Cistanche Tubulosa 줄기의 총 배당체는 우울증과 유사한 행동을 완화합니다

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Li Fan, Ying Peng, Jingwen Wang, Ping Ma, Lijuan Zhao, Xiaobo Li *

요약

배경:가장 많이 사용하는 것으로신장양 해독 허브중국 전통 의학에서 Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT)의 말린 즙이 많은 줄기는 우울증 치료에 효과적인 것으로 나타났습니다. 그러나 항우울제 성분과 그 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다.

목적:우울증에 대한 CT의 활성 구성요소와 잠재적 메커니즘을 탐색합니다. 연구 설계 및 방법: 행동 절망 테스트를 사용하여 CT에서 분리된 다당류, 올리고당 및 다양한 배당체 농축 분획과 3-하이드록시페닐프로피온산(3- }}HPP) 및 히드록시티로솔(HT). 또한, 생체 활성 분획 및 대사 산물이 만성 예측할 수 없는 경도 스트레스(CUMS) 모델에 미치는 영향을 다중 약력학 및 생화학적 분석을 통해 조사했습니다. 결장 조직학 및 장 장벽의 변화는 염색 및 면역 조직 화학 분석을 통해 관찰되었습니다. 16S rRNA 시퀀싱 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 장내 미생물 특징 및 트립토판-키누레닌 대사를 각각 조사했습니다.

결과:총 배당체(TG)는 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축의 과활성화, 심한 신경 및 말초 염증에 대한 페닐에타노이드 및 이리도이드 배당체의 상승 효과를 반영하여, 다른 분리된 분획과 비교하여 우울증 유사 행동을 극적으로 완화시켰습니다. 및 해마에서 5-히드록시트립타민(5-HT) 및 뇌 유래 신경영양 인자의 결핍. 또한, TG는 결장 및 장 장벽 파괴의 저급 염증을 완화했으며, 여러 박테리아 속의 풍부함은 CUMS 래트의 HPA 축 및 염증과 높은 상관관계가 있었습니다. 일관되게, 결장에서 인돌아민 2, 3-디옥시게나제 1(IDO1)의 발현은 트립토판-키누레닌 대사의 억제와 함께 TG 투여 후 유의하게 감소했습니다. 한편, HT는 HPA 축 기능, 염증유발 사이토카인 방출, 트립토판-키누레닌 대사를 개선하여 현저한 항우울 효과를 발휘한 반면, TG와 같은 방식으로 무질서한 장내 미생물총을 크게 조절하지는 못했습니다. 놀랍게도, 플루옥세틴보다 우수한 TG 및 HT는 시상하부-뇌하수체-생식선 축의 기능 장애 및 비정상적인 순환 뉴클레오티드 대사를 추가로 개선할 수 있습니다.

시스탄체 살사 혜택더 할 수있다기능 장애 개선.

소개

우울증은 전 세계 인구의 최대 20%에 영향을 미치는 만성, 재발성 및 잠재적으로 생명을 위협하는 정신 장애입니다(Nabavi et al., 2017). 현재 많은 항우울제가 승인되었지만 부작용이 우려됩니다. 특히, 우울증에 대한 주요 약리학적 제제인 플루옥세틴과 같은 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI)로 장기간 치료하면 만성 성기능 장애와 같은 문제가 악화됩니다(Bijlsma et al., 2014). 이것은 천연 허브에서 새로운 항우울제의 발견에 대한 관심을 증가시켰습니다(Wang et al., 2019). 한의학(TCM) 이론에서 신장양 결핍은 우울감, 흥미 상실, 감상과 같은 우울증의 임상 증상과 유사한 수행 특징을 초래하여 사고를 촉진합니다(Yang et al., 2020). 신장양을 강화하여 우울증과 같은 행동을 완화합니다. 공교롭게도 많은 신장-양 강화 허브는 성기능을 향상시키는 이점이 있습니다(Wu et al., 2015). 이러한 연구를 통해 우리는 항우울제 개발 측면에서 TCM에서 가장 자주 사용되는 신장-양 강화 허브이며 남성 성기능 장애(Wang et al., 2020) 치료에 효과적인 Cistanches Herba의 잠재적 적용에 주의를 기울입니다. 중국 약전(Wang et al., 2017)에 Cistanche tubulosa(Schrenk) Wight(CT) 및 Cistanche Deserticola(YC Ma)의 건조 즙이 많은 줄기로 공식 기록된 Cistanches Herba는 중국 및 기타 동아시아 국가에서 사용되었습니다. 15세기부터 신장양 결핍, 발기 부전, 여성 불임과 같은 상태를 치료하기 위해 사용되었습니다. 현대 약리학 연구에 따르면 Cistanches Herba는 면역 강화, 신경 보호, 항산화, 노화 방지 및 항피로 효과와 같은 다양한 생체 활성을 가지고 있습니다(Wang et al., 2017). Cistanches Herba의 신경 보호 특성은 뇌졸중, 우울증, 알츠하이머병과 같은 인지 관련 질병에서 치료 가능성을 시사합니다(Wang et al., 2020). 이전 연구에서 우리는 CT 추출물이 만성 예측할 수 없는 경도 스트레스(CUMS) 쥐의 우울증과 유사한 행동을 완화한다는 것을 발견했습니다(Li et al., 2018). 현재까지 CT의 화학적 분석은 페닐에타노이드 배당체, 이리도이드 배당체, 다당류 및 올리고당류를 주성분으로 하는 것으로 나타났으나(Jiang and Tu, 2009), 항우울제 효과에 지배적인 역할을 하는 화합물의 유형은 불분명하게 남아 있습니다.

수많은 연구에서 장의 생리학적 작용(특히 공생 미생물군)이 우울증 발병에 중요한 역할을 하고 신경내분비계, 자율신경계 및 면역계를 조절할 수 있음이 확인되었습니다(Yang et al., 2020). 또한, 트립토판 대사, 장내 미생물 및 우울증을 연결하는 관계가 점차 많은 관심을 끌었습니다. 변경된 장내 미생물총은 트립토판-키누레닌 경로를 활성화하여 결과적으로 말초 및 뇌 트립토판 가용성을 감소시켜 5-HT 결핍을 초래할 수 있습니다(Agus et al., 2018). 우리의 이전 연구는 CT의 페닐에타노이드 배당체가 일반적으로 낮은 생체이용률을 나타내며 장내 미생물에 의해 3-하이드록시-페닐 프로피온산(3-HPP) 및 하이드록시타이로솔(HT)로 빠르게 대사될 수 있음을 보여주었습니다(Li et 알., 2016). 또한, CT 추출물은 CUMS 쥐의 장내 미생물 항상성을 회복시키는 것으로 보고되었습니다(Li et al., 2018). 이러한 연구를 바탕으로 우리는 식물 화학 물질과 장내 미생물군의 양방향 상호 작용이 CT의 특정 생리 활성 성분의 항우울 효과를 지배할 수 있다고 추론했습니다. 구체적으로, 화합물은 장내 미생물에 의해 위장관에서 흡수성 대사 산물(예: 3-HPP 및 HT)로 변형되어 항우울제 효과를 나타낼 수 있습니다. 차례로, 생리 활성 성분으로 인한 장내 미생물군의 구조적 변화는 동시에 항우울제 활성에 중요한 역할을 할 수 있습니다.

재료 및 방법

재료

화학 분석에 사용된 모든 표준은 Durst(중국 쓰촨)에서 구입했습니다. 3-HPP, HT, 플루옥세틴 ​​및 이미프라민은 Aladdin(중국 상하이)에서 구입했습니다. BCA 단백질 정량 키트는 Boster(중국 우한)에서 구입했습니다. Nanjing Jiancheng(중국 난징)는 5-HT, BDNF, 종양 괴사 인자-알파(TNF-), 인터루킨-1베타(IL-1) 및 인터페론-감마(IFN- ) 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트. 코르티코스테론(CORT), 부신피질 자극 호르몬(ACTH) 및 코르티코트로핀 방출 호르몬(CRH) ELISA 키트는 Multi Sciences(중국 항저우)에서 구입했습니다. 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP), 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP), 테스토스테론(T) 및 성선자극호르몬 방출 호르몬(GnRH) ELISA 키트는 Enzyme-linked Biotechnology(중국 상하이)에서 구입했습니다. 트립토판 및 키누레닌 ELISA 키트는 Small Molecule Antibodies(Bordeaux, France)에서 구입했습니다. zonula occludens 1(ZO{13}}), indoleamine 2, 3-dioxygenase 1(IDO1), -actin 및 HRP 염소 항토끼 IgG(H + L)를 포함한 1차/2차 항체는 Proteintech에서 구입했습니다. (중국 우한). 분석 등급 이상의 다른 모든 시약은 상업적 공급업체로부터 입수했습니다.

시스탄체 추출물 보충제

CTE에서 분리된 다른 분획의 준비

CT는 2015년 11월 중국 신장 허톈에서 수집되었으며 Xiaobo Li 교수가 인증했습니다. 상품권 견본(20151108)은 상해교통대학교 약학대학에 기탁되었습니다.

파쇄된 시료를 80~90℃에서 2시간 동안 증류수(1:10, w/v)로 3회 추출하여 CTE를 얻었다(수율 57.1%). CTE를 증류수에 녹인 다음 에탄올(1:4, v/v)로 천천히 교반하고 4℃에서 24시간 동안 두었다. 그 후, 4000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 침전물과 상등액을 수집하였다. 총 다당류(TP; 수율 5.7%)는 80% 에탄올로 세척하고, 수집된 침전물을 Sevage 시약으로 3회 탈단백질하여 얻었다. 나머지 상층액을 D101 미세다공성 수지 컬럼으로 크로마토그래피하고 증류수 및 40% 에탄올로 용리했습니다. 용출된 물 및 40% 에탄올 분획은 각각 총 올리고당(TO; 수율: 35.1%) 및 총 배당체(TG; 수율: 12.1%)를 함유했습니다. TG를 다시 D101 미세다공성 수지를 통해 증류수와 5%, 10%, 40% 에탄올로 용출시켰고, 용출된 5%, 40% 에탄올 분획은 총 이리도이드 배당체(TG-IrG, 수율 2.7%)였다. 및 총 페닐에타노이드 배당체(TG-PhG; 수율은 각각 8.7%)였다.

화학 분석

먼저, CTE에서 분리된 여러 분획의 주요 화학 성분을 UPLC-QTOF-MS로 특성화했습니다. 둘째, 총 탄수화물과 배당체의 상대적 함량은 UV-Vis 방법으로 측정하였다. 셋째, 주요 성분(echinacoside, verbascoside, isoverbascoside, 8-epiloganic acid, geniposidic acid)을 검증된 HPLC 방법으로 정량화했습니다. 자세한 매개변수 및 방법 검증은 보충 자료에 나와 있습니다.

그림 1. 동물 실험 흐름도

표 1 피험자 및 각 그룹의 마우스 또는 래트에 대한 투여량.

동물 실험

특정 동물 실험 일정은 그림 1에 나와 있습니다. 모든 실험 동물은 실험 1주일 전에 제어된 실내 온도(25 ± 2 ◦C, 55 ± 10% 상대 습도), 12:12 시간 명암 주기. 이 연구는 SJTU의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 시설 및 프로토콜은 SJTU의 동물 윤리 위원회(No. A2019008)의 승인을 받았습니다.

150마리의 수컷 ICR 마우스(18-20g, 6주령)를 Shanghai Slack Biotechnology Company(중국 상하이)에서 구입하여 무작위로 10개 그룹(n=15/그룹)으로 나누었습니다. 각 그룹의 행동 절망 마우스에 대한 대상 및 용량은 표 1에 나와 있습니다. CTE의 용량 및 분리된 분획은 다음 공식에 의해 계산되었습니다. 용량=4.55 g/kg.d.bw × 수율, 이는 체표면적을 기반으로 한 세 가지 인간 등가선량 계산에 따라 결정되었습니다. 양성 약물인 이미프라민과 장내 미생물 대사산물(3-HPP 및 HT)의 용량은 이전 연구에 따라 설정되었습니다(Gupte et al., 2016; Pablos et al., 2019). 7일 동안 1일 1회 위내 투여한 후, 8일, 9일, 10일에 개방 필드 테스트(OFT), 꼬리 서스펜션 테스트(TST) 및 강제 수영 테스트(FST)를 수행하였다. 행동 테스트의 특정 방법은 보충 자료에 설명되어 있습니다.

72마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐(160-180g, 6주령)를 Shanghai Slack Laboratory Animal Company(중국 상하이)에서 구입했습니다. 공식 실험에 앞서 모든 쥐는 해당 훈련 후 자당 선호도 테스트(SPT)를 받았습니다. 쥐를 자당 선호도에 따라 8개 그룹(n=9/그룹)으로 나누었습니다(보충 그림 S1). 각 그룹의 쥐에 대한 피험자와 투여량은 표 1과 같다. 투여량은 행동 절망 쥐의 유효 투여량을 기준으로 쥐와 쥐의 환산계수에 따라 설정하였다. 그리고 양성 대조군 약물인 플루옥세틴의 용량은 이전 연구와 일치했습니다(Hou et al., 2017). 대조군을 제외한 모든 그룹은 일련의 만성 예측할 수 없는 경도 스트레스(CUMS)를 받았습니다. 스트레스 요인은 4주 동안 지속적으로 무작위로 적용되었습니다(자세한 내용은 보충 표 S1 참조). 음식과 물은 행동 테스트를 제외하고 다른 방에서 방해받지 않고 남아있는 대조군 쥐에게 자유롭게 제공되었습니다. 피험자들은 4주 동안 CUMS 시술 1시간 전에 위내 투여되었습니다. 28일의 지속적인 스트레스 요인과 약물 투여 후 OFT, SPT 및 FST는 각각 29일, 31일 및 33일에 수행되었습니다. 행동 실험의 구체적인 방법은 보충 자료에 나와 있습니다.

표 2 각 분획에서 echinacoside, verbascoside, isoverbascoside, 8-epiloganic acid 및 geniposidic acid의 함량.

시료 채취 및 생화학적 분석

행동 검사 후 공복 상태의 쥐를 펜토바르비탈 나트륨으로 마취하고 전혈을 채취하여 혈청 샘플을 얻었다. 식염수로 심장 관류 후 해마, 결장 및 맹장 내용물을 수집하여 -80 ◦C에 보관했습니다. 원위 결장 분절을 제거하고 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 혈청 내 CORT, CRH, ACTH, TNF-, IL-1, IFN-, cAMP, cGMP, T, GnRH, 트립토판 및 키누레닌, 5-HT, BDNF 및 TNF-의 수준 해마에서, 그리고 결장에서 TNF- 및 IFN-은 해당 ELISA 키트와 함께 제공된 지침에 따라 측정되었습니다.

조직학, 면역조직화학 및 웨스턴 블롯팅 분석

Hematoxylin and eosin(H&E) 및 Alcian blue-periodic acid-Schiff(AB-PAS) 염색을 사용하여 결장 조직의 병리학적 변화를 관찰했습니다. 또한 결장 상피 세포에서 ZO{3}} 단백질 발현을 관찰하기 위해 이 섹션의 면역조직화학 평가를 수행했습니다(Ding et al., 2020). 결장 및 해마에서 IDO1 단백질 발현을 결정하기 위한 샘플 준비 및 웨스턴 블로팅 분석에 대한 세부 정보는 보충 자료에도 설명되어 있습니다.

장내 미생물의 조성 프로파일 분석

16S rRNA 고처리량 시퀀싱은 MajorBio Co., Ltd.(중국 상하이)에서 수행했으며 자세한 방법 및 데이터 처리는 보충 자료에 나와 있습니다.

통계 분석

데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시됩니다. SPSS 20.0 소프트웨어를 사용하여 여러 그룹을 비교하기 위해 일원 분산 분석(ANOVA)이 사용되었습니다. 차이는 p < 0.05에서="" 유의미한="" 것으로="" 간주되었습니다.="" 히트맵="" 분석을="" 기반으로="" 하는="" spearman="" 상관="" 계수를="" 사용하여="" 장내="" 미생물과="" 특정="" 우울증="" 관련="" 생리학적="" 요인="" 간의="" 상관="" 관계를="">

결과

CTE에서 분리된 다양한 분획의 화학적 분석

주요 구성 요소는 UPLC-QTOF-MS(보충 표 S2 및 그림 S2)를 사용하여 특성화되었으며 CTE, TG 및 TG-의 페닐에타노이드 배당체 구성 요소 16개, 페놀 배당체 구성 요소 2개를 포함하여 총 21개 구성 요소가 확인되었습니다. 박사; 및 CTE, TG 및 TG-IrG에서 이리도이드 배당체의 3가지 구성성분. 전체적으로 총탄수화물의 TP와 TO의 상대적 함량은 각각 60.3%와 80.8%였다. TG의 총 배당체의 상대적 함량은 87.7%였다. 상응하게, 페닐에타노이드 및 이리도이드 배당체는 각각 TG-PhG 및 TG-IrG의 86.7% 및 53.4%를 차지했습니다. 각 분획의 echinacoside, verbascoside, isoverbascoside, 8-epiloganic acid 및 geniposidic acid의 함량은 표 2에 표시되어 있으며 HPLC 크로마토그램 및 방법 검증 데이터는 보충 표 S3 및 그림 S3에 나와 있습니다.

그림 2. 마우스에서 FST, TST, OFT에 대한 장내 미생물총에 의한 CTE 및 전형적인 대사산물로부터 분리된 상이한 분획의 효과.

마우스의 행동 절망 테스트에 대한 장내 미생물총에 의한 CTE 및 전형적인 대사 산물에서 분리된 다양한 분획의 효과

도 2에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 이미프라민(양성 대조군) 투여 7일을 받은 마우스는 FST와 TST 모두에서 부동 시간의 유의한 감소를 보였고 OFT의 총 이동 거리에는 유의한 영향을 나타내지 않았다. . 유사한 변화가 CTE, TG 및 HT 그룹에서도 관찰되었으며, 이는 CTE, TG 및 HT가 항우울제 활성을 나타내었고 그 효과는 흥분성과 관련이 없음을 나타냅니다. 따라서, TG 및 HT는 각각 장내 미생물총에 의해 CTE 및 전형적인 대사산물로부터 분리된 주요 생리활성 분획이었다. 흥미롭게도, TG-PhG 및 TG-IrG 투여 후 FST에서 부동 시간의 유의한 변화는 대조군과 비교하거나 TG-PhG 투여 후 TST에서 나타나지 않았으며, 이는 페닐에타노이드 및 이리도이드 배당체가 존재할 수 있음을 나타냅니다. CTE의 항우울제 활동에 필수적입니다.

표 3 CUMS 쥐의 FST, SPT 및 OFT에 대한 다양한 배당체 농축 분획 및 HT의 효과.

CUMS 쥐에 대한 다양한 배당체 농축 분획 및 HT의 약력학적 효과 및 생화학적 변화

표 3에서 볼 수 있듯이 28일 동안 CUMS 패러다임을 적용한 쥐는 SPT에서 자당 선호도, 총 이동 거리, 및 OFT에서 사육 수, 대조군과 비교하여 FST에서 총 부동 시간의 상당한 증가(p < 0.01),="" 이는="" cums="" 쥐에서="" 우울증="" 유사="" 표현형의="" 유도를="" 제안합니다.="" 우울="" 성과는="" flx(양성="" 대조군)="" 그룹에서="" 역전되었습니다.="" 유사하게,="" cte,="" tg,="" tg-phg,="" tg-irg="" 및="" ht="" 처리는="" cums="" 쥐의="" 자당="" 선호도를="" 정상="" 수준으로="" 회복시켰는데,="" 이는="" 102.7%,="" 94.1%,="" 89.8%,="" 91.9%="" 및="" 94.3%였습니다.="" 각각="" 제어합니다.="" 일관되게="" fst에서="" cte="" 및="" tg="" 그룹이="" 가장="" 뚜렷한="" 효과를="" 나타냈으며="" 부동="" 시간은="" 대조군의="" 각각="" 103.3%="" 및="" 93.4%에="" 도달한="" 반면="" tg-phg,="" tg-irg="" 및="" ht="" 그룹의="" 부동="" 시간은="" 대조군의="" 62.1%,="" 73.2%,="" 69.9%에="" 불과했습니다.="" cte,="" tg="" 및="" ht="" 투여="" 후="" oft에서="" 총="" 이동="" 거리="" 및="" 사육="" 수에서="" 유사한="" 유의한="" 증가(p="">< 0.05)가="" 관찰되었으며,="" tg-phg="" 및="" tg-irg="" 처리는="" cums="" 래트에서="" 사육="" 수를="" 수정하는="" 경향이="" 있었습니다.="" 결과는="" tg가="" cte로부터="" 분리된="" 지배적인="" 생리활성="" 항우울제="" 분획이며="" 페닐에타노이드="" 및="" 이리도이드="" 배당체가="" 항우울="" 효과를="" 발휘하는="" 데="" 필수="" 불가결한="" 것으로="" 나타났습니다.="" 또한,="" ht는="" 생체="" 내에서="" tg의="" 활성="" 대사="" 산물="" 중="" 하나로="">

일관되게, CUMS로 고통받는 것은 대조군에 비해 쥐의 혈청에서 CORT, CRF, ACTH, TNF-, IL{1}} 및 IFN- 및 해마에서 TNF-의 수준을 유의하게 증가시켰다(p< 0.05),="" resulting="" in="" significant="" reductions="" (p="" <="" 0.05)="" in="" the="" levels="" of="" hippocampal="" 5-ht="" and="" bdnf="" (fig.="" 3).="" except="" for="" a="" non-significant="" difference="" in="" the="" level="" of="" hippocampal="" bdnf="" between="" flx="" and="" cums="" groups,="" the="" above-mentioned="" alterations="" in="" cums="" rats="" could="" be="" significantly="" reversed="" (p="" <="" 0.05)="" after="" administration="" of="" fluoxetine,="" cte,="" tg,="" and="" ht,="" indicating="" that="" cte,="" tg,="" and="" ht="" showed="" ameliorative="" effects="" on="" the="" hyperactivation="" of="" hpa="" axis,="" severe="" peripheral="" and="" neural="" inflammation,="" and="" deficiencies="" in="" 5-ht="" and="" bdnf.="" likewise,="" tg-irg="" and="" tgphg="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" levels="" of="" serum="" cort,="" tnf-α,="" ifn-γ,="" and="" hippocampal="" tnf-α,="" and="" increased="" the="" level="" of="" hippocampal="" 5-ht="" in="" cums="" rats="" (p="" <="" 0.05).="" significant="" decreases="" (p="" <="" 0.05)="" in="" the="" levels="" of="" serum="" crf="" and="" acth="" were="" also="" observed="" in="" the="" tg-irg="" group="" compared="" with="" cums="" group.="" interestingly,="" the="" levels="" of="" serum="" cort,="" tnf-α,="" acth,="" and="" crf="" in="" tg-phg="" and="" tg-irg="" groups="" were="" significantly="" higher="" than="" those="" in="" the="" tg="" group="" (p="" <="" 0.05),="" and="" the="" levels="" of="" hippocampal="" 5-ht="" and="" bdnf="" exhibited="" the="" opposite="" expression="" pattern="" (p="" <="" 0.05).="" these="" results="" showed="" that="" the="" effects="" of="" tg-phg="" and="" tg-irg="" on="" the="" hyperactivity="" of="" the="" hpa="" axis,="" peripheral="" and="" neural="" inflammation="" and="" shortage="" of="" 5-ht="" were="" clearly="" inferior="" to="" tg,="" indicating="" that="" phenylethanoid="" and="" iridoid="" glycosides="" might="" exert="" synergistic="" effects="" on="" the="" above-mentioned="" multiple="">

TG와 HT는 CUMS 쥐에서 HPG 축과 순환 뉴클레오티드 대사를 조절합니다

CUMS를 시행한 혈청에서 T, GnRH, cAMP, cGMP의 농도와 cAMP와 cGMP의 비율(cAMP/cGMP)을 측정하여 그 결과를 표 4에 나타내었다. T, GnRH, cAMP, 및 혈청 내 cAMP/cGMP는 유의하게 감소되었고 cGMP의 수준은 대조군에 비해 CUMS 그룹에서 유의하게 증가했습니다(p < 0.05),="" 이는="" cums에="" 노출된="" 결과="" hpg="" 축="" 및="" 순환="" 뉴클레오티드="" 대사="" 기능="" 장애의="" 억제.="" cums="" 그룹과="" 비교하여="" flx="" 그룹에서는="" 유의한="" 변화가="" 없었습니다.="" 놀랍게도,="" tg="" 및="" ht="" 처리="" 후,="" 혈청="" t,="" gnrh,="" camp="" 및="" camp/cgmp="" 수준에서="" 유의한="" 증가(p="">< 0.05)를="" 나타낸="" 반면,="" 혈청="" cgmp="" 수준은="" 유의하게="" 감소하였다(p=""><{5}}.05).>< 0.05).="" 이러한="" 결과는="" tg와="" ht가="" hpg="" 축과="" 고리형="" 뉴클레오티드="" 대사를="" 조절했으며,="" 이는="" 양성="" 대조군인="" 플루옥세틴보다="" 뚜렷하게="" 우수함을="">

그림 3. 혈청 내 CORT, ACTH, CRF, TNF- , IL-1 , IFN- 및 5-HT, BDNF, TNF- 수준에 대한 다양한 배당체 농축 분획 및 HT의 효과 CUMS 쥐의 해마에서.

TG 및 HT는 CUMS 쥐의 결장 및 장 장벽 파괴의 저등급 염증을 완화합니다

결장 형태학적 손상을 평가하기 위해 H&E 염색을 사용하였으며, 실험군 간에 결장에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 4a). 또한 결장 염증 및 장 장벽 파괴에 대한 TG 및 HT의 영향도 분석되었습니다(그림 4b-d). 대조군에 비해 CUMS군에서 술잔세포의 수와 점액층의 두께가 감소하였다. 일관되게, ZO-1의 단백질 발현과 결장에서 IFN- 및 TNF-의 수준은 유의하게 감소(p < 0.05)="" 및="" 증가(p="">< {="" {13}}.{15}}5)="" 각각="" 명백한="" 조직학적="" 손상이="" 유도되지="" 않았지만="" cums에="" 노출된="" 경우="" 결장="" 및="" 장="" 장벽="" 파괴에="" 낮은="" 등급의="" 염증이="" 발생했음을="" 시사합니다.="" fluoxetine,="" tg,="" ht="" 처리="" 후="" 술잔="" 세포의="" 수와="" 점액층의="" 두께가="" 증가하였고="" 결장="" ifn-="" 및="" tnf-의="" 수치가="" 유의하게="" 감소하였다(p="">< 0.05).="" 또한,="" tg와="" ht는="" 대조군과="" 유사한="" 수준으로="" zo{17}}의="" 단백질="" 발현을="" 유의하게="" 증가(p="">< 0.05)했습니다.="" 이러한="" 결과는="" tg와="" ht가="" cums="" 쥐의="" 결장="" 및="" 장="" 장벽="" 파괴의="" 저급="" 염증을="" 완화할="" 수="" 있음을="">

표 4 CUMS 쥐의 혈청에서 HPG 축 관련 호르몬 및 뉴클레오티드 대사 관련 지표에 대한 TG, HT 또는 플루옥세틴의 효과.

장내 미생물 구성에 대한 TG 및 HT의 효과

정규화되지 않은 시퀀스를 제거한 후 총 1,874,721개의 유효 읽기를 얻었습니다. 알파 다양성(그림 5a)과 베타 다양성(그림 5b) 결과는 맹장 내용물에서 장내 미생물의 풍부함(Chao)과 다양성(Shannon)은 다르지 않았지만, 장내 미생물의 전체적인 구조는 주 좌표 분석(PCoA) 플롯은 대조군과 CUMS 그룹 간의 현저한 차이를 나타냅니다. 더욱이, TG 및 HT 처리는 CUMS 래트의 박테리아 풍부도를 유의하게 증가시켰고 CUMS 래트와 비교하여 PCoA 플롯에서 현저한 차이를 유도하여 특히 TG를 분석할 때 대조군과 분명한 유사성을 보였다.

미생물군의 분류학적 변화는 TG가 장내 미생물군 구성에 극적인 조절 효과를 발휘했음을 추가로 확인시켜 주었습니다. TG 투여 후, CUMS 쥐에서 대부분의 변형된 분류군의 풍부함은 대조군과 유사한 수준으로 역전되었다. 상당한 감소(14.2%, p < 0.05)="" 및="" 농축(53.6%,="">< 0.05)="" in="" the="" abundances="" of="" the="" phylum="" firmicutes="" and="" bacteroidetes="" were="" observed="" in="" the="" tg="" group="" compared="" with="" cums="" group="" (fig.="" 5c),="" respectively.="" consistently,="" at="" the="" family="" level="" (supplementary="" table="" s4),="" tg="" decreased="" the="" abundances="" of="" ruminococcaceae="" (phylum="" firmicutes)="" and="" peptococcaceae="" (phylum="" firmicutes)="" by="" 33.9%="" and="" 82.9%,="" respectively,="" compared="" with="" cums="" group="" (p="" <="" 0.05).="" conversely,="" significant="" enrichments="" in="" the="" abundances="" of="" family="" erysipelotrichaceae="" (phylum="" firmicutes,="" 78.4%,="" p="" <="" 0.05)="" and="" muribaculaceae="" (phylum="" bacteroidetes,="" 77.3%,="" p="" <="" 0.05)="" existed="" in="" tg="" group.="" consistently="" at="" the="" genus="" level="" (fig.="" 5d),="" the="" abundances="" of="" anaerotruncus,="" harryflintia,="" ruminiclostridium_9,="" unclassified_f_ruminococcaceae="" (members="" of="" the="" family="" ruminococcaceae),="" and="" peptococcus="" (a="" member="" of="" the="" family="" peptococcaceae)="" were="" significantly="" decreased="" while="" norank_f_erysipelotrichaceae,="" allobaculum,="" dubosiella="" (members="" of="" the="" family="" erysipelotrichaceae)="" and="" norank_f_muribaculaceae="" (a="" member="" of="" the="" family="" muribaculaceae)="" displayed="" higher="" abundances="" in="" tg="" group="" than="" those="" of="" cums="" group="" (p="">< 0.05).="" in="" addition,="" tg="" decreased="" the="" abundances="" of="" tyzzerella_3,="" acetatifactor,="" and="" norank_f_lachnospiraceae="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae="" (p="" <="" 0.05),="" although="" the="" abundance="" of="" the="" family="" lachnospiraceae="" was="" similar="" across="" all="" experimental="" groups.="" unlike="" tg,="" ht="" decreased="" the="" abundances="" of="" partially="" altered="" taxa="" induced="" by="" cums,="" including="" the="" family="" ruminococcaceae,="" 3="" genera="" (anaerotruncus,="" harryflintia,="" and="" ruminiclostridium_9)="" assigned="" to="" the="" family="" ruminococcaceae="" and="" 2="" genera="" (tyzzerella_3,="" acetatifactor)="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae.="" additionally,="" converse="" variations="" were="" observed="" in="" the="" abundances="" of="" ruminococcaceae_ucg_013="" and="" streptococcus="" in="" the="" ht="" group.="" these="" results="" indicated="" that="" tg="" and="" ht="" exerted="" clear="" differences="" in="" the="" regulation="" of="" gut="" microbiota="" composition,="" and="" the="" effect="" of="" tg="" was="" superior="" to="" that="" of="" tg="" especially="" in="" altering="" the="" genera="" assigned="" to="" the="" family="" erysipelotrichaceae,="" peptococcaceae,="" and="">

그림 4. CUMS 쥐의 결장에서 형태학적 변화, ZO{1}} 단백질 발현, IFN- 및 TNF- 농도에 대한 TG, HT 또는 플루옥세틴의 효과.

TG 및 HT, HPA 축 관련 호르몬, 전염증성 사이토카인, 5-HT 및 BDNF에 의해 영향을 받는 변형 미생물 속의 상관관계 분석

TG와 HT의 영향을 받는 장내 미생물 구성의 변화와 우울증 관련 특성 간의 연관성을 밝히기 위해 Spearman의 상관 분석을 수행했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 해마에서 5-HT와 BDNF의 수준은 norank_f_Muribaculaceae와 유의한 양의 상관관계만 있었습니다. 그렇지 않으면 변경된 미생물 속과 HPA 축 관련 호르몬 사이의 명확한 상관 관계를 확인할 수 있습니다. 특히, Dubosiella, norank_f_Muribaculaceae, norank_f_ Erysipelotrichacea, Peptococcus는 HPA 축 기능과 밀접한 관련이 있었습니다. 혈청 CORT, CRF 및 ACTH는 Dubosiella, norank{10}}f{11}Muribaculaceae 및 norank{12}}f{13}}Erysipelotrichacea와 음의 상관관계가 있었고 Peptococcus와 양의 상관관계가 있었습니다. 또한 Dubosiella 및 norank_f{15}} Erysipelotrichacea는 결장 IFN- 및 해마 TNF-와 부정적인 연관성을 나타내는 반면, Allobaculum, Harryfinita, 혈청 및 해마 TNF- 및 norank에서도 유사한 관계가 존재했습니다. _f{20}}Lachnospiracea, 혈청 IFN- 및 TNF- . 대조적으로, Peptococcus는 결장 TNF- 및 혈청 TNF-와 양의 관련이 있었습니다. 마찬가지로 norank_f{26}}Muribaculaceae는 혈청 IFN- 및 TNF-와 양의 상관관계가 있었습니다. 이러한 결과는 변형된 미생물 속, 특히 TG의 영향을 받은 Erysipelotrichaceae, Peptococcaceae, Muribaculaceae과에 속하는 특정 속이 HPA 축 관련 호르몬 및 전염증성 사이토카인과 동시에 강한 연관성을 보여 중요한 역할을 보여줌을 나타냅니다. HPA 축 기능과 염증을 조절하는 장내 미생물총의

시스탄슈 프로피에다드

TG와 HT는 CUMS 쥐에서 트립토판-키누레닌 대사를 억제합니다

TG와 HT가 쥐의 혈청 내 트립토판과 키누레닌 수치와 결장과 해마에서의 IDO1 발현에 미치는 영향을 확인했습니다. 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 혈청 내 트립토판 수치는 CUMS 그룹에서 유의하게 감소한 반면, 키누레닌 및 키누레닌-대-트립토판 비율의 증가된 수치와 대조적으로(Kyn /Trp) 및 결장 및 해마에서의 IDO1 단백질 발현. CUMS 그룹과 비교하여 FLX 그룹의 혈청 Kyn/Trp는 유의하게 감소했습니다(p< 0.05).="" tg="" and="" ht="" treatment="" resulted="" in="" a="" significant="" increase="" in="" the="" serum="" tryptophan="" level="" in="" cums="" rats="" (p="" <="" 0.05),="" and="" a="" decrease="" in="" the="" levels="" of="" serum="" kynurenine="" and="" kyn/trp="" (p="" <="" 0.05).="" in="" addition,="" tg="" significantly="" inhibited="" the="" expression="" of="" ido1="" protein="" in="" the="" colon="" of="" cums="" rats="" (p="" <="" 0.05),="" while="" a="" non-significant="" difference="" in="" the="" expression="" of="" ido1="" protein="" in="" the="" hippocampus="" was="" observed="" between="" cums="" and="" tg="" groups.="" however,="" the="" effect="" of="" ht="" on="" the="" expression="" of="" ido1="" protein="" in="" the="" colon="" and="" hippocampus="" was="" contrary="" to="" that="" of="" tg,="" indicating="" that="" tg="" and="" ht="" inhibited="" tryptophan-kynurenine="" metabolism="" by="" decreasing="" the="" expression="" of="" ido1="" in="" the="" colon="" and="" hippocampus="" of="" cums="" rats,="">

그림 5. 맹장 샘플에서 장내 미생물의 다양성, 구성 및 차이점 분석.

논의

이 연구에서는 두 가지 다른 동물 모델을 사용하여 처음으로 우울증과 유사한 행동을 완화하는 생리 활성 화합물을 CT에서 스크리닝했습니다. TP와 TO는 CTE에서 가장 비효과적인 성분이었고, TG는 우울증 치료에서 가장 가능성이 높은 성분이었습니다. CT 및 Cistanche 식물에 대한 이전 연구는 대부분 함량이 가장 높은 페닐에타노이드 배당체의 생물학적 활성에 초점을 맞추고 이리도이드 배당체 및 기타 덜 풍부한 성분의 중요성을 무시했습니다. 흥미롭게도, 우리 연구는 페닐에타노이드와 이리도이드 배당체가 HPA 축의 과다 활동, 심각한 말초 및 신경 염증, 해마 5-HT 및 BDNF의 결핍에 대해 상승적인 효과를 나타냄을 보여주었으며, 이는 유리한 항우울제의 중요한 이유일 수 있습니다. TG의 효과. 이러한 결과는 한약의 다성분 및 다표적 특성을 추가로 시사하고 미량 성분조차도 낮은 수준의 구성성분이 약리학적 효과에 중요한 역할을 할 수 있음을 상기시킵니다.

만성 스트레스는 GnRH 방출 감소 및/또는 GnRH의 뇌하수체 감수성을 통해 HPG 축의 억제뿐만 아니라 우울증의 발병을 촉진하는 HPA 축의 과잉 활동을 유도합니다(Kirby et al., 2009). 한편, cAMP와 cGMP는 생리학적 효과를 발휘하기 위해 많은 신경 전달 물질과 호르몬에 의존하는 중요한 중간 허브입니다(Siawrys et al., 2002). 최근 연구에서는 신장-양 결핍의 발생이 시상하부-뇌하수체-표적선 축의 기능 장애와 밀접한 관련이 있음을 일관되게 보여주었습니다(Zhang et al., 2019). 신장양 결핍 증후군에서 혈청 cAMP 및 cAMP/cGMP 수준의 현저한 감소도 관찰되었습니다. 이 연구에서 우리는 TG가 CUMS 쥐에서 혈청 CORT, CRF 및 ACTH의 수준을 억제하고 혈청 T 및 GnRH 함량을 증가시킬 수 있음을 발견하여 TG 투여 후 HPA 및 HPG 축 기능 장애의 회복을 나타냅니다. 또한, TG는 CUMS를 받은 쥐에서 혈청 cAMP/cGMP 수준의 상당한 감소를 역전시켰습니다. 따라서 우울증과 신장양 결핍증의 치료에서 CT의 잠재적인 기본 기전은 부분적으로 유사할 수 있으며 더 탐구할 가치가 있습니다. 더욱이, 성적 욕망과 행동의 생산은 복잡한 신경 반사 과정입니다. 성 호르몬은 중심적인 성적 흥분의 주요 원천이며 성 호르몬의 부족은 성욕이나 성기능 장애를 덜 유발할 수 있습니다(Holloway and Wylie, 2015). 특히, 과도한 5-HT는 GnRH의 방출을 억제하는데, 이는 SSRI로 장기간 치료한 후 만성 성기능 장애 발생의 주된 원인입니다(Prasad et al., 2015). 우리 연구에서 플루옥세틴(SSRI의 대표)은 HPG 축 기능 장애에 효과가 없었습니다. 그러나 TG가 해마의 5-HT 수준을 유의하게 개선했지만 혈청 T 및 GnRH 수준에서도 유사한 변화가 관찰되어 HPG 축의 억제를 개선했습니다. 이러한 결과는 우울증 치료에서 CT의 뚜렷한 이점을 보여주며 이러한 효과에 대한 내재적 기전은 더 연구될 필요가 있습니다.

증가하는 증거에 따르면 장은 생체 이용률이 낮은 천연 화합물을 사용하여 만성 질환을 치료할 수 있는 잠재적인 표적입니다(Zhou et al., 2020). 최근 연구(Wei et al., 2019)에 따르면 CUMS 치료는 대변 미생물군유전체 변경 및 장 장벽 결함을 유도하여 결장 점막으로의 세균 침입을 촉진하고 결장의 염증 반응을 악화시키는 것으로 나타났습니다. 그 보고와 일치하게, 우리의 결과는 4주간의 CUMS 노출이 쥐의 결장에서 술잔 세포 수와 점액층 두께의 광범위한 고갈뿐만 아니라 증가된 장 투과성으로 대표되는 장 장벽 파괴의 발병을 유도함을 보여주었습니다. ZO-1 단백질을 측정합니다. 또한, 결장에서 염증 유발 인자(예: TNF- 및 IFN-)의 발현 증가가 관찰되었습니다. 따라서, 이러한 발견은 명백한 조직학적 손상이 유도되지 않았지만 CUMS 치료가 결장 염증 및 장 장벽 파괴를 개시했음을 나타내었다. 이전 연구에서는 CT가 마우스에서 DSS 유발 대장염을 예방하는 데 개선된 효능을 발휘했다고 보고했습니다(Jia et al., 2014). 일관되게, TG는 또한 결장 염증 관련 질병을 임상적으로 치료할 수 있는 가능성을 강조하는 CUMS 쥐의 결장 및 장 장벽 붕괴를 완화하는 것으로 나타났습니다.

광범위한 연구는 또한 공생 장내 미생물총, HPA 축 및 염증을 연결하는 관계가 복잡하고 우울증 발병에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다(Misiak, et al., 2020). 장내 미생물 구성의 변화는 사이토카인의 방출을 증가시키고 작은 생체 활성 분자의 합성에 기여할 수 있습니다(Du et al., 2020). 특정 사이토카인(예: TNF-)은 혈뇌 장벽을 통과할 수 있으며 HPA 축의 강력한 활성화제입니다(Misiak et al., 2020). 차례로, HPA 축의 과활성화는 장내 미생물 불균형, 결장의 만성 염증 및 장 투과성 변화에 기여할 수 있습니다(Misiak et al., 2020). 이전 연구와 일관되게, 장내 미생물총의 TG 약물 변형은 우울증에 대한 개선 효과에 대한 책임이 있을 수 있습니다. 우리는 TG가 CUMS에 노출된 쥐의 다양한 수준에서 미생물 분류군의 풍부함을 대조군과 유사한 수준으로 역전시키는 것을 관찰했습니다. 특히, Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae, Muribaculaceae과에 속하는 주요 변이속은 HPA 축 및 염증과 높은 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 우리의 결과와 일치하게, Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae 및 Muribaculaceae 계통은 점막 장벽 완전성을 유지하고 염증의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었습니다(Kankoush, 2015; Borton et al., 2017; Zhang et al., 2020). 따라서 우리는 TG가 Erysipelotrichacea, Peptococcaceae 및 Muribaculaceae 계통에 할당된 일부 속의 풍부함을 조절하여 결장의 저급 염증, HPA 축의 과다 활동 및 점막 장벽 완전성의 파괴를 완화할 수 있다고 추측했습니다. 흥미롭게도 우리 연구에서 이름이 nor{11}}f{12}}Muribaculaceae인 한 속만이 해마에서 5-HT 및 BDNF와 상관관계가 있었습니다. 관계의 구체적인 메커니즘은 여전히 ​​​​불분명하고 더 자세히 조사해야합니다. 그렇지 않으면, 발견은 또한 TG에 의해 야기된 변경된 속의 대부분이 해마의 5-HT 수준에 직접적인 영향을 미치는 것이 극히 어렵다는 것을 시사합니다. 장내 미생물 구성의 변화가 TG 처리 후 해마 5-HT 수준에 미치는 영향을 설명하기 위해 트립토판 대사, HPA 축, 염증성 사이토카인 및 5-HT를 연결하는 복잡한 관계가 주목받았습니다. 트립토판은 인간의 필수 아미노산이며 1% 미만이 단백질 합성에 사용되며 대부분(90% 이상)은 IDO1 및 트립토판 2,{21}디옥시게나제 2(TDO2)에 의해 키누레닌으로 전환되며, 대략적으로 5%는 트립토판 수산화효소에 의해 세로토닌 경로를 따라 움직입니다(Duan, et al. 2018). 뇌의 5-HT 수준은 트립토판이 중성 아미노산 수송체를 통해 뇌로 수송된다는 점을 감안할 때 말초 트립토판 가용성에 크게 의존합니다(Duan et al., 2018). 키누레닌 경로의 첫 번째 단계에서 속도 제한 효소인 IDO1은 주로 IFN- 및 IL{32}} 및 TNF-와 같은 기타 전염증성 사이토카인에 의해 유도됩니다(Kennedy et al., 2017), 우리 연구에서 장내 미생물총과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 보고된 바와 같이 더 많은 트립토판이 키누레닌 경로를 통해 대사되어 트립토판이 5-HT로의 전환을 경쟁적으로 감소시키고 우울증에서 일반적으로 발견되는 감소된 5-HT와 연결됩니다(O'Mahony et al., 2015). 따라서 낮은 트립토판 수치와 높은 Kyn/Trp는 일반적이며 우울한 기분의 위험 증가와 일치합니다. TG 투여 후 결장에서 IDO1의 과발현이 억제되어 혈청 트립토판 수치가 증가하고 혈청 Kyn/Trp가 감소하여 TG에 의해 영향을 받는 장내 미생물과 해마{39}}HT 수치 간의 잠재적 연관성이 드러났습니다. 한편, 뉴로트로핀 계열의 구성원인 BDNF는 우울증에서 세포 분화, 뉴런 생존, 시냅스 형성 및 신경가소성 과정에 필수적입니다(Greenberg et al., 2009). 최근 연구에 따르면 BDNF는 장 점막 장벽 기능 및 장내 미생물과 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다(Maqsood and Stone, 2016). 또한 장내 미생물총의 변화는 BDNF 발현 수준을 증가시켜 우울과 유사한 행동의 발달에 영향을 미칠 가능성이 있는 것으로 보고되었습니다(Du et al., 2020). 그러나 5-HT 변이와 유사하게 우리 연구에서 TG로 인한 대부분의 변형된 속이 해마의 BDNF 수준에 직접적인 영향을 미치는 것은 극히 불가능했으며 고유한 분자 연결 및 메커니즘은 추가 조사가 필요합니다.

대조적으로, TG의 장내 미생물총 대사산물인 HT도 본 연구에서 항우울제 효과를 나타냈으며 이는 유리한 신경 보호 활성과 일치합니다(Hu et al., 2014). 우려되는 점은 HT가 전염증성 사이토카인, HPA 및 HPG 축 관련 호르몬, 해마 5-HT 농도를 CUMS 쥐의 대조군과 유사한 수준으로 조절할 수 있다는 점입니다. HT에 의한 것은 위의 생리학적 지표와 약한 상관관계를 나타내어 장내 미생물총이 HT의 항우울 활성의 표적이 아닐 수 있음을 시사합니다. 또한, HT는 증가된 혈청 트립토판 수치와 함께 해마에서 IDO1의 과발현을 억제했지만 결장에서는 억제하지 않았습니다. TG와 HT 사이의 명백한 차이의 발생은 혈류로의 HT의 탁월한 흡수와 HT가 혈액-뇌 장벽을 통과하는 능력 때문일 수 있으며(Robles-Almazan et al., 2018), 이는 또한 다음을 나타냅니다. 장내 미생물총의 강력한 대사 능력은 생리적 기능 외에도 TG의 항우울제 활성에 특히 중요합니다. 따라서 우리는 식물화학물질과 장내 미생물총의 양방향 상호작용이 TG 투여로 우울증 치료에 중요한 역할을 한다는 것을 사전에 입증했습니다(그림 9 참조).

씨스탄체 건강 보조 식품놀다우울증 치료에 중요한 역할.

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결론

요약하면, TG는 주로 CT의 항우울제 활성에 책임이 있으며, 이는 HPA 축의 과활성화, 심각한 말초 및 신경 염증, 5-HT 및 BDNF 결핍에 대한 페닐에타노이드 및 이리도이드 배당체의 상승 효과를 반영합니다. 해마. 또한, TG의 항우울제 효과의 잠재적인 분자 메커니즘은 식물 화학 물질과 장내 미생물의 양방향 상호 작용을 통해 달성되었습니다. 또한, 플루옥세틴으로 대표되는 SSRI 치료로 조절되지 않는 TG와 HT에 의한 억제된 HPG 축 및 고리형 염기 이상의 개선은 우울증 치료에서 CT의 뚜렷한 이점을 나타냈다. 이러한 조절은 CT 및 유사한 전통 약초를 사용한 우울증 치료에 대한 유망한 전략을 나타냅니다.