Cyclo-oxygenase(COX-2)와 저산소증 유발 질환의 관계

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세포 내 프로스타글란딘 E2는 저산소증으로 인한 근위 세뇨관 세포 사멸에 기여합니다

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

근위세뇨관세포(PTC)는 특히 저산소증으로 인한 세포자멸사에 취약하며,신장병. 우리는 여기에서 저산소증 하에서 PTC 사망이 인간 근위 세뇨관 HK{3}} 세포에서 확인된 프로스타글란딘 E,(PGE,)의 cyclo-oxygenase(COX{1}}) 의존적 생산에 의해 매개된다고 가정했습니다. (1% O,) 유도 세포자멸사(i)는 COX-2(cyclo-옥시게나제) 억제제 및 프로스타글란딘(EP) 수용체의 길항제에 의해 및 (ii) COX의-1 -의존적 전사 상향 조절로 인한 세포내 PGE(iPGE)의 증가와 관련이 있었습니다. }}(사이클로-옥시게나제). 아폽토시스는 또한 프로스타글란딘 흡수 수송체 PGT의 억제제에 의해 예방되었는데, 이는 iPGE가 저산소증으로 인한 세포사멸에 기여함을 나타냅니다(반대로 저산소증/재산소화로 인한 PTC 사망은 전적으로 세포외 PGE에 기인합니다). 따라서, iPGE는 저산소증으로 인한 세뇨관 손상의 발병기전에서 새로운 행위자이며 PGT는 신장 질환에서 저산소증 의존성 병변의 예방을 위한 새로운 치료 표적이 될 수 있습니다.

관상 저산소증이 급성 및 만성 질환 모두에 관련된 요인이라는 것은 잘 알려져 있습니다.신장병'2 근위 세뇨관 세포(PTC)는 에너지를 요구하는 재흡수 활동으로 인해 산소 소비 측면에서 매우 활동적이며 결과적으로 저산소증에 취약합니다. 세포자살은 저산소증에 노출된 배양된 PTC에서 관련 역할을 하는 것으로 나타났지만 세포자멸사 기계의 활성화를 담당하는 신호전달 경로는 조사되지 않았습니다. 우리와 다른 사람들은 프로스타글란딘 E, (PGE,), 많은 생리적 및 병리학 적 과정의 중요한 지질 매개체라는 것을 발견했습니다.신장, 시스플라틴 7, 알부민 8 또는 렙틴 및 젠타마이신으로 치료할 때 PTC 세포 사멸을 유도하는 신호 전달에서 중요한 역할을 합니다. 모든 경우에, PGE의 증가는 cyclo-oxygenase-2(COX-2)의 향상된 발현에 의존하는 것으로 밝혀졌습니다.(시클로옥시게나제)COX{0}}l과 함께 프로스타글란딘 합성의 속도 제한 단계인 유도성 효소. 인간에서신장, 기초 COX-2(시클로옥시게나제)표현은 COX{0}}보다 덜 강렬합니다. 콕스-2(시클로옥시게나제)생리학적 조건에서 족세포와 헨레 고리의 일부 및 신장 혈관계에서 확인되었습니다.10. 그러나 병리학적 상태에서 COX{1}} 면역반응은신장PTC를 포함하여 신장 손상에 기여할 수 있습니다. 흥미롭게도 저산소증은 COX{0}}의 발현을 증가시킵니다.(시클로옥시게나제)및/또는 많은 세포 유형에서 PGE,{0}}i7의 생산. 사실, 우리는 이전에 저산소증이 PGE의 세포 내 함량과 세포 외 배지로의 방출을 향상시킨다는 것을 발견했습니다. 따라서 PGE가 PTC에 대한 저산소증의 세포 사멸 효과를 매개하는 것이 이론적으로 가능합니다.

PGE 의존성 세포자멸사에 대한 대부분의 연구는 본질적으로 세포외 PGE와 관련된 기전에 초점이 맞춰져 있는데, 이는 PGE가 원형질막에 걸쳐 있는 G-단백질 결합 PGE, 수용체(E 시리즈 프로스타글란딘 수용체)의 활성화를 통해 생물학적 효과를 발휘한다는 것이 널리 받아들여지고 있기 때문입니다. EP1-4)1. 그럼에도 불구하고 일부 모델에서는 세포 내 PGE(iPGE)가 세포 사멸 세포 사멸과 관련이 있습니다720-22. 이는 세포사멸을 유도하기 위해 PGE가 다시 세포내 배지에 도달하여 세포 내부에 위치한 EP 수용체(iEP 수용체)의 하위 집합을 활성화해야 함을 의미합니다. PGE를 포착하는 작업은 주로 프로스타글란딘 흡수 수송체(PGT){7}}에 ​​의해 수행되기 때문에 PGT 억제는 iPGE 매개 세포사멸 세포사멸을 예방합니다.

이러한 배경을 고려하여 현재 작업에서 COX{0}}(시클로옥시게나제)iPGE의 의존적 증가, 수준은 PTC에서 저산소증으로 인한 세포 사멸을 매개합니다.

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행동 양식

시약.

AG1478, 브로모크레졸그린(BG), PGE, AH6809, GW627368X, 크리스탈 바이올렛, 트립판 블루 용액, 브로모술포프탈레인(BRS), 3-(5'-히드록시메틸2'-푸릴)-1-벤질 인다졸(YC1), 및 악티노마이신 D는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. Z-VAD-FMK 및 celecoxib는 각각 Calbiochem(Darmstadt, Germany) 및 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입했습니다. TriReagent는 Vitro(Madrid, Spain)에서 구입했으며 PVDF 멤브레인과 Western blotting luminol 시약은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA. USA)에서 구입했습니다. ProLong Gold 변색 방지 시약은 4,{13}}diamidino{14 }}페닐 인돌(DAPI), annexin-V-FITC(fluorescein isothiocyanate)/propidium iodide(PI) 세포자멸사 검출 키트 및 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA) 프로브는 Invitrogen(Carlsbad, CA, 미국) 및 Molecular Probes(미국 오레곤), 각각. 항체는 다음 출처에서 얻었습니다. 항-PGE 및 항-COX-2(시클로옥시게나제)항체는 Abcam(Cambridge, UK)으로부터; anti-Bax 및 anti-Bcl-2은 Santa Cruz Technologies(Santa Cruz, CA.USA); 항-HIF-1a 항체 및 -토끼-Alexa-Fluor 488은 각각 BD Biosciences(Palo Alto, CA, USA) 및 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 제공되었습니다. 항- -액틴 및 토끼 항-마우스 IgG 과산화효소 접합체는 Sigma(St.Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.

세포 배양 및 실험 조건.

인간 근위 관형 HK{0}} 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)(Rockville, MD, USA)에서 구입했습니다. 세포는 10% 소태아로 보충된 DMEM/F12 37도에서 5% CO에서 유지되었습니다. 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B 및 1% 글루타민(Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) 및 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ThermoFisher. Grand Island, NY, USA). 모든 실험에서 세포 70-90% confluence로 도금하고 완전히 부착되면 저산소(1% 산소) 또는 정상 산소 조건(21% 산소)에서 배양했습니다.저산소증실험은 In vivo200에서 수행되었습니다.저산소증워크스테이션(영국 웨스트요크셔주 Ruskin Technology). 을 위한저산소증/재산소화 실험, 세포는저산소증24시간 동안, 그 후, 세포를 정상산소 조건에서 최대 3시간 동안 배양하였다(재산소화 기간).

iPGE의 면역형광 분석 및 COX의 웨스턴 블롯 분석-2(시클로옥시게나제)및 HIF-1 .

면역형광 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 위한 세포를 각각 유리 커버슬립(4×104세포/유리 커버슬립) 또는 6-웰 플레이트(15×104세포/웰)로 분할하고 "결과"에 기재된 바와 같이 인큐베이션하였다. 그런 다음 면역형광 및 면역블롯팅 분석을 기본적으로 앞서 설명한 대로 수행했습니다.항체 작업 희석은 PGE의 경우 1/50, COX의 경우 1/1000{10}}(시클로옥시게나제)/HIF{0}}a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 및 -actin의 경우 1/5000 면역형광 검출은 Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine에 관한 Biomedicine Research Networking Center(CIBER-BBN)의 공초점 현미경 서비스(ICTS 'NANBIOSIS'U17)를 통해 Leica SP5 공초점 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 수행되었습니다. 알칼 대학교, 마드리드, 스페인)

일시적 형질감염.

siRNA PGT(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 야생형 인간 15-하이드록시-프로스타글란딘 탈수소효소(p15-PGDH)의 cDNA를 포함하는 포유류 발현 벡터 pcDNA3 또는 인간 COX에 대한 루시퍼라제 리포터 플라스미드 구성-2(시클로옥시게나제)phPES2-룩, 인간저산소증응답 요소(HRE)p9HIF1-Luc 및 R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) 및 루시퍼라제 활성 측정은 다른 곳에서 설명한 대로 수행되었습니다27,28.

세포 수 및 세포/핵 형태.

부착 세포의 수는 수정된 크리스탈 바이올렛 염색 방법2으로 분광광도계로 결정되었습니다. 세포 사멸의 증거를 감지하기 위해 위상차 현미경을 사용하여 세포 형태를 관찰했습니다. 세포 핵은 이전에 설명된 대로 DAPI로 DNA 염색 후 시각화되었습니다0. 조사된 전형적인 세포자살 형태에는 세포 수축, 핵 응축 및 단편화, 세포자멸체 형성이 포함됩니다. 정량화를 위해 각 실험 조건에서 6개의 필드를 블라인드 방식으로 조사하여 세포 사멸과 유사한 외관을 갖는 핵의 백분율을 추정했습니다.

트립판 블루 염료 배제 시험에 의한 유세포 분석 세포자멸사 검정 및 세포 생존력 검정.

플레이트에 부착된 세포는 트립신 처리에 의해 분리되었고, 이전에 배양 배지로부터 회수된 분리된 세포와 함께 분석에 사용되었다.

Annexin-V-FITC/PI apoptosis 감지 키트는 이전에 설명한 대로 apoptotic 및 necrotic HK{2}} 세포의 유세포 분석 감지를 허용했습니다. 더럽히는 것. 괴사 세포는 PI에만 양성이었고 살아있는 HK{4}} 세포는 염색을 나타내지 않았습니다.

Trypan blue 염료 배제 테스트를 사용하여 세포 생존력을 평가했습니다. 살아있는 세포(백색)와 죽은 세포(파란색)는 광학현미경과 혈구계산기를 사용하여 계수하였다.

통계 분석.

각 실험은 적어도 세 번 반복되었습니다. 결과는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 그들은 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 다중 비교를 위한 Bonferroni의 테스트를 받았습니다. 유의 수준은 P 0.05 이하로 설정되었습니다.

결과

저산소증은 근위 세뇨관 HK{0}} 세포 사멸을 유도합니다.

저산소증크리스탈 바이올렛 분석에 의해 평가된 HK{0}} 세포의 수를 감소시켰고(그림 1a), 또한 세포 라운딩 및 플레이트로부터의 분리를 유도했습니다(그림 1b, 상부 패널). 예상대로,저산소증상당한 핵 응축, 단편화 및 세포 사멸 유사체의 형성과 같은 세포 수축과 같은 세포 사멸의 명확한 형태 학적 특성을 가진 세포 사멸 모델을 촉발했습니다 (그림 1b의 DAPI로 핵 염색 참조, 왼쪽 하단 패널).저산소증-유도된 아폽토시스는 유세포 분석에 의해 평가된 아넥신 V-FITC 염색의 증가 및 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK로의 예방에 의해 추가로 확인되었다(도 1c).저산소증또한 생존 세포 수의 감소를 결정했지만 괴사 세포 수에서 통계적으로 유의한 변화를 유도하지 않았다(도 1c, 삽입).

그림 1. 저산소증은 근위 세뇨관 HK{1}} 세포 사멸을 유도합니다.(a) 세포 수 감소(크리스탈 바이올렛 분석). (b) 아폽토시스의 형태학적 특성. 대표적인 위상차 현미경 사진(상단 패널, 원래 배율, 10배) DAPI 염색 현미경 사진(하단 패널, 원래 배율, 40배). (c) apoptosis의 증가(유세포 분석 연구). Annexin V 플러스 세포는 Annexin V 플러스 /propidium iodide-cells(즉, 원형질막 완전성이 보존된 초기 세포사멸 세포) 및 annexin V 플러스 /propidium iodide 플러스 세포(즉, 후기 세포사멸 세포)로 구성됩니다. 삽입: 세포 집단의 유형(Annexin V-/ propidium iodide 플러스 세포는 괴사 세포이고 annexin V-/ propidium iodide-는 세포가 살아 있음). 결과는 총 이벤트 수에 대한 백분율로 표시됩니다. 일반 정보:(1) 세포는 "방법?"에 표시된 대로 정상산소(21% O2) 또는 저산소(1% O,) 조건에서 24시간 동안 배양되었습니다. 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK(25μM)는 에 노출을 시작하기 1시간 전에 추가저산소증. (2)현미경 사진은 세 가지 독립적인 실험의 대표적인 예입니다. 그래프의 막대 및 오차 막대: 각 막대는 3가지 다른 실험의 평균±SEM을 나타냅니다. *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">저산소증;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">저산소증플러스 ZVAD.

콕스{0}}(시클로옥시게나제)/iPGE,/EP 수용체 경로는 저산소증에 의해 유도된 근위 세뇨관 HK{0}} 세포 사멸을 매개합니다.

COX{0}}의 역할을 평가하기 위해(시클로옥시게나제)/iPGE2/EP 수용체 경로저산소증- HK-2 세포 사멸 유도, 우리는 먼저 COX-2인 celecoxib와 세포를 사전 배양했습니다.(시클로옥시게나제)억제제1; AH6809, EP1, EP2 및 EP3 수용체의 길항제 또는 GW627368X, EP4 수용체33의 길항제; 또는 bromocresol green 또는 bromosul-fophthale 둘 다에서 PGT435.PGT의 억제제가 siRNA로 형질감염을 통해 녹다운되었습니다.

그림 2. COX-2(시클로옥시게나제)/iPGE,/EP 수용체 경로는 저산소증으로 인한 근위 세뇨관 HK{1}} 세포 사멸을 매개합니다.(a) 경로 억제제에 의한 세포 사멸 예방. 상부 패널; 막대는 총 세포 사멸의 백분율(왼쪽) 또는 세포 사멸 아넥신 V 플러스 세포의 백분율(오른쪽)을 보여줍니다. 노출되기 전에저산소증, 세포를 3μM celecoxib(COX-2와 함께 1시간 동안 사전 배양했습니다.(시클로옥시게나제)억제제);10μM AH6809, (EP{2}} 수용체 길항제), 10μM GW627368X(EP4 수용체 길항제); 또는 50μM 브로모크레졸 그린(BG) 또는 25μM 브로모술포프탈레인(BrS), 두 가지 PGT 억제제와 함께 사용합니다. 하단 패널: 왼쪽: siRNA로 형질감염(transfection)을 통해 PGT를 녹다운(knock-down)하여 세포 사멸 방지(trypan blue dive exclusion test). 삽입: PGT 녹다운 효과(웨스턴 블롯 분석) 오른쪽: 브로모크레졸 그린(BG) 예방 효과의 농도 의존성. (b)프로스타글란딘 불활성화 효소 15-하이드록시-프로스타글란딘 탈수소효소({10}}PGDH) cDNA(트립판 블루 염료 배제 테스트)를 포함하는 포유동물 발현 벡터로 형질감염에 의한 세포 사멸 방지. 삽입: {{의 발현 11}}트랜스펙션된 세포의 PGDH(Western blot analysis). (씨)저산소증iPGE에서 PGT에 민감한 증가를 유도합니다. 왼쪽: PGE, 의존성 면역형광 단독 또는 DAPI를 사용한 핵 염색과 병합이 표시됩니다(원래 배율, 40배). 오른쪽: Image J 소프트웨어를 사용하여 왼쪽 패널에 표시된 이미지에 대한 정량적 접근. (d) EGFR 활성화 억제제 AG1478은 HK{4}} 세포 사멸 EGFR을 예방하지 않습니다. 세포를 1 μM AG1478과 함께 1시간 동안 사전 인큐베이션한 후저산소증. (e) PGT 억제제 BG는 아래의 HK-2 세포에서 Bax 및 Bcl{0}}의 발현을 수정하지 않습니다.저산소증(웨스턴 블롯 분석). (f) 예방저산소증/재산소화-유도 경로 억제제에 의한 세포 사멸(트리판 블루 염료 배제 테스트). 세포는 경로의 억제제와 함께 사전 인큐베이션되었고저산소증(a)에서와 같이. 그런 다음, 세포를 3시간 동안 정상산소에 노출시켰다. 일반 정보:(1) "방법"에 표시된 대로 세포를 정상 산소(21% O) 또는 저산소(1% O) 조건에서 24시간 동안 배양했습니다. (2)현미경 사진은 세 가지 독립적인 실험의 대표적인 예입니다. (3) 억제제의 용매(luL/mL 배지)는 의 효과를 변경하지 않았습니다.저산소증세포 사멸시(결과는 표시되지 않음). (4) 웨스턴 블롯 분석: 항액틴 또는 항 GAPDH 항체로{1}프로빙하여 동일한 단백질을 확인했습니다. (5) 그래프의 막대 및 오차 막대: 각 막대는 3가지 다른 실험의 평균±SEM을 나타냅니다.*P<0.01><0.01>저산소증또는저산소증/재산소화.

도 2a에 도시된 바와 같이,저산소증-유도된 근위 세뇨관 세포 사멸은 모든 경우에서 예방되었습니다. celecoxib에 의한 세포자멸사 억제는 COX{1}}(시클로옥시게나제)에서 관련 역할을 한다저산소증-유도된 아폽토시스 세포 사멸(그림 2a, 상단 패널, 오른쪽). 보다 구체적으로, EP 수용체의 길항작용에 의해 세포사멸이 방지되었다는 사실은 세포사멸이 COX에 의해 매개된다는 것을 의미합니다-2(시클로옥시게나제)-PGE의 의존적 생산. 반면에 iPGE는저산소증- HK-2 세포 사멸은 (i) PGT의 억제(그림 2a) 또는 (i) 15-PGDH의 과발현(그림 2b)에 의해 방지되었기 때문에 방지됩니다. 산화25(참고로, 형질감염 절차 자체가 HK{7}} 세포의 감수성을 증가시켰습니다.저산소증: 세포 사멸은 형질감염되지 않은 세포의 15-20%에 비해 대조군 조건에서 형질감염의 경우 45-55%였습니다. iPGE의 기여에 대한 추가 지원,저산소증-유도된 HK{1}} 세포 사멸은저산소증iPGE1의 세포 함량 증가를 결정하고 이러한 증가는 PGT 억제제에 의해 방지되었습니다(그림 2c).

MAPK 신호 전달 경로는 세포자멸사를 유도할 수 있습니다. iEP 수용체는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)36을 트랜스활성화하여 HK{4}} 세포0에서 MAP 키나제 ERK1/2 및 p38의 활성화를 유도하기 때문에 사전 - EGFR 활성화 억제제 AG1478과 함께 HK-2 세포의 배양 방지저산소증-유도된 세포 사멸. 우리는 음성 결과를 찾았고(그림 2d), 따라서 EGFR의 transactivation이 HK{2}} 세포 사멸을 매개하는 것 같지 않습니다.저산소증.

여러 실험 모델에서 미토콘드리아 유래 ATP의 감소는저산소증pro-apoptotic protein Bax 대 anti-apoptotic protein Bcl{2}} 발현 비율을 증가시켜 시토크롬 C를 시토졸로 방출하고, caspase 9를 활성화하고, 다운스트림 이펙터를 절단하고 활성화합니다. 카스파제37,38. 그러나 HK-2 세포에서 PGT 억제제 BG와 함께 사전 배양저산소증HK-2 세포에서 이들 단백질의 역할을 지원하지 않는 Bc-2와 Bax(그림 2e)의 발현 간의 균형에서 항세포자멸사 변화와 호환되는 변화를 일으키지 않았습니다. 아래의 죽음저산소증.

저산소 노출 후 재산소화 에피소드(허혈/재관류 손상)는 추가적인 세포 손상을 유발할 수 있습니다. 재산소화 손상의 "역설"은 세포가 효소 활성, 미토콘드리아 기능, 세포골격 구조, 막 수송 및저산소증, 그 다음 집합적으로 재산소화 손상을 일으키기 쉽습니다. Reoxy-genation은 허혈성 뇌졸중, 신장 이식, 순환 장애 또는 신장 및 심혈관 수술 중 급성 신장 손상에 기여합니다. 이러한 맥락에서 억제의 잠재적 치료 가치는저산소증/COX 중재를 통한 /재산소화 유도 근위 세뇨관 세포 사멸-2(시클로옥시게나제)/iPGE,/iEP 수용체 경로가 분명합니다. 따라서 우리는 iPGE가 구체적으로 매개하는지 여부를 물었습니다.저산소증- 유도된 세포 사멸 또는 매개저산소증/재산소화 유도된 세포 사멸(생체내 신장 허혈/재관류 손상을 모방하는 시험관내 모델). 그림 2f에서 볼 수 있듯이 COX-2에 의해 세포 사멸(트리판 블루 다이브 배제 테스트로 평가)이 방지되었습니다.(시클로옥시게나제)억제제 셀레콕시브 뿐만 아니라 EP 수용체 길항제 AH6809 또는 GW627368X. 그림 2a와 마찬가지로 이러한 결과는 COX-2가저산소증/재산소화로 인한 세포 사멸, 더 구체적으로 말하면 세포 사멸은 COX에 의해 매개됩니다-2(시클로옥시게나제)- PGE의 의존적 생산은 EP 수용체의 길항작용에 의해 방지되기 때문입니다. 그러나 PGT 억제제 bromocresol green 또는 bro-mosulfophthalein에 의해 세포 사멸이 예방되지 않았기 때문에 (그림 2f 및 보충 그림 2d)저산소증/reoxygenation-induced HK{1}} 세포 사멸은 세포외 PGE에 의해서만 매개됩니다.

COX의 HIF{0}의존적 전사 조절-2(시클로옥시게나제)유전자 발현에 기여저산소증-근위 세뇨관 HK{1}} 세포에서 iPGE의 유도 증가. PGE, 생합성은 포스포리파제 A에 의해 아라키돈산의 막 글리세로인지질로부터 방출된 후, 아라키돈산의 COX 동종효소에 의해 프로스타글란딘 H로 전환되고, 마지막으로 H의 프로스타샘이 프로스타글란딘 E 합성 효소에 의해 PGE로 이성질체화되는 것을 포함합니다. 마이크로솜 PGE 합성효소-1(mPGES-1)19와 같은 것입니다. 우리는 그것을 발견했습니다저산소증-HK-2 세포에서 유도된 세포자멸사는 COX{2}}에 의해 매개될 가능성이 가장 높습니다.(시클로옥시게나제)-PGE 생산의 의존적 증가(그림 2). COX-2를 감안할 때(시클로옥시게나제)에 의해 발현이 유도될 수 있는 효소이다.저산소증, 우리는 다음과 같이 가정했습니다.저산소증-유도된 PGE 증가, HK-2 세포의 생산은 COX-2 발현 증가의 결과일 수 있습니다.(시클로옥시게나제). 우리의 가설을 확인하기 위해, 우리는 (i)저산소증COX-2의 표현에 대해(시클로옥시게나제)단백질 및 mRNA 및 (ii) COX{0}}의 효과(시클로옥시게나제)억제제 셀레콕시브저산소증-iPGE의 유도 증가, 우리의 결과는저산소증COX의 전사 상향 조절이 일시적인 방식으로 결정됨-2(시클로옥시게나제)식(그림 3a,b)과 COX-2(시클로옥시게나제)억제는 HK{0}} 세포에서 iPGE의 증가를 둔화시켰습니다.저산소증(그림 3c). 재미있게,저산소증또한 mPGES-1 단백질 발현의 일시적인 상향 조절을 결정했지만(그림 3a, 삽입) mPGES-1 mRNA 발현에는 영향을 미치지 않았습니다(그림 3b. 삽입). 이러한 결과는 COX-2의 발현 증가가(시클로옥시게나제)mPGES-1는저산소증- 유도된 iPGE의 증가.

그림 3. COX-2의 HIF-1a 의존적 전사 조절(시클로옥시게나제)유전자 발현은 근위 세뇨관 HK{1}} 세포에서 iPGE의 저산소증 유발 증가에 기여합니다.(a) COX의 표현-2(시클로옥시게나제)단백질은 일시적으로 증가합니다.저산소증(웨스턴 블롯 분석). 삽입: 발현 mPGES-1 단백질은 또한 일시적으로 다음에 의해 상향 조절됩니다.저산소증. (b)식 COX-2(시클로옥시게나제)mRNA는 일시적으로 다음과 같이 증가합니다.저산소증. 삽입: mPGES{0}} mRNA의 발현은 영향을 받지 않습니다.저산소증. (c) COX-2인 celecoxib에 의한 예방(시클로옥시게나제)iPGE 증가 억제,저산소증. 세포를 3μM 셀레콕시브와 함께 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 왼쪽∶PGE, 의존성 면역형광 단독 또는 DAPI를 사용한 핵 염색과 병합이 표시됩니다(원래 배율, 40배). 오른쪽: Image J 소프트웨어를 사용하여 왼쪽 패널에 표시된 이미지에 대한 정량적 접근. (d) 전사 메커니즘의 기여. 왼쪽: 전사 억제제 악티노마이신 D(Act. D)가 예방저산소증- COX의 유도 증가-2(시클로옥시게나제)단백질 발현(웨스턴 블롯 분석). 세포를 1 ug/ml Act로 1시간 동안 전처리하였다. D에 노출되기 전에저산소증3시간 동안.오른쪽: COX의 활동 증가-2(시클로옥시게나제)기자 구성. (e) HIF-1a YC-1의 억제제는저산소증-유도 전사 COX-2(시클로옥시게나제)상향 규제. 세포를 0.5 uM YC-1와 함께 1시간 동안 사전 인큐베이션했습니다. 왼쪽: COX 예방-2(시클로옥시게나제)상향 규제. 세포가 노출되었다저산소증8시간 동안 중앙: COX의 활성 증가 방지-2(시클로옥시게나제)기자 구성. 오른쪽: HRE 기반 리포터 구성의 활동 억제. 세포가 노출되었다저산소증8시간 동안.(f) HIF-1a 억제제 YC-1는 아폽토시스 세포 사멸을 증가시킵니다(유세포 분석 연구). 노출되기 전에저산소증, 세포를 0.5μM YC-1와 함께 1시간 동안 사전 인큐베이션했습니다. 삽입∶ YC-1 억제저산소증- HIF{1}} 발현의 유도 증가(웨스턴 블롯 분석). 일반 정보:(1) "방법"에 표시된 대로 세포를 정상산소(21% O) 또는 저산소(1% O) 조건에서 24시간 동안 배양했습니다. (2)현미경 사진은 세 가지 독립적인 실험의 대표적인 예입니다. (3) 웨스턴 블롯 분석: 항{8}}액틴 항체로 프로빙하여 동일한 단백질을 확인했습니다. (4) 그래프의 막대 및 오차 막대: 각 막대는 3가지 다른 실험의 평균±SEM을 나타냅니다. *P<0.01 vs.="" other="">

COX 증가에 대한 전사 메커니즘의 기여도를 더 조사하려면{0}}(시클로옥시게나제)아래의 단백질 발현저산소증, COX-2의 표현(시클로옥시게나제)HK{0}} 세포에서 평가되었으며, 이는 전사 억제제인 ​​악티노마이신 D와 함께 사전 배양된 후 처리되었습니다.저산소증5시간 동안 도 3d에 도시된 바와 같이,저산소증- COX의 유도 증가-2(시클로옥시게나제)단백질 발현은 악티노마이신 D에 의해 방지되었습니다. 또한,저산소증또한 COX{0}} 활동의 증가를 확인했습니다.(시클로옥시게나제)HK{0}} 세포에서 이전에 형질감염된 프로모터 구성체(그림 3d 오른쪽). 종합하면 그림 3d에 표시된 결과는 전사 메커니즘이저산소증- COX의 유도 증가-2(시클로옥시게나제)단백질 발현. 그럼에도 불구하고 COX{0}} 프로모터가 활성화되는 시점과 최대 COX{1}}(시클로옥시게나제)mRNA 발현: COX{0}}의 일시적인 증가(시클로옥시게나제)mRNA 발현은 2시간 후에 최대였으며(그림 3b), COX-2 프로모터는 3시간 후에 활성화되었으며(그림 3d), 이는 아마도 COX{{6 }}(시클로옥시게나제)표현4. 따라서 COX-2(시클로옥시게나제)mRNA는 아래에서 안정화됩니다저산소증, COX 수준이 증가합니다-2(시클로옥시게나제)(그 순간) COX의 활성 증가에 기여하지 않는 mRNA 발현-2(시클로옥시게나제)발기인. 그러나 프로모터 활성화와 측정 가능한 기질 축적 사이의 시간 지연이 COX{0}} 프로모터 활성화 시기와 최대 COX{1 }}(시클로옥시게나제)mRNA 발현.

HIF-1는 산소 의존성 -서브유닛과 구성적으로 발현되는 -서브유닛으로 구성된 이종이량체 전사 인자입니다. 아래에저산소증, HIF-1은 축적되어 핵으로 들어가고, 여기서 HIF-1로 이량체화한 후 전사 인자 HIF-1를 생성합니다. HIF-1는 다음과 결합하여 표적 유전자의 발현을 촉진합니다.저산소증-반응성 요소(HRE)는 규제 영역에 존재하고 이후에 전투를 위해 세포 적응 반응을 오케스트레이션합니다.저산소증 3. 을 고려하면저산소증COX를 활성화할 수 있음-2(시클로옥시게나제)COX{1}} 프로모터 서열2에 존재하는 기능적 HRE를 통해 HIF{0}}의존적 방식으로 발현하기 위해, 우리는 a에서 HIF-1의 역할을 조사했습니다.저산소증- COX의 유도 증가-2(시클로옥시게나제)표현. 또한 HK-2 세포에 형질감염된 COX{0}} 프로모터 구성체의 활성도 살펴보았습니다. 그림 3e에서 볼 수 있듯이, HIF-1억제제 YC-1와 함께 사전 인큐베이션하면저산소증- HRE 리포터 구조의 HIF-1a 발현 및 활성 증가 유도, COX 발현 증가 방지-2(시클로옥시게나제)COX의 활동-2(시클로옥시게나제)HK{0}}의 프로모터 구성저산소증. 요약하면, 결과는 그림 3a-e에 나와 있습니다. HIF{2}}COX-2의 HIF{2}}의존적 전사 상향 조절(시클로옥시게나제)에 대한 책임이 있습니다저산소증- 유도된 iPGE2의 증가.

HIF{0}} 활성화의 결과는저산소증-유도된 아폽토시스는 논란의 여지가 있지만(아마도 상황에 따라 달라질 수 있기 때문에), 우리는 실험 시스템에서 HIF{2}}의 역할을 (예비적인 방식으로) 분석했습니다. 이전에 COX-2에 대한 개입을 발견했기 때문에(시클로옥시게나제)/iPGE, EP 수용체 경로는저산소증8,56 우리는 HIF-1a의 억제가저산소증-유도된 HK{1}} 세포 사멸. 도 3f에 나타난 바와 같이, HIF-1 억제제인 ​​YC-1와의 사전 배양은 실제로 증가하였다.저산소증-유도된 아폽토시스. 따라서 HlF-la가

논의

조직저산소증PTC는 신장 세뇨관에서저산소증. 여기에서 우리는 피해에 대한 PGE의 역할을 조사했습니다.저산소증인간 PTC에 대한 iPGE 생산 증가는 COX의 HIF-la 의존적 상향 조절에서 비롯됨을 발견했습니다-2(시클로옥시게나제)유전자 발현 및 mPGES{0}}의 증가된 발현,저산소증-HK{1}} 세포에서 세포자멸사 유도. 세뇨관 저산소증이 급성 및 만성 신장 질환 모두에 관련된 요인이라는 점을 감안할 때{2}}, 이러한 결과는 프로스타글란딘 수송체 PGT를 신장 질환의 새로운 치료 표적으로 지적합니다.

저산소증iPGE를 증가시킬 뿐만 아니라 세포외 배지로의 방출을 증가시켜 분비된 (세포외)PGE도 다음과 같은 역할을 할 수 있습니다.저산소증-유도된 아폽토시스(예를 들어, 세포막에 위치한 EP 수용체의 정식 활성화를 통해 아폽토시스 캐스케이드를 유발함). 이전의 두 연구에서는저산소증COX도 원인이었습니다-2(시클로옥시게나제)-PGE,1345의 의존적 생산. 반면에 특정 세포 유형(섬유아세포, 미세아교세포, 뉴런 및 급성 림프모구성 백혈병 세포주)에서 PGE 유도 세포자멸사는 EP 수용체의 PGE 의존적 활성화에 의해 매개됩니다46-48. 우리는 여기서 발견했습니다저산소증- 유도된 HK{1}} 세포 사멸은 EP 수용체의 길항 작용에 의해 방지되었습니다(그림 2a, 상단 패널, 오른쪽). 그러나 EP 수용체는 고전적으로 원형질막 수용체로 기술되어 있으므로 iPGE에서는 접근할 수 없습니다.{3}}저산소 HK{4}} 세포에서 iPGE의 세포자멸사 효과를 매개하는 EP 수용체는 세포 내에 위치한 부분집합(즉, iEP 수용체).

iPGE2의 역할과 달리저산소증-HK{1}} 세포에서 유도된 세포자멸사, 우리는 세포외 PGE만이 매개한다는 것을 발견했습니다.저산소증/reoxygenation-induced HK-2 세포 사멸은 PGT 억제제에 의해 예방되지 않았기 때문입니다(그림 2f). 이후에 세포 손상의 병리학적 메커니즘이저산소증/재산소화가 완전히 이해되지는 않았지만, 세포 사멸은 주로 과도한 활성 산소 종(ROS)의 생성을 통해 발생한다고 인정됩니다. 이는 특히 HK{0}} cell49,50에 해당됩니다. 그러나 비록 ~ 일지라도저산소증우리가 아는 한 ROS가 다음과 관련이 있다는 증거는 없습니다.저산소증-유도된 HK-2 세포 사멸. 이것은 HK-2 세포에서 저산소증과 저산소증/재산소화의 치명적인 영향이 다른 메커니즘에 의해 매개된다는 것을 암시하며, 이는 BG와 BS가저산소증그러나 반대하지 않는다저산소증/재산소화. 결과적으로, PGT의 억제는 PTC에서 저산소증으로 인한 세포 손상에 대한 치료적 이점을 제공할 수 있지만 다음의 해로운 영향에 대해서는 그렇지 않습니다.저산소증/재산소화.

COX의 HIF{0}}의존 상향 조절-2(시클로옥시게나제)에 대한 중요한 사건이었습니다.저산소증- 유도된 HK-2 세포 사멸(그림 3e). 그러나 HIF 억제제 YC{3}}가 apoptotic 세포 사멸을 향상시킨다는 우리의 관찰(그림 3f)은 이전 보고서에서 이미 유사한 결과를 보여주었지만 어리둥절합니다. 한 가지 가능한 설명은 HIF-la가 COX의 세포자멸사 상향 조절을 중재할 뿐만 아니라 가설 시나리오입니다.{10}}(시클로옥시게나제)뿐만 아니라 보호 분자의 상향 조절. 실제로, HIF는{1}}방어 분자의 발현을 조절합니다.저산소증long non-coding RNA DARS-AS1' 및 microRNA-2103와 같은 것은 HK{4}} 세포에서 특이적으로 발견되었습니다. 그러나 이러한 증거가 우리의 가상 시나리오를 뒷받침하지만 이를 확인하기 위해 특정 실험을 수행해야 합니다.

에 대한 신장 세포의 반응 조사저산소증신장 병리학에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 우리는 예비적인 방법으로 세포사멸 억제 단백질 Bcl{2}} 발현 비율에 대한 pro-apoptotic protein Bax 증가의 역할을 연구했습니다.저산소증-HK{1}} 세포에서 유도된 세포자멸사. 우리의 결과는 PGL의 억제가 Bcl-2과 Bax(그림 2e)의 발현 사이의 균형에서 항세포자멸사 변화와 양립할 수 있는 변화를 초래하지 않았으며, 이는 iPGE 의존성 HK-2 세포 사멸저산소증. 우리가 아는 한, PTC에서 저산소증으로 인한 세포자멸사에서 Bcl{0}}/Bax 축의 의미에 대한 연구는 두 가지뿐이며 두 연구 모두 무산소" 또는 거의 무산소 O, 농도5 . PTC가 0.2% O에 노출되었을 때 Bax 발현은 변하지 않았으며 apoptosis는 Bcl{5}} 발현 정도 감소와 관련이 있었습니다. 그러나 Bcl{6}}의 발현은 1% O에도 영향을 받지 않았습니다. 따라서 Bcl{8}} 또는 Bax 발현의 양적 변화를 반드시 포함하지 않는 다른 메커니즘을 고려해야 합니다. Bax와 미토콘드리아로의 전위를 유발하는 Bax와의 물리적 연관성202. 따라서 iPGE가 HK 세포 사멸에 기여하는 메커니즘은 추가 연구가 필요합니다.

우리 그룹은 COX{0}}(시클로옥시게나제)-iPGE의 의존적 증가, 시스플라틴에 노출된 HK{1}} 세포의 세포자멸사를 매개하는 세포사멸체7" 및저산소증(현재 결과). PGE는 크기가 조정된 후 빠르게 세포 외부로 방출되기 때문에 PG1에 의한 내부 수송은 HK-2 세포에서 iPGE 유도 세포자멸사에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 PTC 손상이 iPGE에 의해 매개될 때마다 PGT 억제제를 사용한 치료는 시스플라틴 유도 PTC 손상 예방, 세포자멸사를 통한 세뇨관 손상 전파 억제 또는 해로운 영향저산소증PTC에서.