Cistanche Phenylethanol Glycosides의 치료 효과와 Cyclophosphamide에 의한 쥐의 정자 생성 메커니즘
Mar 11, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4
[요약]
목적:치료 효과를 알아보기 위해시스탄체 페닐에타노이드 배당체사이클로포스파미드에 의해 유도된 정자 형성을 가진 생쥐에서 그 작용 기전을 미리 밝히기 위해.방법:추출하는 에탄올 추출법시스탄체 페닐에타노이드 배당체. 40마리의 BALB/C 마우스를 무작위로 대조군, 모델군, 저용량군으로 나누었다.시스탄체 페닐에타노이드 배당체그룹(50 mg·kg-1) 및 고용량 그룹(100 mg·kg-1)으로, 각 그룹에 10마리의 마우스가 있습니다. 대조군을 제외하고 다른 그룹의 마우스에 연속 5일 동안 매일 사이클로포스파미드(80 mg·kg-1)를 주사하여 정자형성 장애 마우스 모델을 준비했습니다. 마지막 투여 후 저용량 및 고용량 그룹의 마우스시스탄체 페닐에타노이드 배당체위관 영양법으로 해당 용량을 투여하고 대조군과 모델 그룹의 마우스에게 30일 동안 하루에 한 번 위관 영양법으로 동일한 부피의 생리 식염수를 제공했습니다. 마지막 위관 영양술 후 24시간 후에 마우스 고환 조직을 채취했습니다. 효소 결합 면역흡착 분석법을 사용하여 마우스 고환 조직 균질액에서 테스토스테론 수준을 결정했습니다. 각 그룹의 정자 밀도, 정자 운동성 및 정자 이상율을 비교하였다. HE 염색으로 고환 조직의 형태적 변화를 관찰하였다. 결과: 대조군과 비교하여 모델군의 정자 밀도와 정자 운동성 비율이 감소하였다(P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">시스탄체 페닐에타노이드 배당체크게 증가했습니다(P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">시스탄체 페닐에타노이드 배당체그룹이 크게 증가하고 층이 뚜렷하고 정자 생성 세포가 깔끔하고 단단하며 규칙적으로 배열되어 있으며 내강에서 정자를 볼 수 있습니다.결론: 시스탄체 페닐에타노이드 배당체쥐의 cyclophosphamide에 의한 정자 형성 장애에 상당한 치료 효과가 있으며 그 기전은 고환 조직의 테스토스테론 수치 개선과 관련이 있을 수 있습니다.
[키워드]시스탄체 페닐에타노이드 배당체; 시클로포스파미드; 정자 형성 장애; 마우스, BALB/C
사회리듬의 가속화, 나쁜 생활습관, 환경오염 등의 요인으로 정자부족증, 정자무력증 등 정자의 질이 비정상적으로 증가하여 남성 불임의 주요 원인이 되고 있다[1]. 현재 정자부족증과 정자무력증을 치료하는 약물이 적고 치료 효과가 명확하지 않습니다. 한약 처방이나 유효 성분은 남성의 생식 기능 개선에 좋은 효과가 있습니다[2-6]. 그러나 처방의약품의 종류가 다양하기 때문에 약리학적 효과와 유효성분의 관계가 명확하지 않아 정자형성의약품의 홍보 및 적용에 한계가 있다. 한약의 유효성분에 대한 연구 개발과 생식 손상에 대한 치료 효과에 대한 연구는 좋은 응용 가치가 있습니다.시스탄체 페닐에타노이드 배당체의 가장 중요한 활성 성분 중 하나입니다.시스탄체 데저티콜라. 그들은 일반적으로 에스테르 결합과 -글루코스를 핵으로 하는 옥소-글리코시드 결합을 포함하는 천연 배당체입니다. 쌍떡잎식물에서 널리 발견된다[7]. 연구[8]에 따르면시스탄체페닐에타노이드배당체시험관 내 산화 손상으로부터 쥐 정자를 보호할 수 있지만 정자 형성에 대한 보고는 없습니다. 이 실험은 사이클로포스파미드에 의해 유도된 정자 생성이 있는 생쥐의 정자 생성 기능에 대한 시스탄체 페닐에타노이드 배당체의 치료 효과를 연구하고시스탄체 페닐에타노이드 배당체정자 형성 장애의 치료.
1. 재료 및 방법
1.1. 실험 동물, 주요 시약 및 기기
6-8주령, 체중이 20-22g인 SPF 등급 성체 BALB/C 마우스 40마리를 Jilin University School of Basic Medicine의 동물 실험 센터에서 구입했으며 동물 증명서 번호 : SCXK(키르기스스탄) 2008-005. 실험 전 5일 동안 마우스를 적응적으로 사육하였다. 급이 조건: 22도 ~ 25도, 일주기 리듬(12h/12h), 무료 식수 및 음식. Cistanche는 Xinjiang Dakang Trading Company의 제품입니다. 주사용 사이클로포스파미드는 Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.(배치 번호 11061921)에서 구입했습니다. 고환 조직 균질화 테스토스테론 효소 결합 면역 분석 키트는 Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd.(배치 번호) 20120812)에서 구입했으며, 기타 시약은 모두 국내에서 생산된 분석 등급입니다. PLUS384 마이크로플레이트 리더(미국의 MDC), TE2000U 도립 현미경(Nikon, 일본) 및 J{15}XP 원심분리기(Nanodrop, 미국).
1.2 시스탄체 페닐에탄올 글루코사이드의 제조
10g의 시스탄체 분말을 70% 에탄올로 환류하여 매회 2시간씩 2회 추출하여 페네틸 알코올 배당체 농축물을 얻었다. 농축된 용액을 D101 거대다공성 수지 컬럼에서 크로마토그래피하고 70% 에탄올로 용출하여 Cistanche phenecoside 알코올을 얻었다. UV 분광 광도계는 333 nm의 파장에서 추출물을 식별했습니다.
1.3 동물 모델의 제작 및 약물 투여 방법
40마리의 수컷 BALB/C 마우스에게 5일 동안 적응식을 제공한 후, 마우스를 무작위로 4개의 그룹(각 그룹에 10마리의 마우스)으로 나누었습니다: 대조군, 모델 그룹, Cistanche시스탄체 페닐에타노이드 배당체저용량 그룹 및시스탄체 페닐에타노이드 배당체고용량 그룹. 대조군을 제외하고 나머지 3개의 마우스 그룹은 정자형성 장애 동물 모델을 준비하기 위해 연속 5일 동안 각 마우스에 대해 사이클로포스파미드 80 mg·kg-1을 복강 내 주사했습니다. 모델이 준비된 후 저용량 및 고용량 그룹의 마우스시스탄체페닐에타노이드 각각 50 및 100 mg·kg-1·d-1을 투여했습니다. 대조군과 모델군의 마우스에는 동일한 부피의 생리식염수가 제공되었습니다. 30일 동안 하루에 한 번. 모든 마우스는 마지막 약물 투여 후 24시간 후에 희생되었고 양측 시험이 수행되었다. 오른쪽 고환은 포름알데히드로 고정되었습니다. 부고환과 고환은 왼쪽에서 취했습니다. 고환을 균질화하고 3,{7}}분에 10분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 채취하여 테스트를 위해 -20도의 아이스박스에 보관했습니다. 왼쪽 부고환은 정자 밀도, 정자 운동성 및 변형률에 대해 테스트되었습니다.
1.4 정자 밀도, 정자 운동성 및 변형률의 측정
정자양액[9] 10mL를 넣은 시험관을 항온수욕에 넣고 37도로 예열한 후 한쪽 부고환을 채취하여 결합조직과 지방을 제거하고 조직을 절단하여 다음의 시험관에 넣는다. 37도에서 10분간 정자가 완전히 빠져나온 후 혈구 계수판에 1방울을 떨어뜨리고 세포 계수법에 따라 정자 밀도를 계산합니다. 결과는 밀리리터당 정자 수로 표시됩니다. 또한 시험관에서 정자현탁액 5μL와 동량의 eosin-Y를 잘 섞어 상온에 10분간 둔 후 커버글라스를 넣고 광학현미경으로 관찰한다. 죽은 정자는 분홍색으로 염색되고 살아있는 정자는 염색되지 않으며 세포질은 투명합니다. 각 표본은 정자 200개를 세어 정자 생존율을 계산하고 그 결과를 백분율로 표시하고 정자 생존율{10}}은 살아있는 정자 수/총 정자 수 × 100%입니다. 또 다른 5μL의 정자 현탁액을 메탄올에 5분 동안 고정하고 건조하고 2% 에오신 수용액으로 1시간 동안 염색하고 헹구고 불어 건조시켰다. 저배율 렌즈 아래 정자가 덜 겹치는 부분을 찾아 고배율 렌즈를 사용하여 정자의 형태를 순서대로 확인합니다. 각 마우스는 1개의 완전한 정자를{20}} 검사했습니다. 갈고리가 없는 정자 머리, 바나나 모양, 무정형, 뚱뚱한 머리 및 이중 머리를 기형으로 판단했습니다. 정자 기형률을 계산하고 그 결과를 백분율로 표시하였다. 정자 변형률= 기형 정자 수/총 정자 수 × 100% .
1.5 생식 호르몬의 결정
고환을 막을 벗겨 바이알 접시에 넣고 미리 냉각된 균질화 배지(0.01mol·L-1 자당, 0.01mol ·L-1 Tris- HCl, 0.1mmol·L{10}} EDTA-Na2 용액, pH 7.4), 안과용 가위로 고환 조직을 절단하여 유리 균질화 튜브에 붓고 4에서 원심분리합니다. 000×g를 저온에서 10분간 유지하고 상층액을 취하여 효소결합 면역흡착 분석 키트를 사용하여 고환 조직 균질액의 테스토스테론 수치를 측정하고 각 시료에 대해 3개의 평행 시료를 시험합니다. 키트의 지침에 따라 실험 단계 및 방법을 완료했습니다.
1.6 고환의 형태학적 관찰
HE로 염색된 마우스 고환의 파라핀 섹션을 취하고 광학 현미경으로 고환 조직에서 정자 및 정자 세포의 분포를 관찰합니다.
1.7 통계 분석
통계 분석은 SPSS17.{1}} 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 쥐의 정자 밀도, 정자 운동성 비율, 정자 변형률, 고환 테스토스테론 수치는 x±s로 표시하였고, 단일 요인 분산 분석으로 그룹 간 비교를 수행하였다.
2. 결과
2.1. 마우스의 각 그룹의 정자 밀도, 정자 운동성 및 정자 변형률
대조군과 비교하여 모델군의 정자 밀도와 정자 생존력은 감소하였다(P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">시스탄체 페녹시에탄올 배당체증가(P<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">
2.2 각 그룹의 생쥐의 고환 조직에서 테스토스테론 수치
대조군과 모델군의 고환 조직 균질액의 테스토스테론 수치는 (10.26±{6}}.57) 및 (5.33±0.84) nmol·L-1이었고, 각기. 모델 그룹의 테스토스테론 수치는 대조군보다 유의하게 낮았습니다(P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">시스탄체cistanche phenethyl glycoside 고용량 그룹은 저용량 그룹보다 유의하게 높았습니다(P<>
2.3 각 그룹의 마우스 고환의 형태
광학현미경으로 관찰한 바, 정상군의 고환은 정세관이 조밀하게 배열되어 있고, 생식세포의 수와 수준이 크며, 정소상피가 가지런히 배열되어 있고, 정자가 형성되어 있는 정세관이 모두 보였다. 모델군에서는 생쥐의 고환에 있는 정세관이 위축 및 퇴화되었으며, 정소상피가 현저히 얇아졌으며, 상피층 수가 감소하고, 배열이 무질서하고, 공동내 정자 수가 감소하였다. 모델군에 비해 저용량의시스탄체 페네틸 알코올 배당체.
그룹에서, 정세관의 상피층 수가 증가하고 상피의 배열이 더 규칙적이며 정세관의 손상이 분명히 개선되었습니다. 고용량에서 정세관의 구조시스탄체 페닐에타노이드 배당체그룹이 더 크게 개선되었고, 정낭 상피층의 수와 수가 크게 증가했습니다. 가지런히 배열되어 있고, 정세관에 성숙한 정자가 있고, 그 구조는 기본적으로는 정상으로 돌아간다. 그림 1(삽입 6)을 참조하십시오.
3 토론
Cyclophosphamide는 일반적으로 사용되는 항종양제 및 면역억제제로 주로 DNA의 알킬화를 통해 다양한 세포 내 생물학적 기능을 방해합니다. 생식 독성은 사이클로포스파미드[3]의 주요 부작용 중 하나이며, 이는 정자 DNA 손상 및 비정상적인 정자 발달로 쉽게 이어질 수 있습니다. 임상 연구[10-11]에 따르면 시클로포스파미드의 생식 독성이 무정자증 또는 정자 과잉증을 유발할 수 있음을 나타냅니다. , 불임 또는 자손의 유전적 결함 또는 기형의 발생으로 이어진다.
시스탄체 튜불로사라이덴과에 속하는 다년생 고등기생식물이다. 신장과 양에 영양을 공급하고 혈액에 영양을 공급하며 장에 영양을 공급하는 유명한 한약입니다. 남성 생식 기능 장애의 전통적인 치료에 일반적으로 사용되는 처방약입니다[12].페닐에타노이드 배당체의 가장 중요한 활성 구성 요소 중 하나입니다.시스탄체[13] 항산화, 항노화, 항종양과 같은 광범위한 약리학적 효과가 있다[14].
본 연구에서는 시클로포스파미드를 이용하여 정자형성장애 마우스 모델을 제작하였고, 시클로포스파미드에 의한 정자형성장애에 대한 Cistanche 페닐에타노이드 배당체의 치료 효과를 연구하였다. 그 결과 정상군에 비해 모델군의 정자밀도가 감소하고 생존율이 감소하며 기형률이 증가하는 것으로 나타났다. 모델 그룹과 비교하여 Cistanche phenoxyethanol 배당체의 모든 용량 그룹은 정자 밀도를 효과적으로 증가시키고 정자 운동성을 향상시키며 정자 변형률을 감소시킬 수 있습니다. 위의 결과는 cistanche phenoxyethanol 배당체가 정자 생성을 촉진하고 손상된 고환을 보호할 수 있음을 나타냅니다. 고환 형태의 결과는 치료 후시스탄체 페닐에타노이드 배당체, 모델 생쥐의 고환에서 정소상피의 수가 크게 증가하였고, 층이 뚜렷하고, 정자를 생성하는 세포가 가지런히, 조밀하게, 규칙적으로 배열되어 있고, 정자가 내강에서 관찰될 수 있음을 시사한다.시스탄체 페닐에타노이드Shanhe는 생식 손상 후 정낭 상피의 구조와 형태를 복원할 수 있습니다.
테스토스테론은 남성 생식 세포의 분화를 조절하며 고환의 정상적인 발달과 정자의 정상적인 발생에 필요한 조건입니다. 일부 연구[15]에서는 고환의 Sertoli 세포에 있는 안드로겐 수용체의 선택적 녹아웃이 정자 발달 장애와 남성 불임을 유발한다고 보고했습니다. 이 연구에서 cyclophosphamide는 정자 생성에 사용되었습니다.
장애물 손상 모델 후, 마우스의 고환 조직에서 테스토스테론 수치는 정상 그룹보다 유의하게 낮았습니다. Cistanche phenylethanoid glycosides 작용 후, 각 용량군에서 테스토스테론 수치가 증가하였고, 고용량군에서 저용량군보다 테스토스테론 수치가 유의하게 높았다. cistanche phenoxyethanol 배당체는 정자 생성 기능 장애를 치료하기 위해 고환 조직의 테스토스테론 수치를 증가시켜 정자 생성을 촉진 할 수 있다고 제안되지만 테스토스테론에 미치는 영향의 메커니즘은 더 많은 연구와 논의가 필요합니다.
테스토스테론은 남성 생식 세포의 분화를 조절하며 고환의 정상적인 발달과 정자의 정상적인 발생에 필요한 조건입니다. 일부 연구[15]에서는 고환의 Sertoli 세포에 있는 안드로겐 수용체의 선택적 녹아웃이 정자 발달 장애와 남성 불임을 유발한다고 보고했습니다. 이 연구에서 cyclophosphamide는 정자 생성에 사용되었습니다.
장애물 손상 모델 후, 마우스의 고환 조직에서 테스토스테론 수치는 정상 그룹보다 유의하게 낮았습니다. 의 조치 후시스탄체 페닐에타노이드 배당체, 각 용량군에서 테스토스테론 수치가 증가하였고, 고용량군에서 저용량군보다 테스토스테론 수치가 유의하게 높았다. cistanche phenoxyethanol 배당체는 정자 생성 기능 장애를 치료하기 위해 고환 조직의 테스토스테론 수치를 증가시켜 정자 생성을 촉진 할 수 있다고 제안되지만 테스토스테론에 미치는 영향의 메커니즘은 더 많은 연구와 논의가 필요합니다.
[참고문헌]
[1] Wang Yixin, Zheng Jufen. 남성 불임 연구의 새로운 진전 [J]. 중국 남성학 저널, 2006, 12(9): 771-774.
[2] Xie Jianxing, Wang Jun, Chen Ming 등. 과정자증이 있는 모델 쥐에 대한 Guilingji 캡슐의 효과. 정자 생산의 역할과 성 호르몬에 미치는 영향 [J]. 광저우 중의약학 저널, 2011, 28(6): 621-623.
[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao, et al. Epimedium total flavonoids는 cyclophosphamide의 최소화를 유발합니다. 쥐에서 태어난 정자 장벽의 보호 효과에 대한 연구 [J]. 중국 특허 의학, 2010, 32(12): 2052-2055.
[4] Xu Lei, Wang Rui, Zhang Weixing, et al. Cyclophosphamide에 의한 정자 손상에 대한 Shengjing 과립은 생쥐의 치료 효과를 방해합니다 [J]. 정저우 대학 저널: 의학 과학 판, 2008, 43(2): 267-270.
[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing, et al. 정자 형성 장애 쥐에 대한 한약의 Shengjing 과립 효과 치료 효과에 대한 실험적 연구 [J]. 중국 남성학 저널, 2008, 14(11): 1046-1049.
[6] Guo Kaihua, Gao Fulu, Niu Siyun, et al. Heshouwu 달인이 노화 된 쥐의 고환 조직에 미치는 영향 세포 Rb/p53 신호 전달 경로의 영향 [J]. 해부학 저널, 2010, 41(3): 435-439.
[7] Wu Haihong, Xuan Guodong, Liu Chunquan. Cistanche Phenylethanol Glucoside의 역류 추출 효과와 에탄올 인자 연구 [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2009(1): 250-251.
[8] Li Gang, Zhu Wenbin, Niu Fei, et al. 쥐 정자 연구에 대한 Cistanche Phenylethanol Glucoside의 효과 외부 산화 손상의 보호 효과 [J]. Lishizhen 전통 중국 의학 및 Materia Medica, 2010, 21(9): 2205-2207.
[9] Chen Deyu, Liu Limin, Xie Qingdong 등 정자 미토콘드리아 기능에 대한 항정액 항체 [J]의 영향. 산터우 대학 의과 대학 저널, 2008, 21(1): 4-6.
[10] KenneyLB, Laufer MR, Grant FD 등. 정보의 위험도가 높습니다. Highdoseccyclophamiddeforsarcomaduring 아동기 [J].Cancer, 2001, 91(3): 613-621.
[11] JahunkainenK, EhmckeJ, Houm, etal. 고환 기능 및 남성 암 환자의 비옥한 보존 [J]. BestPrect ResClinEndocrinol Metab, 2011, 25: 287-302.
[12] Gao Zhanyou, Zhou Haitao, Lin Qiang. 쥐의 운동 피로에 저항하는 Cistanche의 능력과 뇌 자유 라디칼의 영향 [J]. Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(16): 9592-9595.
[13] Ren Lu, Gu Xiaohong, Tang Jian, et al. Cistanche cistanche 추출 및 정제 연구 [D] 재배 시 페닐에탄올 배당체. Wuxi: Jiangnan University, 2006, 25(3): 33-36. [14] Jinghui, Zuo Jianfeng, Li Jiaoshe. 페녹시에탄올 배당체의 약리학적 연구 발전 [J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3): 440-441.
[15] ChangC, ChenYT, YehSD, et al. Infomedia 봄철 TheandrogenreceptorinSertolicells [J]. ProcNatlAcadSci USA, 2004, 101(18): 6876-6881.
