Cistanche Salsa의 Tubuloside B는 1-메틸{2}}페닐피리디늄 이온 유도 세포자멸사 및 산화 스트레스로부터 PC12 신경 세포를 구합니다

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Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

추상적인:

신경보호cistanche의 tubuloside B 효과, 중국에서 분리된 페닐에타노이드 중 하나약초 시스탄체 살사, 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(MPP plus)에 의해 유도된 세포자멸사 및 PC12 신경 세포의 산화 스트레스에 대해 조사했습니다. MPP +로 처리된 PC12 세포는 MTF 분석, 유세포 분석 및 DNA 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같이 세포 사멸을 겪었습니다. 활성 산소 종(ROS)의 세포내 축적은 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSCM)으로 DCFH-DA 염색에 의해 측정되었습니다. tuhuloside B 동시 처리는 MPP+로 유도된 세포 독성, DNA 단편화 및 ROS의 세포 내 축적을 현저하게 약화시켰습니다. 이러한 결과는 tubuloside B가 MPP에 의한 세포자멸사 및 산화 스트레스를 예방한다는 것을 강력하게 나타냅니다. Tubuloside B는 다음과 같이 적용될 수 있습니다.항파킨슨병자치령 대표.

소개

병리학적으로, 산발성 파킨슨병(PD)은 일반적으로 카테콜아민성 신경세포, 특히 흑색질(SNc)의 도파민성 신경세포의 소실과 특징적인 신경내| 영향을 받는 뇌 영역에 있는 Lewy 몸이라고 하는 내포물. PD의 발병 기전에 다양한 요인이 관련되어 있음에도 불구하고 PD의 시작 및 진행과 관련된 메커니즘은 여전히 ​​불확실합니다. 과도한 자유 라디칼 생성에 의한 신경 세포 사멸 또는 세포 사멸 [1], [2], [3]. 흑색질 도파민성 시스템이 높은 수준의 자유 라디칼을 생성할 수 있고 상대적으로 낮은 수준의 항산화 방어 시스템을 갖는다는 사실은 이 가설을 더욱 뒷받침합니다. 생체 내 및 시험관 내 연구 모두에서 도파민성 뉴런에 대한 l-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)의 활성 대사산물인 MPP+의 산화 스트레스 매개 신경독성을 보여주었습니다[4 ], [5]. PD와 같은 신경퇴행성 장애의 주요 원인으로서 산화 스트레스에 의해 과도하게 생성된 자유 라디칼의 관련은 항산화제의 중추적 역할을 시사합니다. Tubuloside B(그림 1)는 줄기에서 분리된 페닐에타노이드 화합물 중 하나입니다.시탕슈 살사. 이전 연구에서는 tubuloside B를 포함한 많은 페닐에타노이드가 강력한 자유 라디칼 소거 활성을 나타냄을 발견했습니다[6], [7].

이러한 결과를 고려하여 본 연구에서는 수년 동안 뉴런 기능 연구에 성공적으로 사용되어 온 교감 신경 갈색세포종 세포주 PC12를 사용하여 시험관 내에서 MPP 플러스 유도 신경독성에 대한 tubunside B의 영향을 조사했습니다[8], [9].

항파킨슨병:시스탄체

재료 및 방법

재료

튜불로사이드 B시탕슈 살사Li Lei 박사(중국 베이징, 북경대학교 약학대학 천연물부)가 친절하게 제공했습니다. 화합물의 순도는 HPLC 분석에 의해 98% 이상이었다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM), 말 혈청 및 태아 송아지 혈청은 GIBCO BRL, 1-methyl~-phenylpyridinium ion(MPP plus), poly-L-lysine, 3-(4, 5 -디메틸티아졸-2 -일)-2,{10}} 디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT), 요오드화프로피듐(PI), RNase A, 프로테이나제 K 및 2;7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 (DCFH-DA)는 Sigma에서 구입했습니다.

세포 배양

PCI2 세포는 1% 말 혈청, 5% 소 태아 혈청, 100U/ml 페니실린 및 100ug/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지되었습니다. 세포는 37도에서 95% 공기와 5% CO2로 통기된 가습 인큐베이터에서 배양되었습니다. 모든 실험은 세포를 파종한 지 24-48시간 후에 수행되었습니다. 세포가 subconfluent 단계에 접근하고 1:8로 분할된 25cm 배양 플라스크에 플레이팅될 때 0.25% 트립신 처리에 의해 세포를 일상적으로 수확했습니다.

세포 생존력 분석

이전에 설명한 대로 수정된 MTT 분석법을 사용하여 세포 생존율을 결정했습니다[1{16}}]. 간단히 말해서 PC12 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 I × 104개 세포의 밀도로 시딩했습니다. 배양액을 48시간 동안 배양한 후 배지를 다양한 농도의 tubulnside B 또는 MPP+를 포함하는 배지로 변경했습니다. 최대 48시간 및 72시간 동안 배양한 후, MTr 용액(DMEM 중 5 mg/ml)을 96-웰 플레이트에 첨가하고 세포를 37도에서 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 200μL의 DMSO를 첨가하여 세포와 염료 결정을 가용화하고 모델 550 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad)를 사용하여 570nm(540nm 기준)에서 흡광도를 측정했습니다. 세포 생존도는 트립판 블루 배제 방법을 사용하여 분석되었습니다. 세포를 수집하고 부드럽게 펠렛화한 다음 0.6% 트립판 블루 용액으로 3회 비를 맞도록 염색했습니다. 무색 세포의 비율은 무작위로 선택된 10개의 현미경 분야에서 후속적으로 평가되었습니다. 양성 약물로는 100ng/ml EGF(Epidermal growth factor)를 사용하였다.

유세포 분석에 의한 세포자멸사 검출

아폽토시스 세포는 propidium iodide(PI)를 사용하여 유세포 분석에 의해 검출되었습니다[11]. 간단히 말해서, 시험 물질과 함께 배양된 약 1 × 106 세포를 원심분리에 의해 수확하고 PBS로 1회 세척하였다. 세포를 - 20도에서 24시간 동안 70% 에탄올로 고정하고 PBS로 1회 세척하였다. 그런 다음 세포를 0.5 mg/ml RNase 및 0.5 mg/ml PI를 함유하는 PBS 300μL에 재현탁시켰다. 어둠 속에서 30분 동안 더 배양한 후, FACScan(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)을 사용하여 유세포 분석을 수행했습니다.

단편화된 DNA만을 분리하는 Moore의 프로토콜[12]을 적용하고 각 테스트 그룹에서 동일한 수의 배양을 사용하여 실험을 정규화했습니다. 간단히 말해서, 처리된 각 샘플에서 3 × 1{20}}6개의 뉴런을 Hank의 평형염 용액(1{14}}g, 10분)으로 세척하고 튜브 바닥에 형성된 펠릿을 균질화했습니다. 1ml 용해 완충액(pH 7.4에서 10mM Tris. 5mM EDTA, 1% Triton X{11}})으로 얼음 위에서 20분 동안 11,{25}} g에서 4도에서 20시간 동안 원심분리한 후, 단편화된 DNA를 포함하는 상청액을 제거하고 37도에서 1시간 동안 20mg/ml RNase A로, 56도에서 0.1mg/ml 프로테이나제 K로 분해했습니다. 추가 1시간 동안. 단편화된 DNA를 페놀과 클로로포름을 사용하여 추출하고 4C에서 1시간 동안 10g에서 원심분리했습니다. 수상을 새로운 Eppendorf 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 에탄올 2부피와 혼합한 다음 DNA를 침전시키기 위해 최소 1시간 동안{30}} 도에 두었습니다. 15,{38}}g에서 4도에서 20분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 DNA 펠렛을 80% 에탄올로 1회(4도에서 15분 동안 15,000g) 세척하고 공기 건조하고 20μL TE에 용해했습니다. pH 7.6에서 완충액. 그런 다음 전체 샘플을 1.5% 아가로스 겔에서 85V에서 1시간 동안 전기영동했습니다. 겔을 검사하고 Ultra Violet Products Gel Documentation System(GELDOC{49}}, Bio-Rad, USA)으로 사진을 촬영했습니다.

세포내 ROS 형성 측정

세포 내 과산화물의 형성은 비형광성 화합물인 2"7"-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)를 사용하여 공초점 주사 레이저 현미경으로 감지되었습니다. ;7"-디클로로플루오레신. 2",{10}}디클로로플루오레신은 수소화산화방지제에 의해 형광성 2"7"-디클로로플루오레세인(DCF)으로 산화될 수 있습니다. 세포를 37도에서 30분 동안 10μM DCFH-DA와 함께 인큐베이션하였다. 배양물을 Hank의 균형 염 용액으로 두 번 세척하고 동일한 배지에서 이미지화했습니다. 공초점 주사 레이저 현미경을 사용하여 이미징을 수행했으며, DCF는 488nm에서 여기되었고 방출 필터는 510nm 장벽 필터였습니다. 유효한 비교를 제공하기 위해 모든 관찰에 대해 동일한 획득 매개변수를 사용했습니다. 셀의 중간에 최적의 수직 위치를 설정한 다음 필드를 빠르게 스캔했습니다. 488 nm의 여기 파장에서의 조명은 이 염료의 산화로 인해 형광 증가를 일으키기 때문에 각 필드는 정확히 동일한 시간 동안 빛에 노출되었습니다. 무자극 세포의 기준값을 대조군 값으로 사용하여 튜불로사이드 B의 존재 또는 부재 하에 MPP 처리된 세포와 비교했습니다. 스캐닝 후, 현미경 필드당 15-20 뉴런 세포체의 평균 상대 형광 강도를 4단계로 정량화했습니다. 처리 조건에 따라 별도의 배양.

시스탄체

통계 분석

얻어진 모든 값은 평균 ±SD로 표현되었습니다. 그룹 간의 차이의 통계적 유의성은 Student's t-test에 의해 결정되었습니다. 0.05 미만의 계산된 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

그림 2에서 볼 수 있듯이 MPP plus는 PCI2 세포의 생존력을 용량 의존적으로 감소시켰습니다. 대조적으로, 잘 알려진 신경영양 인자인 EGF는 100ng/mL에서 세포 생존을 유의하게 보호했습니다. MPP+로 유도된 세포독성 효과는 tubuloside B(5, 10, 50 또는 100ug-ml)의 존재에서도 약화되었습니다{11}} ), 비록 대조약보다 효능은 낮지만(그림 3). 이러한 농도의 튜불로사이드 B는 용량 의존적 방식으로 세포 보호 효과를 나타내었고 화합물 단독으로는 명백한 세포 독성을 일으키지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 48시간 동안 200μM MPP 플러스로 처리된 PCI 2 세포의 DNA 추출물의 겔 전기영동은 DNA 래더링을 보여주었습니다. 세포 사멸의 전형적인 특징인 tubuloside B는 10 및 100μg·ml의 용량에서 DNA 사다리의 형성을 유도합니다(그림 4). 그림 5는 PC12 세포에서 MPP+에 의해 유도된 세포 사멸의 유세포 분석의 전형적인 히스토그램을 보여줍니다. tubuloside의 존재 또는 부재 B．PI를 사용한 세포 주기 프로파일의 정량화는 세포자멸사 DNA 단편화를 나타내는 이배체 특성(M1 영역)을 가진 세포의 수를 나타냅니다. 처리되지 않은 세포에서 apoptotic subdiploid fraction은 총 10000개 세포의 5.94%까지 최소였습니다(그림 5A). MPP+에 48시간 노출 후, 세포자멸사 비율은 43.02;j;(그림 5B)로 증가했습니다. 세포 배양물에 첨가했을 때, 튜불로사이드 B는 용량 의존적으로 MPP+ 유도된 세포자멸사를 억제했습니다. 10ug·ml-1농도에서 tubuloside B에 의한 보호는 통계적으로 유의하지 않았지만 50 및 1 00ug·ml-1에서 각각 45% 및 63% 감소했습니다. 그 결과 생존 세포의 비율이 증가하는 것으로 관찰되었습니다(그림 5D, E).

세포내 ROS의 축적은 DCFH-DA．PC12 세포를 200 uM MPP+로 48시간 동안 처리하여 DCFH-DA 염료로 염색한 후 세포 내부에 강한 형광을 나타냄으로써 감지할 수 있습니다(그림 6). 튜불로사이드 B 동시 처리(10 및 100ug·ml)는 MPP+一을 억제하여 ROS 생성을 유도했습니다(감소 비율은 각각 24.52% 및 55.63%).

논의

PD의 병인은 강한 산화 스트레스, 항산화 수준 감소 및 미토콘드리아 결함을 포함합니다. 모두 여러 세포 시스템에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있습니다. 특히 자유 라디칼은 뉴런에서 활성 세포 사멸을 유발하는 것으로 나타났습니다[14]. MPTP는 인간의 흑색선조체 도파민성 뉴런의 선택적 퇴화를 유발하는 비가역적이고 심각한 파킨슨병 유사 증후군을 유발합니다. 이 신경독은 PD의 동물 모델을 만드는 데 사용되었습니다[15]. MPTP는 모노아민 산화효소 B에 의해 MPP+로 전환되어 미토콘드리아에 축적됩니다. 미토콘드리아 복합체 I과 그 미토콘드리아 날을 억제합니다. 기능은 세포자멸사를 유발한다[16]. 따라서 MPP와 도파민성 뉴런에서 一유도된 신경독성은 신경보호제를 스크리닝하기 위한 PD의 병인 모델로 광범위하게 사용되었습니다.

본 연구에서 우리는 PC12 세포에서 산화 스트레스를 통한 MPP 플러스 유도된 세포 사멸이 튜불로사이드 B에 의해 감소되었음을 입증했습니다. 또한, 우리는 튜불로사이드 B가 MPP 플러스 유도 DNA 래더링에 대해 용량 의존적 방식으로 보호한다는 것을 입증했습니다. 및 DNA 겔 전기영동 및 유세포 분석을 사용하여 측정된 세포자멸사. 또한, 더 높은 농도의 tubuloside B를 동시에 처리하면 MPP에 의해 유도된 ROS 생성이 억제되었습니다. 따라서, tubuloside B는 다기능적으로 신경 보호 효과를 나타냈습니다. 여러 기전이 개별적으로 또는 연합하여 튜불로사이드 B의 작용에 관여할 수 있습니다. 항산화 효과는 튜불로사이드 B 매개 신경 보호에 대한 가능한 기전입니다. Xiong Q는 tubuloside B가 1,{8}}diphenyl-2-picrylhydrazyl 라디칼과 xanthine]xanthine oxidase 생성 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼에 대해 강력한 자유 라디칼 소거 활성을 나타냄을 발견했습니다[6].

몇몇 페닐에타노이드는 자유 라디칼 소거 특성을 갖고 산화 스트레스 유발 독성 상해를 보호하는 것으로 최근 보고되었습니다. 과산화수소, 슈퍼옥사이드 음이온, 하이드록실 라디칼과 같은 MPP 플러스에 의해 생성된 ROS는 생물학적 분자를 쉽게 손상시켜 궁극적으로 세포 사멸 또는 괴사를 유발할 수 있습니다. 따라서 tubuloside B는 ROS에 대한 직접적인 소거 효과를 가질 수 있습니다. 우리의 데이터는 튜불로사이드 B가 ROS 축적을 억제하는 역할을 하는 정확한 위치를 확립하지 않았지만 신경 보호 메커니즘이 항산화제 경로의 자극을 포함한다고 제안합니다. 튜불로사이드 B의 분자 구조에 대한 연구는 또한 그것이 자유 라디칼을 제거하는 강력한 능력을 가지고 있음을 나타냅니다(개인 커뮤니케이션).

다른 메커니즘도 적절할 수 있습니다. 예를 들어, 튜불로사이드 B는 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 개방과 기능 장애를 억제함으로써 MPP+의 독성을 상쇄하는 능력을 가질 수 있습니다. 또한, tubuloside B가 신경 세포에 직접적인 성장 촉진 효과가 있는지 여부도 고려해야 합니다. 튜불로사이드 B의 신경보호 작용의 정확한 기전은 불분명합니다. 신경 보호 효과의 전체 그림을 설명하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

결론적으로, Cistanche 살사 추출물의 tubuloside B는 MPP와 함께 유도된 세포 사멸 및 산화 스트레스에 대한 분명한 보호 효과가 있습니다. MPP + 독성에 대한 신경 보호 효과는 중요할 수 있으며 PD의 예방 및 치료에 치료 가능성이 있음을 시사합니다.

PD의 치료: cistanche

참고문헌

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