Plasmodium Berghei 감염 마우스의 간 및 신장 기능에 대한 Cassia Spectabilis DC 에탄올 잎 추출물의 독성학적 평가 및 보호 효과
Oct 30, 2023
1. 소개
오늘날까지의 문제는Plasmodium기존 항말라리아제에 대한 기생충 저항성은 여전히 말라리아 퇴치를 위한 주요 문제입니다[1-3]. 따라서 항말라리아제의 새로운 공급원 발견에 대한 연구가 계속 진행되고 있으며 그 중 하나는 약용 식물입니다 [4].생체 내그리고시험관 내에서모델은 오랫동안 항말라리아 테스트에 사용되어 왔습니다. 20세기 후반에는Plasmodium berghei또는Plasmodium yoelii설치류를 감염시키는 데 사용되었습니다. 그 동안에,P. 베르게이간 단계, 특히 말라리아 재발을 조사하기 위한 최면체 형성 연구에 가장 일반적으로 사용되는 종이 되었습니다[5-7].
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인도네시아의 전통 식물 중 하나인 Caesalpiniaceae 계통의 Cassia spectabilis DC는 시험관 내에서 P. falciparum에 대해 실험적으로 입증되었으며 생체 내에서 P. berghei에 대해 말라리아를 치료하는 것으로 입증되었으며[8, 9], 이는 C. spectabilis DC 식물이 다음과 같다는 것을 나타냅니다. 말라리아 치료제 후보로 개발될 가능성이 매우 높습니다. 이전 연구에서는 BALB/c 마우스를 대상으로 P. berghei ANKA에 대한 C. spectabilis DC 잎의 90% 에탄올 추출물에 대한 생체 내 테스트에서 ED50 값이 131.5 mg/kg BW인 것으로 나타났으며[9], 이는 매우 낮은 수준으로 분류됩니다. 좋은 말라리아 예방 활동 [10].
또한, C. spectabilis DC의 추출물, 분획, 하위 분획 및 분리된 화합물은 항말라리아 활성에 대해 시험관 내에서 테스트되었습니다. *e 이 식물의 활성 화합물은 (-){0}}하이드록시카신과 동일한 화합물로 성공적으로 식별되었으며, 시험관 내 항말라리아 활성 테스트에서는 0.016 ug/mL의 매우 낮은 IC50을 나타냈습니다. 11], 이는 매우 강력한 항말라리아 활성으로 분류됩니다 [12].
말라리아 약물 저항성을 극복하기 위한 이 식물에 대한 연구는 P. berghei ANKA 감염 쥐의 간 및 신장 기능에 대한 C. spectabilis DC 잎 추출물의 안전성과 개선 효과를 조사함으로써 계속되었습니다. 기생충에 감염된 생쥐의 간 및 신장 기능에 항말라리아 활성을 갖는 약용 식물이 미치는 영향에 대한 연구 연구가 광범위하게 수행되었으며[13-16], 급성 및 아급성 독성 테스트도[17-20] 이루어졌습니다. 간은 생리적 과정을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 대사, 분비, 저장 등 여러 가지 중요한 기능에 관여하는 기관입니다. 또한 간은 내인성 및 외인성 화합물의 해독 및 배설에 중요한 역할을 합니다.
말라리아 감염은 말라리아 기생충에 감염된 암컷 Anopheles 모기에 물려 포자소체가 감염될 때 시작됩니다. 수혈 중에 감염된 암컷 아노펠레스는 기생충의 포자소체 단계를 주입합니다[25, 26]. 인체 내에서 약 한 시간 동안 이동한 후 포자소체는 간으로 들어가 간세포를 공격하고 외적혈구 분열의 무성생식 주기를 시작합니다. 간세포 내부에서 기생충은 성숙한 분열체에 도달할 때까지 무성생식으로 증식하고, 최종적으로 간세포 파열에 감염된 후 다수의 메로조이트가 생산되어 혈류로 들어갑니다. *e 감염된 간세포와 메로조이트의 파열로 인해 간 손상을 일으키는 감염된 간세포는 혈류로 들어가 적혈구에서 적혈구 순환을 시작합니다[27, 28]. 간세포에 발생하는 손상은 간 기능에 작용하는 효소, 특히 아미노전이효소(transaminase) 효소의 증가, 간비대증 등 간 외양의 형태적 변화를 증가시킬 수 있습니다[29, 30]. 간비종대는 말라리아 기생충에 만성적으로 노출되어 발생하는 인간[31]과 생쥐[32]의 말라리아 감염의 일반적인 특징입니다. 그러나 말라리아 감염에서는 신장이 커지지 않습니다.
간의 기능 장애는 혈장에서 방출된 혈장 글루타민산 옥살로아세트산 트랜스아미나제(SGOT) 및 혈장 글루타민산 피루브트랜스아미나제(SGPT)의 간세포 아미노전이효소 또는 조직의 조직학적 검사를 통해 검출할 수 있습니다[33]. 가장 흔한 손상은 세포자멸사 또는 간세포 괴사의 활성화입니다[34-36]. 임상적으로 중요한 신장 침범은 P. falciparum 및 P. Malariae에 의한 감염과 관련이 있습니다. *e P. falciparum 감염은 무증상부터 요로 장애, 급성 신부전(ARF) 또는 투석 지원이 필요한 급성 신장 손상(AKI)에 대한 경미한 전해질 장애에 이르는 급성 증상을 나타냅니다[27, 37]. *e 말라리아 합병증으로 인한 AKI 사례는 약 75%에 달하는 높은 사망률에 기여하는 것으로 알려져 있습니다. *e 조직학적 연구는 말라리아 관련 AKI의 주요 혈역학 요인으로 사구체신염, 급성 세뇨관 괴사 및 간질성 신염의 존재를 시사합니다[38]. 일반적으로 신장 기능 장애의 정도는 소변 내 적절한 양의 단백질 존재, 혈장 요소, 크레아티닌 및 혈장 전해질 수준의 증가로 감지할 수 있습니다[39].
*e BALB/c 마우스에서 C. spectabilis DC(EECS) 잎의 90% 에탄올 추출물의 독성과 그에 따른 효소 검사는 EECS 투여 후 조직병리학 및 간 및 신장 기능에 영향을 미칠 수 있습니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 식물 재료 및 EECS 준비. *e C. 스펙타빌리스
DC 잎은 LIPI(Indonesia Research Centre), Botanical Garden, Purwodadi, East Java, Indonesia(B-160/IPH.06/KS.02/III/2019)에서 구입하고 결정했습니다. *e 표본은 Universitas Airlangga 약학부 약리학 및 식물화학과에 식물표본관으로 기탁되었습니다. *잎은 수돗물로 깨끗이 씻어서 이물질을 제거하고 45도에서 건조시킨 후 분쇄기로 갈아 가루로 만들었습니다. *e 추출은 90% 에탄올(25~30도) 2,500mL가 담긴 플라스크에 식물 분말(500g)을 3×24시간 동안 침용시켜 수행하였다. *e 추출용매를 분리하고 여과지로 여과한 후 회전증발기로 감압증발시켰다. *e C. spectabilis DC 잎 분말의 건조 중량 1000g의 에탄올 추출물 수율은 10.20%(w/w)였으며 이 실험에 사용되었습니다.
2.2. 동물.
연구에는 6~8주령, 체중 25~30g의 수컷 BALB/c 마우스가 사용되었습니다. 모든 생쥐는 인도네시아 동부 자바 수라바야의 가축 및 동물 보건부 농업부 사무국인 Farma Veterinary Center에서 입수했습니다. *e 동물은 표준 조건에서 사육되었으며 사료와 물을 자유롭게 공급했습니다. *e 연구 프로토콜의 승인은 인도네시아 Universitas Air langga의 동물 연구 윤리 위원회(번호 2.KE.181.10.2018)로부터 획득되었습니다.
2.3. 급성 독성 테스트.
EECS를 칭량하고 0.5% 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스(Na CMC)로 재현탁하여 원하는 용량을 얻었습니다. BALB/c 쥐에게 추출물을 먹이기 전 24시간 동안 금식시켰습니다. *e 동물은 3개의 그룹으로 나뉘었고, 각 그룹에는 5마리의 쥐가 포함되었습니다. *e 각 그룹의 복용량은 1,250이었습니다. 2,500; 및 각각 5,000 mg/kg BW. 각 마우스의 일반적인 행동은 각 투여 후 1시간 동안 지속적으로 관찰되었고, 간헐적으로 4시간마다 관찰되었으며, 그 이후에는 24시간에 걸쳐 관찰되었습니다[40-42].
2.4. 아급성 독성 테스트.
아급성 독성시험에서 생쥐를 세 그룹으로 나누어 각 그룹에 EECS를 150 mg/kg BW 일일 경구 투여량을 28일 동안 1회, 5회, 10회 투여하였고; 정상 대조군에게는 음식과 음료만 자유롭게 제공되었습니다[43]. *e 동물은 독성 징후가 있는지 28일 동안 관찰되었습니다. 관찰 기간이 끝나면 에테르 마취 하에 모든 동물을 희생시키고 육안적 검사와 조직병리학적 검사를 위해 모든 동물로부터 간, 신장과 같은 필수 장기를 적출하였다.
2.5. 설치류의 기생충.
Plasmodium berghei ANKA의 클로로퀸 민감도는 인도네시아 자카르타의 Biomolecular Eijkman 연구소에서 얻었으며 본 연구에서 사용된 연속 계대법으로 유지되었습니다.
2.6. SGOT 및 SGPT의 혈장 수준에 대한 EECS의 영향.
*이 실험은 Peters [44]를 기반으로 한 억제 테스트였습니다. * SGOT 및 SGPT의 혈장 수준에 대한 EECS 평가 이전에 억제 테스트가 수행되었습니다. *e 동물은 P. berghei ANKA에 감염되었고 A, B, C, D, E의 5개 그룹으로 나뉘었습니다. *e 동물은 감염 직후 0(D0)일에 치료되었습니다. 3일 동안(D1~D3) 매일 계속되었습니다. 음성 대조군인 그룹 A는 0.5% Na CMC를 경구 투여 받았습니다. 치료 그룹인 그룹 B와 C에는 각각 150 및 200 mg/kg BW의 단일 경구 용량으로 EECS가 제공되었습니다. 그룹 D는 100mg/kg BW의 단일 경구 용량으로 클로로퀸을 투여한 양성 대조군이었습니다. 또한, 건강한 대조군인 E그룹은 기생충에 감염되지 않았으며 음식과 음료만 자유롭게 섭취했습니다. 4일째(D4) 각 마우스의 혈액 도말표본을 준비하여 현미경으로 검사하였다. 또한, SGOT 및 SGPT 수준을 측정하기 전에 혈장을 수집했습니다.
2.7. 간 및 신장의 조직병리학에 대한 EECS의 효과.
관찰 기간이 끝나면 간과 신장을 제거하기 전에 모든 동물을 에테르 마취 하에 희생시켰습니다. 장기의 무게를 잰 후 조직을 10% 포름알데히드 용액에 고정하고 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 위해 추가 처리했습니다. *e 조직병리학적 관찰은 조직의 퇴행성 및 괴사성 세포에 대한 EECS의 독성학적 효과를 알아보기 위해 수행되었습니다. *e 손해는 Gibson-Corley et al.을 기준으로 등급이 매겨졌습니다. [45].
2.8. 통계 분석.
*e 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표시되었습니다. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 치료 간 정규 분포 데이터를 비교한 후, 다른 유의성이 얻어지면 사후 다중 비교 테스트를 수행했습니다. 데이터가 정상적으로 분포되지 않은 경우 Kruskal-Wallis 및 Mann-Whitney U-test를 사용하여 치료법 간의 차이를 평가했습니다.
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