. 그러나 우리 모델에서는 이것이 인산염 과부하의 직접적인 영향인지 아니면 고인산혈증에 의해 유발된 PTH 및 FGF{6}} 수치의 이상 때문인지 식별할 수 없었습니다. 이 발견은 임상 시나리오에서 확인되어야 합니다.
이 연구의 주요 이점은 저단백 식단에서 인산염 제한이 CKD 진행에 미치는 영향을 평가하는 것이었습니다. 여기에는 조직학적 패턴과 분자 표현형에 미치는 영향에 대한 조사가 포함됩니다.신장조직. 우리가 아는 한, 이것은 생체 내에서 인산염 식이에 의한 신세뇨관 세포의 자가포식 마커인 beclin{0}} 발현의 조절을 입증한 첫 번째 연구입니다. 주요 제한 사항은 PTH 및 FGF의 상승과 같은 다른 CKD-MBD 관련 이상과 고인산혈증의 영향을 분리할 수 없다는 것이었습니다-23. 우리는 또한 중간 인산염 함량 또는 신장 Klotho 발현을 갖는 식이를 평가할 수 없었습니다. 그러나 우리 모델은 HiP 다이어트가 일반적으로 부갑상선 기능 항진증 및 높은 수준의 FGF와 관련이 있는 실제 조건을 재현합니다-23.
4. 결론
요약하면, 이 연구는 인산염 식이가 CKD 진행에 역할을 하여 아마도 간질 섬유증을 증가시킬 수 있다는 증거를 제공했습니다. 또한, 인산염이 풍부한 식단은신장자가포식 과정. 인산염이 신장 기능을 악화시키는 단백질 비의존적 경로의 확인은 임상 환경에서 CKD 진행을 예방하거나 감소시키는 것을 목표로 하는 새로운 접근법의 개발을 위한 중요한 길을 열 수 있습니다.
5. 재료 및 방법
지역 시설에서 얻은 성체 수컷 뮌헨-위스타 쥐가 이 연구에 포함되었습니다. 쥐는 23 ± 1 ºC, 공기 습도 60 ± 5%, 12:{6}}시간 명암 주기로 유지되었습니다. 모든 동물은 수돗물을 자유롭게 이용할 수 있었고 저단백 식단(12% 단백질)을 먹였습니다. 2개월 후 혈액, 소변 및 신장 조직을 분석할 때 동물을 희생시켰다. 꼬리 커프 압력, 크레아티닌 청소율 및 일일 소변 알부민 배설이 모든 쥐에서 결정되었습니다. 실험 설계는 부록 A(그림 A1)에 나와 있습니다.
5.1. 분석 기법
Nx 60일 후, 동물을 티오펜탈 나트륨(50 mg/kg BW)으로 마취하고 혈액 샘플을 수집했습니다. 혈청 크레아티닌 농도는 비색법으로 평가하였다. 혈청 알부민, 인산염, 요소, 칼슘 및 헤마토크릿을 표준 방법으로 측정했습니다. PTH는 ELISA(Immutopics, San Clemente, CA, USA)로 측정하였다. FGF-23는 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA kit(KAINOS, Japan)를 사용하여 측정하였다. 우리는 혈청 및 소변 크레아티닌 수준을 기반으로 한 크레아티닌 청소율에 의한 사구체 여과를 계산하고 ml/min으로 표시하고 공식으로 계산했습니다: 소변 크레아티닌(mg/dL) × 소변 동료(mL/min)/혈청 크레아티닌(mg/dL). 요 알부민은 방사형 면역확산에 의해 결정되었습니다.
- 왼쪽의 3분의 1신장왼쪽 신장 동맥의 두 개 또는 세 개의 가지가 닫혀 있습니다. 가짜 수술 쥐는 신장 질량 감소 없이 마취 및 신장 척추의 조작을 받았습니다. 마취에서 회복된 후, 동물을 원래의 우리로 돌려보냈고, 다음 24시간 동안 따뜻하게 하였다.
소변 및 혈청 인산염(mg/dL), 소변 및 혈청 크레아티닌(mg/dL)을 통해 인산염(FEP)의 분수 배설을 얻었으며, 퍼센트로 표시되며 다음 공식으로 표시됩니다. (소변/혈청 인산염)/(소변/혈청) 크레아티닌) × 100.
5.2. 실험 그룹
동물을 식단의 인산염 함량에 따라 아래에 명시된 두 그룹으로 나누었습니다. 저인산염 식단(LoP): n=20; 동물은 TD-90016, 12% 단백질 식단, 0.2% 인산염 농도로 수정되었습니다. 고인산염 식단(HiP): n=19; 동물에게 TD{8}}, 12% 단백질 식이를 제공하고 00.95% 인산염 농도로 수정했습니다.
5.3. 조직학적 기법
남은 자신장관찰된 MAP에서 식염수를 사용하여 제자리에서 관류시킨 다음 고정을 위해 Duboscq-Brasil 용액으로 관류했습니다. 무게를 측정한 후, 두 개의 midcoronal 신장 조각을 완충된 4% 포름알데히드에 고정했습니다. 그런 다음 신장 조직을 파라핀에 포매하고 이전에 설명한 대로 조직 형태 측정 및 면역 조직 화학을 위해 준비했습니다[57].
모든 형태 측정 평가는 그룹에 대해 눈을 멀게 한 단일 관찰자가 4-μm 두께 섹션에서 수행했습니다. 각 쥐에 대해 사구체 경화증(GS)의 중증도는 과요오드산 Schiff(PAS)로 염색된 섹션에서 각 사구체(쥐당 최소 120개 검사)에 점수를 할당하여 터프트 영역의 경화된 부분을 추정하는 점수를 할당하여 추정했습니다. , 그리고 이전에 설명한 대로 각 쥐에 대한 GS 지수(GSI)를 유도합니다[58]. 간질 확장의 정도를 평가하기 위해, 간질 섬유증이 차지하는 신피질 영역의 백분율(퍼센트 IF)은 포인트 카운팅 기술에 의해 Masson 염색 섹션에서 추정되었습니다[59].
5.4. 면역조직화학
4 µm 두께의 파라핀이 포함된 신장 절편을 6% 실란으로 코팅된 유리 슬라이드에 장착했습니다. 절편을 탈파라핀화하고 재수화한 다음 구연산염 완충액에서 가열하여 항원 검색을 강화했습니다. 트리스 완충 식염수(TBS) 또는 카제인 기반 단백질 차단 용액(Protein Block; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, USA(PCNA, pSmad 및 Beclin용)), 비특이적 결합 방지. 일차 항체와 함께 인큐베이션은 4℃에서 밤새 수행하였다. 음성 대조군은 1차 항체를 생략하여 수행했습니다.
다음 1차 항체가 사용되었습니다: 대식세포 검출을 위한 모노클로날 마우스 항-래트 ED{1}} 항체(Serotec, Oxford, UK); α-액틴 검출용 마우스 모노클로날 항-알파 스무드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA); autophagy 분석을 위한 polyclonal anti-Beclin 1 항체(Boster, Pleasanton, CA, USA). 세척 후, 섹션을 비오틴화된 항-마우스 IgG(H + L), (Vector, Burlingame, CA, USA)와 함께 45분 동안 배양한 다음 VECTASTAIN® ABC-AP Kit, Vector® Red(Vector, Burlingame, CA , 미국) 30분 동안 그런 다음 단면을 빠른 적색 염료 용액으로 현상했습니다.
단일클론 마우스 항증식 세포 핵항원(Dako, Denmark) 및 phosphor-smad2(Ser465/467) 항체(Cell Signaling, Danvers, MA, USA)에 대해 3% 과산화수소 용액과 메탄올을 사용하여 30분간 내인성 과산화효소 억제를 수행하였다. 분 그런 다음 섹션을 4 °C의 가습 챔버에서 1차 항체와 함께 밤새 배양했습니다. 다음날 섹션을 비오틴화된 항-마우스 IgG(H + L) 또는 비오틴화된 항-쥐 IgG(H + L)(Vector, Burlingame, CA, USA)와 함께 45분 동안 인큐베이션한 다음 VECTASTAIN® ABC- 30분 동안 HRP 키트(Vector, Burlingame, CA, USA). 그런 다음 섹션은 3-아미노-9-에틸 카바졸 기질 발색체(AEC)(Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 전개되었습니다. 모든 섹션을 증류수로 헹구고 Kaiser의 글리세린 젤라틴(Merck, Darmstadt, Germany)으로 덮인 Mayer's Hemalum 용액(Merck, Darmstadt, Germany)으로 대조염색했습니다.
ED-1, p-Smad, Beclin 및 PCNA의 간질 신장 밀도 추정을 위해 양성 세포의 수/mm2를 400X 배율에서 맹검 방식으로 평가했습니다. -actin을 평가하기 위해 우리는 비디오 모니터에 연결된 100-점안경이 있는 현미경을 사용하여 점 카운트 기법을 활용했습니다. 3200배율로 25개 분야를 분석했습니다. 결과는 전체 면적을 고려하여 백분율로 표시하였다.
5.5. 아폽토시스
Apoptag plusPeroxidase in Situ Apoptosis Detection Kit(S7101, Millipore Sigma, MA, USA)에서 제공하는 지침을 사용하여 TUNEL 기술(TdT 매개 X-dUTP Nick end labeling)에 의해 신세뇨관 세포에서 세포자멸사를 결정했습니다. 세포사멸 세포를 1000배의 배율로 25개 필드에서 분석하여 세포/mm2로 표현된 최종 값을 얻었다.
5.6. 통계 분석
LoP 그룹과 HiP 그룹 간의 차이는 그에 따라 독립 스튜던트 테스트 또는 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 테스트되었습니다. 변수 간의 관계는 Spearman 상관계수로 조사하였다. 데이터는 달리 표시되지 않는 한 평균 ± SE로 표시됩니다. p-값<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">
자금:이 연구는 상파울루 연구 재단(FAPESP—Grant #. 2010/05409-6)의 지원을 받았습니다. Moyses, Jorgetti, Zatz 및 Elias는 CNPq(Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico)의 지원을 받았지만 이 재정 지원은 이 문서를 작성하는 데 아무런 역할도 하지 않았습니다.
기관 검토 위원회 성명서:이 연구는 지역 윤리 심사 위원회의 권고에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP(CEUA, 프로세스 #090/10 및 승인 날짜 2010년 8월 10일)에 의해 승인되었습니다. 모든 실험 절차는 실험 동물의 조작 및 관리에 대한 엄격한 국제 표준을 따랐습니다.
데이터 가용성 설명:이 연구에 제공된 데이터는 교신저자의 요청에 따라 제공됩니다.
감사의 말:저자는 전문 기술 지원에 대해 Wagner Dominguez에게 감사합니다. 이해 상충: 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
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