루푸스 신염에서 Caspase-1/Gasdermin D 유도-Pyroptosis의 억제를 통한 병용 요법의 새로운 효과

자세한 정보:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang 및 Jin Lin

요약

목적: mycophenolate mofetil, tacrolimus 및 스테로이드와의 병용 요법은 다음에서 완전한 관해를 달성하는 데 효과적입니다.루푸스 신염(LN). 복합 요법은 단독 요법과 비교하여 고유하게 하향조절된 카스파제{0}}이며, 이는 가스더민 D(GSDMD)를 절단할 수 있으며 최근에파이로프토시스실행자. 따라서 우리는 병용 요법이 caspase{0}}/GSDMD 매개의 억제를 가능하게 하는지 조사했습니다.파이로프토시스LN에서 (루푸스 신염).

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방법: GSDMD의 발현과 활성화는 LN이 있는 사람과 마우스의 신장 표본에서 검출되었습니다.루푸스 신염) 면역 조직 화학 염색 및 면역 블로팅을 사용합니다. MRLlpr 마우스로부터 분리된 1차 족세포를 LPS와 ATP와 함께 인큐베이션하고 단독 요법 또는 조합 요법으로 전처리하였다. 카스파제{0}}/GSDMD 유도 억제파이로프토시스조합 요법에 의한 MRLlpr 마우스 및 인간 표본에서 평가되었습니다. 저는 FAM 카스파제{0}} 키트와 유세포 분석을 사용하여 검사를 받았습니다. 사이의 상관관계파이로프토시스말초혈액 및 전신홍반루푸스병활성지수(SLEDA)를 분석하였다.

결과: LN의 신장 조직 표본(루푸스 신염) 환자 및 마우스는 GSDMD의 발현 수준 및 절단이 크게 증가된 것으로 나타났다. 배양된 족세포에서 병용 치료는 NLRP3 및 caspase{1}}의 활성화를 유의하게 억제하고 GSDMD N-말단 수준을 감소시켰습니다. 복합 요법은 카스파제-1/GSDMD 매개 억제를 통해 질병 진행을 억제합니다.파이로프토시스인간과 MRL/LPR 마우스 모두에서. 말초혈액의 Caspase{0}}/PI 양성 세포 수는 SLE-DA1과 양의 상관관계가 있었습니다. LN(루푸스 신염) 완전 관해 및 부분 관해가 있는 환자는 기준선과 비교하여 카스파제{0}}/PI 양성 세포 수가 현저히 감소했습니다. GSDMD 유래 억제제인 ​​Ac-FLTD-CMK는 LN(루푸스 신염).

결론: 복합 요법 억제 카스파제{0}}/GSDMD 매개파이로프토시스시험관 내 및 생체 내 및 질병 진행 감소.

키워드:루푸스 신염, 파이로프토시스, 카스파제-1, 가스더민 D, 요법

치료 요법파이로프토시스

소개

루푸스 신염(LN)은 자가면역 질환 전신홍반루푸스(SLE)의 결과로 발생하는 신장 염증입니다.LN(루푸스 신염)은 SLE로 고통받는 환자의 주요 징후입니다. 환자의 약 60%에서 이 상태가 발생하고 약 20%는 말기 신장 질환(ESRD)으로 진행됩니다(1). 마이코페놀레이트 모페틸(MMF), 칼시뉴린 억제제(CNI) 및 스테로이드와의 병용 요법은 상보적 효과를 생성하고 또한 독성을 최소화합니다(2). 이 요법은 LN의 초기 치료로 권장됩니다(루푸스 신염) 정맥주사용 사이클로포스파미드(IVCY) 및 스테로이드(3-5)에 비해 더 나은 효능과 완전한 관해를 나타냅니다.

병용 요법의 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위해 LN의 쥐 모델에서 포괄적인 전사체 분석을 사용했습니다. (루푸스 신염). MRL/LPR 마우스에 단독 MMF, 타크로리무스 또는 프레드니손을 단독 요법 또는 삼중 약물 조합으로 제공했습니다. LN이 있는 마우스의 신장에서 유전자 발현 프로필 (루푸스 신염)단독 요법과 비교하여 병용 요법의 부가적 및 상승적 효과를 설명할 수 있는 잠재적인 메커니즘을 밝혔습니다. 병용 요법에 의해 고유하게 조절되는 45개의 하향 조절된 유전자 중 하나는 카스파제{1}}(6)입니다. 이는 NLRP3, pro-caspase{5}} 및 apoptosis-associated speck-like protein(ASC)으로 구성된 다중단백질 올리고머인 inflammasome에 의해 활성화되며 통합된 caspase 친화성 도메인이 있습니다. NLRP3/ASC/caspase-1 inflammasome은 LN의 발병기전에 주요 기여자로 인식되었습니다. (루푸스 신염). NLRP3 인플라마솜은 카스파제-1를 활성화하여 자가염증성 장애를 유발하고, LN(7-9)에서 족세포 기능 장애를 유발하는 것으로 알려진 친염증성 사이토카인(예: IL-1)의 생성을 시작합니다.

활성 카스파제{0}}는 N-말단 및 C-말단 도메인의 연결 내에서 가스더민 D(GSDMD)를 절단합니다. 그런 다음 N 말단 도메인은 세포막의 기공 형성을 촉진하고 세포를 자극합니다.파이로프토시스및 사이토카인 IL-1 및 IL{1}} 생산(10). 최근 연구에 따르면 GSDMD 매개파이로프토시스자가면역 뇌척수염(11), 다발성 경화증(12), 알코올성 간염(13) 및 염증성 장질환(14)을 포함한 질병의 진행에 참여합니다. 또한 카스파제{4}}/GSDMD의 유전적 또는 약리학적 억제는 당뇨병성 신장 질환의 쥐 모델(15, 16) 및 급성 신장 손상 후(17-19) 손상으로부터 신장을 보호하는 것으로 입증되었습니다. 하지만,파이로프토시스LN에서 (루푸스 신염)아직까지 제대로 정의되지 않았습니다(20). 우리는 병용 요법이 LN에 유익한 효과를 부여했다고 가정했습니다. (루푸스 신염)) 억제함으로써파이로프토시스caspase{0}}/GSDMD에 의해 유도됩니다.

본 연구에서는 신장 조직에서 caspase{0}} 및 GSDMD의 활성화와 함께 caspase{1}}/GSDMD 의존성에 대한 병용 요법의 효과를 조사했습니다.파이로프토시스MRL/LPR 마우스 및 LN 환자에서 억제 (루푸스 신염). 잠재적 상관 관계파이로프토시스SLE 질병 활성 지수(SLEDAI)와 치료 반응도 평가했다.

치료파이로프토시스

재료 및 방법

연구 인구

연구 코호트는 LN 생검으로 진단된 환자들로 구성되었습니다(낭창신장증) 등록 전 6개월 이하. 환자의 연령 범위는 18-65세였으며 모두 SLE에 대한 미국 류마티스 학회(2l, 22) 및 국제 신장 학회/신장 병리 학회(2003)의 분류 기준을 충족했습니다. Zhejiang University School of Medicine과 Nanjing University School of Medicine에서 단백뇨(1.5g/d 이상)와 혈청 크레아티닌 농도가 265.2umol/L 이하인 환자를 모집했습니다. 제외 기준은 다음과 같습니다. 환자는 이전에 고용량의 메틸프레드니솔론으로 치료받은 적이 있습니다. 생물학적 제제(특정 병원성 분자를 표적으로 함) 또는 병용 요법; 스크리닝 12주 이내에 현재의 혈장교환술 또는 정맥내 글로불린 치료; 비정상적인 간 기능; 현재 활동성 감염; 및 연구 시작 4주 이내의 악성 종양. LN(낭창신장증) 환자는 0.5g/d의 용량으로 3일 동안 메틸프레드니솔론으로 펄스 요법을 받았습니다. 메틸프레드니솔론 펄스 요법이 완료되면 프레드니손(0.6 mg/kg/일), MMF(0.5 g, 2회 용량/일) 및 타크로리무스(2 mg, 2회 용량/d)가 총 4주 동안 제공되었습니다. 그런 다음 여전히 MMF(0.5g, 2회 용량/일) 및 타크로리무스(2mg, 2회 용량/일)와 결합된 프레드니손의 용량을 2주마다 5mg/d씩 감량했습니다. 1{17}} mg/d 유지 용량을 달성했습니다(4). 완전 관해(CR)는 24-시간 소변 단백질 농도 0.4g 이하, 활성 소변 침전물 부재, 혈청 알부민 농도 35g/L 이상 및 정상 크레아티닌으로 간주되었습니다. (23). 부분 관해(PR)는 24-h 소변 단백질 농도가 3.5g 이하, 혈청 알부민 농도가 30g/이상으로 50% 이상 감소한 것으로 간주했습니다. L, 정상 또는 기준선으로부터 혈청 크레아티닌 농도의 25% 이하 증가. 우리 기관 검토 위원회는 연구(No. IIT20200410A)를 승인했으며 모든 환자는 등록 전에 서면 동의를 제공했습니다.

동물 모델

암컷 MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) 마우스는 SLAC Laboratory Animal Co.Ltd(중국 상하이)에서 제공했으며, 모든 마우스는 난수 생성기를 사용하여 각 그룹 및 각 케이지에서 5마리의 마우스를 무작위로 나누었습니다. . 이들은 8주령에 0.5 mg/kg 타크로리무스(MCE HY-13756), 50 mg/kg MMF(MCE HY-B0199) 및 1 mg/kg의 조합으로 경구 치료를 받았습니다. 앞에서 설명한 대로 총 8주 동안 매일 kg 프레드니손(MCE HY-B0214) 또는 차량. Ac-FLTD-CMK는 MCE에 의해 합성되었으며 매일 10 mg/kg을 복강내 주사했습니다. 모든 치료는 다음 탐지에 책임이 있는 참가자에 대해 눈이 멀었습니다. 소변 알부민 대 크레아티닌 비율(UACR)은 Albuwell M과 Creatinine Companion(Excell, Phil, US)을 사용하여 결정되었습니다. 신장 표본을 조직학적 및 면역조직화학적 염색 전에 4% 파라포름알데히드에 고정하고 면역블롯팅 분석을 위해 신장 피질을 추출했습니다. 마우스 사용은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(No.{20}})의 승인을 받았습니다.

마우스 사구체 분리 및 족세포 배양

사구체는 이전에 설명한 대로 12-주된 암컷 C57 및 MRL/LPR 마우스의 신장에서 정제되었습니다(24). 마취된 마우스를 37℃로 예열된 자기 비드로 관류시켰다. 신장을 제거하고 얼음 위에서 1mm³로 잘게 썬다. 그런 다음 신장 조직을 37도에서 1 mg/ml 콜라게나제 및 100 U/ml DNase I로 30분 동안 소화한 다음 100-μm Falcon cell strainers(431752, BD)로 두 번 여과했습니다. 4도 HBSS 용액(H1025, Solarbio)으로 여러 번 세척하고 200g에서 5분간 부드럽게 원심분리한 후, 자석 스탠드(HY-K0200, MCE)를 사용하여 비드가 포함된 사구체를 수집하고 HBSS 용액으로 3회 세척하였다. 분리된 사구체는 Jeffrey(25)에 의해 기술된 방법에 따라 37도에서 5% CO에서 유형 I 콜라겐(C3867, Sigma-Aldrich) 코팅된 배양 접시에서 배양되었습니다. 체외 실험에서 계대 2 족세포를 사용하였다.파이로프토시스유도, 세포독성 및 IL{0}} 분비 검출

MRL/LPR 마우스의 족세포는 Opti-MEM에서 4시간 동안 분해된 1 mg/ml LPS(tell-pb5lps, InvivoGen)로 프라이밍된 다음 5mM ATP(tlrlatpl, In Vivo 유전자) 자극이 뒤따랐습니다. C57 마우스의 족세포는 정상 대조군으로 절단되었습니다. 단독 요법 tacrolimus(10μM), MMF(luM) 및 prednisone(10μM) 또는 병용 요법은 LPS 프라이밍 전에 1시간 동안 세포와 사전 배양되었습니다. 자극 후 세포독성은 세포독성 검출 키트(11644793001, Roche)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 결정하였다. 자극 후 상등액을 채취하여 IL{12}} 마우스 ELISA Kit(BMS6002, Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.

항체 및 시약

Caspase{0}}(sc{1}}, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1(sc-81868, Santa Cruz Biotech) 수준은 제조업체의 지침에 따라 평가되었습니다.파이로프토시스말초혈액에서 FAM FLICAMCaspase{0}} Kit(Bio-Rad, USA)를 사용하여 유세포 분석법으로 측정했습니다.

통계 분석

통계 분석은 GraphPad Prism(vers. 8.{1}})을 사용하여 수행되었으며 데이터는 평균 ± SD로 제공됩니다. 두 그룹 비교는 Student's t-test를 사용하고 Pearson의 상관 관계를 사용하는 상관 분석을 수행했습니다. 양측 피<0.05 was="" considered="" statistically="">

치료파이로토시스루푸스 신염(LN)

결과

GSDMD 중재파이로프토시스LN의 영향을 받는 신장에서 활성화됩니다(낭창신장증)

GSDMD가 LN의 발병에 기여했는지 여부를 조사하기 위해(낭창신장증), 우리는 먼저 LN에서 채취한 신장 표본에서 GSDMD의 단백질 발현 수준을 테스트했습니다(낭창신장증) 환자. 면역조직화학적 분석은 LN에서 채취한 신장 생검 표본에서 GSDMD의 발현 수준이 현저히 증가한 것으로 나타났습니다(낭창신장증) IV형, V형, I형 + V형 IV형 + V형 환자, 그리고 건강한 대상과 비교했습니다. GSDMD는 사구체 족세포, 세뇨관 세포 및 LN의 침윤된 간질 세포에서 보편적으로 발현되었습니다(낭창신장증) 환자. 양성(빨간색 화살표) 및 음성 염색(검정색 화살표)이 있는 영역이 확대되었습니다(그림 1A). 그런 다음 신장에서 GSDMD 양성 영역의 비율을 추정했습니다(그림 1B). MRL/LPR 마우스와 야생형 대조군의 신장에서도 유사한 결과가 발견되었습니다. Immunoblotting 분석은 MRL/LPR 마우스의 신장 표본에서 GSDMD의 발현 및 절단이 크게 증가되었음을 확인했습니다(그림 1C). 사구체 족세포, 관 세포 및 침윤된 간질 세포의 GSDMD는 대조군 마우스와 비교하여 MRL/LPR 마우스에서 상승했습니다(그림 1D). 이러한 데이터는 GSDMD 매개가 LN에 의해 ​​영향을 받는 신장 조직에서 활성화되었음을 시사했습니다(낭창신장증).

그림 1|GSDMD는 LN(루푸스 신염)의 영향을 받는 환자 및 마우스의 신장에서 강하게 상승하고 절단됩니다.

(A) 건강한 피험자와 LN에서 채취한 신장 표본에서 GSDMD의 면역화학적 염색(낭창신장증) 환자, 양성(빨간색 화살표) 및 음성 염색(검정색 화살표)이 확대되었습니다.

(B) GSDMD 양성 영역의 정량화는 유형 III + V, IV, IV + V, V LN(낭창신장증) 환자 및 건강한 피험자.

(C) 3쌍의 대조군 및 MRL/LPR 마우스로부터의 신장 피질에서 전장, 절단된 N-말단 도메인 및 C-말단 도메인 GSDMD의 면역블롯 분석.

(D) 대조군 및 MRL/LPR 마우스에서 채취한 신장 표본에서 GSDMD의 면역화학 염색.

*p < {{0}}.05,="" **p="">< 0.01.="">낭창신장증), 낭창신장증; 플로리다, 전체 길이; NT, N-말단 도메인; CT, C-말단 도메인.

복합 치료는 GSDMD 매개를 억제합니다파이로프토시스시험관 내에서 1차 족세포의 활성화

에 대한 병용 요법의 억제 효과를 조사하기 위해파이로프토시스, 우리는 유도하기 위해 LPS + ATP 자극 방법을 적용파이로프토시스MRL/LPR 마우스의 족세포에서 정상 대조군으로 야생형 C57 마우스의 족세포를 취합니다. MRLlpr 마우스의 족세포를 LPS로 4시간 동안 프라이밍한 다음 GSDMD 매개에 대해 일반적으로 사용되는 자극인 ATP로 4시간 동안 처리했습니다.파이로프토시스활성화(26). 정상 대조군과 비교하여, 족세포는 이후에 세포 팽창 및 버블링과 같은 pyroptotic 형태학적 특징을 나타냈다. 병용 요법으로 전처리하면 발열성 형태학적 특징과 세포독성이 크게 개선되었습니다(그림 2A). LPS + ATP 유도 족세포 세포독성. 대조적으로, 병용 요법은 LPS + ATP 자극에 의해 유도된 상청액에서 세포독성 및 IL{2}} 분비를 유의하게 감소시켰다(도 2B, C). GSDMD 매개 활성화를 추가로 확인하려면파이로프토시스, 우리는 면역 블로 팅을 사용하여 표준 inflammasomes 및 GSDMD 활성화를 분석했습니다. pyroptotic 형태 변화 및 세포 독성과 일치하여 LPS와 ATP는 족세포에서 NLRP3, caspase{1}} 및 절단된 GSDMD를 유의하게 활성화했습니다(그림 2D). 병용 치료는 NLRP3 및 caspase-1의 활성화를 현저하게 억제하고 GSDMD N-말단의 수준을 감소시켰습니다. 특히 tacrolimus, MMF 또는 prednisone 단독 요법은 LPS와 ATP를 동시에 억제하여 세포 세포 독성과 L{6}} 분비를 자극했지만, 병용 요법은 Caspase-1와 GSDMD에 대해 보다 유의한 억제 효과를 보였습니다. 이러한 결과는 병용 치료가 GSDMD 매개를 개선했다는 견해를 뒷받침하는 증거를 제공했습니다.파이로프토시스NLRP3 및 caspase-1의 활성화를 억제합니다.

그림 2|조합 치료는 시험관 내에서 족세포의 발열을 개선합니다.

(A) Pyroptotic 특징은 LPS + ATP와 함께 배양하고 조합 처리로 전처리한 후 배양된 1차 족세포에서 나타났습니다. 화살표는 pyroptotic과 같은 기능을 나타내는 세포를 나타냅니다.

(B) 챌린지된 세포의 상청액을 LDH 분비로 측정한 세포 사멸에 대해 분석했습니다.

(C) 공격을 받은 세포의 상등액을 IL{0}}b 방출에 대해 분석했습니다.

(D) NLRP3 인플라마솜 활성화 후 타크로리무스, MMF, 프레드니손 또는 병용 치료 후 NLRP3, 카스파제{1}}, GSDMD-NT 및 ASC 발현의 면역블롯팅 분석.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001;="" ****p="">< 0.0001.="" ldh,="" 젖산="">

DSMO, 디메틸 설폭사이드, FK506, 타크로리무스; MMF, 미코페놀레이트 모페틸; PNS, 프레드니손; COM, 병용 요법; ASC, 세포 사멸 관련 반점 유사 단백질.

복합 치료 억제 카스파제-1/GSDMD 유도파이로프토시스MRL/LPR 마우스에서

8주령의 MRL/LPR 마우스에 MMF, 타크로리무스, 프레드니손 또는 비히클 대조군의 조합을 제공했습니다. 이전 연구(6)와 일관되게, 8주 동안의 치료 후, 비히클과 조합 치료 그룹 사이에 사망률 또는 체중에서 차이가 발견되지 않았습니다. 비히클 그룹과 달리 병용 요법은 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 면역 세포 침윤을 예방하는 데 매우 효과적이었습니다(보충 그림 1).

다음으로 병용 요법과 비히클 대조군에서 caspase{0}} 및 GSDMD 발현 수준을 조사했습니다. 면역조직화학 분석 결과 사구체 및 신장 간질 카스파제-1 및 GSDMD 발현이 병용 요법 그룹에서 현저하게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 3A). 면역블롯팅 분석에서도 병용 치료군의 신장 피질에서 카스파제-1 및 GSDMD의 발현 및 절단이 감소된 것으로 나타났습니다(그림 3B). 또한, caspase-1/propidium iodide(PI) 이중 양성 세포는 유세포 분석 및 a파이로프토시스FAM Caspase{0}}키트. 결과는 비히클 처리된 MRL/LPR 마우스와 비교하여 조합 처리를 받은 MRL/LPR 마우스에서 카스파제-1*/PI' 말초 혈액 세포 수의 현저한 감소를 보여주었습니다(그림 3C,D). 또한, 병용 치료도 혈청 II 농도를 유의하게 감소시켰다(도 3E). 따라서 우리는 병용 치료가 caspase-1/GSDMD 유도를 억제한다는 결론을 내렸습니다.파이로프토시스LN의 신장과 혈액 세포에서 (낭창신장증) 쥐.

그림 3|복합 치료는 MRL/LPR 마우스에서 카스파제{1}}/GSDMD 매개 pyroptosis를 약화시켰습니다.

(A) MRL/LPR 마우스 신장 표본에서 GSDMD 및 카스파제{0}}의 면역화학 염색. 비히클 대조군과 비교하여, caspase-1 및 GSDMD 발현은 병용 처리군에서 현저하게 억제되었다.

(B) MRL/LPR 마우스의 신피질 표본에서 전장 및 절단된 GSDMD 및 카스파제{1}}의 면역블롯 분석; 비히클 및 조합 처리 그룹의 결과 비교.

(C) 복합 치료를 받았거나 받지 않은 MRL/LPR 마우스의 말초 혈액에서 카스파제{0}}/PI 이중 양성 세포의 FACS.

(D) MRL/LPR 마우스의 말초혈에서 카스파제{0}}/PI 이중 양성 세포의 정량화는 병용 요법이 제공되거나 제공되지 않습니다.

(E) 병용 치료를 받았거나 받지 않은 MRL/LPR 마우스에서 혈청 IL{0}}b 농도의 정량화. ####P < 0.0001.="" facs,="" 형광="" 활성화="" 세포="" 분류;="" ct,="" 병용="">

복합 요법 억제 카스파제-1/GSDMD 유도파이로프토시스LN에서 (낭창신장증) 환자

2020년 1월과 2020년 6월 사이에 47명의 LN 환자(낭창신장증)이 등록되었고 43명이 24-주의 병용 요법을 완료했습니다. 등록된 코호트의 기준선 질병 및 인구 통계는 보충 표 1에 나열되어 있습니다. 카스파제-1/요오드화프로피디움의 정량화(PI 이중 양성 세포는 LN(낭창신장증) 유형 III, IV, V, III + V, IV + V 및 건강한 대조군에서 a파이로프토시스FAM Caspase{0}} 키트 및 유세포 분석. 건강한 대조군과 비교하여 말초혈액의 caspase{1}}/PI 이중 양성 세포 수가 증가했습니다(그림 4A, B). 또한 24-주 치료 후 기준선에서 카스파제-1/PI 이중 양성 세포를 조사했습니다. 유도 요법 24-주 후 CR 및 PR의 발생률은 각각 39.5%(17/43) 및 32.6%(14/43)였습니다. CR 및 PR 환자의 말초혈액에서 caspase{16}}/PI 이중 양성 세포 수가 기준선에 비해 현저히 감소했습니다(그림 4C). 또한 카스파아제 유도 사이의 상관관계를 확인했습니다.파이로프토시스및 SLEDA; 데이터는 말초혈액의 카스파제{0}}/PI 양성 비율이 SLEDAI와 양의 상관관계가 있음을 분명히 보여주었습니다(그림 4D). GSDMD 유래 억제제인 ​​Ac-FLTD-CMK는 LN의 발달을 방지했습니다(낭창신장증).

그림 4|병용 요법은 LN(루푸스 신염) 환자에서{1}}카스파제 매개 pyroptosis를 약화시켰습니다.

(A) LN의 말초혈액에 있는 카스파제{0}}/PI 이중양성 세포의 FACS(낭창신장증) 병용 요법으로 또는 병용 요법 없이 치료받은 환자.

(B) III형, IV형, V형, III형과 V형, IV형과 V형의 말초혈액에서 카스파제{0}}/PI 이중 양성 세포의 정량화(낭창신장증) 환자 및 건강한 피험자.

(C) LN의 말초 혈액에서 카스파제-1/PI 이중 양성 세포의 정량화(낭창신장증) 기준선, CR, PR 및 병용 요법 후 비관해 환자.

(D) SLE-DAI와 카스파제{0}}/PI 이중 양성 세포 비율의 상관 관계 분석.

**p < 0.01.="" facs,="" 형광="" 활성화="" 세포="" 분류;="">낭창신장증), 낭창신장증; CR, 완전 관해; PR, 부분 관해; SLE-DAI, 전신성 홍반성 루푸스 질환 활성 지수.

최근 연구에 따르면 GSDMDhmice는 이미퀴모드 유도 SLE 모델에서 신장 C3 및 IgG 침착 증가, 더 심각한 신장 손상 및 사망률 증가를 발생시켰습니다.17 LN에서 GSDMD의 역할을 더 명확히 하기 위해(낭창신장증), MRL/LPR 마우스는 8-주령부터 Ac-FLTD-CMK21로 처리되었으며, 대조군에 대한 비히클이 사용되었습니다. 치료 8-주 후, 비히클과 Ac-FLTD-CMK 치료 그룹 간에 사망률이나 체중에서 차이가 발견되지 않았습니다. 비히클 대조군 마우스와 비교하여 Ac-FLTD-CMK 처리된 MRL/LPR 마우스는 더 낮은 소변 알부민-크레아티닌 비율(그림 5A), 더 낮은 혈청 크레아티닌 농도(그림 5B), 감소된 사구체 경화증(그림 5C) 및 CD3를 가졌다. , CD4 및 CD68 양성 세포 침윤(그림5D). 면역조직화학 결과는 ELISA에 의해 결정된 GSDMD의 감소된 발현(그림 5D) 및 억제된 혈청 IL{20}} 분비를 보여주었다(그림 5E). 종합적으로, 데이터는 Ac-FLTD-CMK가파이로프토시스LN의 영향을받는 신장에서 (낭창신장증).

그림 5|GSDMD 유래 억제제인 ​​Ac-FLTD-CMK는 LN(루푸스 신염)의 발병을 예방했습니다.

(A) GSDMD 억제제가 제공되거나 제공되지 않은 MRL/LPR 마우스에서 소변 알부민 대 크레아티닌 비율을 계산했습니다.

(B) GSDMD 억제제가 제공되거나 제공되지 않은 MRL/LPR 마우스의 혈청 크레아티닌.

(C) 과요오드산-쉬프(PAS) 및 정량 사구체 경화증 백분율로 염색된 신장 표본의 대표적인 이미지.

(D) CD3, CD4, F4/80 및 GSDMD의 면역화학 염색. (E) GSDMD 억제제가 제공되거나 제공되지 않은 MRL/LPR 마우스에서 혈청 IL{4}}b 농도의 정량화.

데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. #p < {{0}}.05,="" ##p=""><>

논의

병용 요법은 CR 및 전체 반응률이 더 높고 관해 시간이 짧고 부작용이 적기 때문에 유망한 전략입니다. 지금까지 병용 요법의 근본적인 분자 메커니즘은 알려져 있지 않았습니다. 최근에 Fu et al.(6)은 MRL/LPR 마우스를 단독 요법 또는 병용 요법으로 치료하고 전체 신장에 대한 포괄적인 전사체 분석을 수행했습니다. 흥미롭게도 그들은 단독 요법이 아닌 병용 요법이 caspase{1}} 발현을 특이적이고 독특하게 억제한다는 것을 발견했습니다.

NLRP3/ASC/caspase{1}} inflammasome은 이제 LN의 발병기전에 주요 기여자로 인식되고 있습니다(낭창신장증). 족세포의 NLRP3 인플라마좀은 루푸스에 걸리기 쉬운 쥐와 LN 환자에서도 활성화됩니다.낭창신장증). NLRP3 inflammasomes가 caspase{1}} 억제제로 억제되었을 때, 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스에서 단백뇨, 신장 조직학적 병변 및 족세포 족돌기 소실이 개선되는 것으로 나타났습니다(8). Huang et al. (27) NLRP3가 LN의 관 세포에서 발현된다고 보고했습니다(낭창신장증) 클래스 IV 및 NLRP3 활성화는 LN 환자의 활성 지수 점수와 양의 상관 관계가 있습니다. Caspase{1}}는 루푸스와 혈관 기능 장애에서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었으며 따라서 새로운 치료 개입의 잠재적 표적입니다(28). RIP3(29), P2X7 수용체 길항제(30), GSK{8}} 억제제(31) 및 Nrf2 작용제(32)와 같은 새로운 실험 약물은 LN의 발달을 억제했습니다(낭창신장증) MRL/LPR 마우스에서 NLRP3/ASC/caspase-1 inflammasome 활성을 조절하여 LN에서 NLRP3/ASC/caspase-1 inflammasome의 중요성과 중요성을 강조합니다. IL{4}}의 상승된 혈청 농도는 SLE 환자의 질병 중증도 및 신장 손상/관련 정도와 상관관계가 있습니다(33). 우리가 아는 한, gasdermin 가족은 발달에 필수적일 수 있습니다.파이로프토시스그러나 SLE 환자에서 GSDMD/GSDME의 존재에 대한 증거가 부족합니다.

전반적으로, 우리는 LN에서 채취한 신장 생검 표본에서 GSDMD의 활성화와 발현을 조사했습니다(낭창신장증) 환자 및 MRL/LPR 마우스. GSDMD는 사구체 족세포 및 세뇨관 세포 및 침윤된 간질 세포에서 강력하게 유도되고 절단되었다. 그 후, MRL/LPR 마우스에 MMF, 타크로리무스, 프레드니손 또는 비히클의 조합을 제공했습니다. 비히클 대조군과 비교하여 caspase{0}} 및 GSDMD의 활성화는 병용 처리군에서 감소했습니다. 정도파이로프토시스말초혈액에서도 LN이 훨씬 낮았습니다(낭창신장증) 병용 요법 투여 후 환자. 더구나,파이로프토시스말초혈액에서 SLEDAI와 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다.파이로프토시스말초 혈액에서 SLE 활성에 대한 중요한 마커로 작용할 수 있습니다. 따라서 우리는 병용 요법이 LN에 유익한 효과를 줄 수 있다고 가정했습니다(낭창신장증) 억제함으로써파이로프토시스caspase{0}}/GSDMD에 의해 유도됩니다. Ac-FLTD-CMK와의 복합체에서 caspase-1의 이전 결정 구조 연구에서는 caspase-1에 의한 GSDMD 인식을 방해하는 많은 효소-억제제 상호작용이 밝혀졌습니다. 그러나 우리는 GSDMD 유래 억제제로 작용하는 Ac-FLTD-CMK가파이로프토시스LN에서 (낭창신장증), 이는 다른 메커니즘에 의해 유발될 수 있습니다.

최근에 TLR{0}}유도 SLE의 쥐 모델(34)에서 GSDMD-/-마우스가 더 큰 정도의 신장 손상과 사망률을 증가시켰으며, 이는 처음에 GSDMD 결실이 보호 효과가 있고 전신 염증 및 관련 사망률 증가와 관련된 자가항체 생성. GSDMD 결핍 마우스는 야생형 마우스에 비해 신장 표본에서 사구체 면역 복합체의 더 두드러진 침착과 더 높은 단백뇨를 발생시킵니다. 세포외 HMGB1의 향상된 분비는 GSDMD-/림프구에서도 발견되었으며, 이는 괴사/파이로프토시스GSDMD가 없을 때 발생했습니다.

Caspase{0}} 트리거파이로프토시스GSDMD 절단에 의해. 대조적으로, GSDMD-결핍 또는 GSDMD-낮은 세포에서, caspase-1는 apoptosis를 유발한 다음 GSDME-의존성 이차 괴사를 유발하고파이로프토시스. 치료 후 GSDMD 활성이 없는 경우 GSDME는 카스파제 매개 세포자멸사를 다음으로 전환할 수도 있습니다.{0}파이로프토시스(35,36). 또한, 카스파제-8의 활성화는 GSDMD가 결핍된 대식세포에서 훨씬 강화되었습니다. caspase-8의 상당한 활성화는 TLR7-유도 GSDMD 결핍 LN에서도 발견되었습니다(낭창신장증) 쥐(34). 따라서 GSDMD가 없는 경우 caspase-1가 caspase-8와 협력하여 caspase-3-GSDME 매개 세포자멸사가 다음으로 전환되도록 합니다.파이로프토시스LN에서 (낭창신장증), 추가 실험적 조사가 필요한 가설.

현재 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 현재 데이터를 기반으로 병용 요법이 억제할 수 있음을 확인했습니다.파이로프토시스, 그러나 스테로이드와 MMF의 이중 요법, 스테로이드와 타크로리무스 또는 항-CD20 항체의 이중 요법과 같은 다른 치료법도 유사한 효과를 가질 수 있습니다. 둘째, caspase-1에 대한 병용 요법의 억제 효과에 대한 정확한 분자 기전이 잘 조사되지 않았습니다. 마지막으로, 우리는 SLE-DAI와 함께 말초혈액의 caspase-1/PI 이중 양성 세포의 관계와 후향적 LN에서 병용 요법 치료 전후의 변화를 관찰합니다(낭창신장증) 환자 코호트. 질병 활성 및 치료 반응에 대한 카스파제{0}}/PI 이중 양성 세포의 임상 예측 가치는 더 큰 전향적 코호트에서 더 조사해야 합니다.

전반적으로, 우리는 병용 요법이 카스파제{0}}/GSDMD 유도를 억제함으로써 유익한 효과를 부여한다는 것을 확인했습니다.파이로프토시스LN에서 (낭창신장증) 관련된 세포 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. 실제로, 병용 요법은 caspase{0}} 발현을 특이하고 독특하게 억제했습니다. NLRP3 및 caspase-1의 약리학적 또는 유전적 억제는 신장 기능을 개선하고 LN에서 자가 면역을 억제했습니다(낭창신장증). LN에서 caspase{0}}의 병태생리학적 역할(낭창신장증)는 추가 연구의 가치가 있으며 LN 환자에서 GSDMD를 표적으로 하는 요법(낭창신장증) 매우 신중하게 평가해야 합니다.

치료방법파이로프토시스

참조

1. 삭세나 R, 마하잔 T, 모한 C.낭창신장증: 현재 업데이트.Arthritis Res Ther (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. 개별화 치료낭창신장증. Kidney Int Rep(2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS. 클래스 V 플러스 IV의 성공적인 치료낭창신장증다표적 요법으로. J Am Soc Nephrol(2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al.의 유도 치료를 위한 다중 표적 요법낭창신장증: 무작위 시험, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al. 유지 치료를 위한 다중 표적 요법낭창신장증. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al. 전사체 분석은낭창신장증. Kidney Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. 우마리노 D.낭창신장증: NLRP3 Inflammasome은 족세포 기능 장애를 유발합니다. Nat Rev Rheumatol(2017)13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9