Cistanche Salsa의 Tubuloside B는 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온으로 유발된 세포사멸과 산화 스트레스로부터 PC12 신경 세포를 구출합니다
Apr 18, 2024
소개
병리학적으로 산발성 파킨슨병(PD)은 일반적으로 카테콜아민성 뉴런, 특히 흑질 치밀체(SNc)의 도파민성 뉴런의 손실과 특징적인 내부 뉴런의 존재를 특징으로 합니다. 영향을 받은 뇌 영역에 루이소체(Lewy bodies)라고 불리는 포함물이 있습니다. PD의 발병에 다양한 요인이 연루되어 있음에도 불구하고 PD의 시작 및 진행과 관련된 메커니즘은 불확실한 상태로 남아 있습니다. PD의 원인이 여전히 밝혀져 있음에도 불구하고 여러 가지 증거가 산화 스트레스와 관련이 있음을 강력히 시사하며, 최종적으로 PD의 원인은 다음과 같습니다. 과도한 자유 라디칼 생성으로 인한 신경 세포 사멸 또는 세포 사멸. 흑질의 도파민 시스템이 높은 수준의 자유 라디칼을 생성할 수 있고 상대적으로 낮은 수준의 산화 방어 시스템을 가지고 있다는 사실은 이 가설을 더욱 뒷받침합니다. 생체 내 및 시험관 내 연구 모두에서 도파민성 뉴런에 대한 l-메틸{2}}페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)의 활성 대사산물인 MPP ++의 산화 스트레스 매개 신경독성을 보여주었습니다. PD와 같은 신경퇴행성 질환의 근접 원인으로서 산화 스트레스에 의해 과도하게 생성된 자유 라디칼의 관여는 항산화제가 중추적인 역할을 한다는 것을 시사합니다. Tubuloside B(그림 1)는 Cistanche salsa의 줄기에서 분리된 페닐레타 노이드 화합물 중 하나였습니다. 이전 연구에서는 튜불로사이드 B를 포함한 많은 페닐에타노이드가 강력한 자유 라디칼 제거 활성을 보였다는 사실이 밝혀졌습니다.
이러한 결과를 고려하여 본 연구에서는 수년간 신경 기능 연구에 성공적으로 사용되어 온 교감 신경 갈색 세포종 세포주 PC12를 사용하여 in vitro에서 MPP{0}}유발 신경 독성에 대한 튜분사이드 B의 효과를 조사했습니다.
파킨슨병 예방을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%
재료 및 방법
재료
Cistanche Salsa의 Tubuloside B는 Li Lei 박사(중국 베이징 북경 대학교 약학부 천연물학과)가 친절하게 공급해 주었습니다. HPLC 분석 결과 화합물의 순도는 98% 이상이었다. Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 말 혈청 및 태아 송아지 혈청은 GIBCO BRL에서 구입했습니다. BRL, 1-메틸~-페닐피리디오니움 이온(MPP+ ), 폴리-L-리신, 3-(4,{ {8}}디메틸 티아졸-2 -yl)-2,5- 디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT), 프로피듐 요오다이드(PI), RNase A, 프로테이나제 K 및 2; 7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)는 Sigma에서 구입했습니다.
세포 배양
PCI2 세포는 10% 말 혈청, 5% 태아 송아지 혈청, 100U/ml 페니실린 및 100ug/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지되었습니다. 세포를 37도에서 95% 공기와 5% CO2로 환기된 가습 인큐베이터에서 배양했습니다. 모든 실험은 세포를 파종한 후 24-48시간 동안 수행되었습니다. 세포가 하위 컨플루언트 단계에 접근했을 때 세포를 0.25% 트립신화하여 정기적으로 수확하고 1:8로 분할된 25 cm 배양 플라스크에 플레이팅했습니다.
세포 생존력 분석
세포 생존율은 이전에 설명한 대로 수정된 MTT 분석을 사용하여 결정되었습니다[10]. 간단히 말해서, PC12 세포를 웰당 I × 104 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종했습니다. 배양물을 48시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 번사이드 B 또는 MPP+가 포함된 배지로 배지를 교체했습니다. 최대 48시간 및 72시간 동안 배양한 후, MTr 용액(DMEM 내 5mg/ml)을 96-웰 플레이트에 첨가하고 세포를 37도에서 4시간 동안 배양하도록 허용했습니다. 배지를 제거한 후, 세포 및 염료 결정에 200μL의 DMSO를 첨가하여 수용성 공급물이 되게 하고 모델 550 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad)를 사용하여 570nm(기준으로 540nm)에서 흡수를 측정했습니다. 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 세포 생존율도 분석했습니다. 세포를 수집하고, 부드럽게 펠렛화하고, 0.6% 트리판 블루 용액으로 3회 염색했습니다. 이어서 무작위로 선택된 10개의 현미경 영역에서 무색 세포의 비율을 평가했습니다. 양성약물로는 표피성장인자(EGF) 100ng/ml를 사용하였다.
자유라디칼 소거 활성을 위한 천연 시스탄체 튜불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%
유동 세포 계측법을 통한 세포 사멸 검출
아폽토시스 세포는 요오드화 프로피듐(PI)을 사용한 유세포 분석으로 검출되었습니다[11]. 간단히 말하면, 시험 물질과 함께 배양된 약 1 x 106 세포를 원심분리에 의해 수확하고 PBS로 1회 세척하였다. 세포를 70% 에탄올로 24시간 동안 - 20도에서 고정하고 PBS로 1회 세척했습니다. 그런 다음 세포를 0.5 mg/ml RNaseA 및 0.5 mg/ml PI를 함유한 300μL의 PBS에 재현탁시켰습니다. 암실에서 30분 동안 추가 인큐베이션한 후, FACScan(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)을 사용하여 유세포 분석을 수행했습니다.
전기영동을 통한 DNA 단편화 분석
우리는 단편화된 DNA만을 분리하는 Moore의 프로토콜[12]을 적용했으며 각 테스트 그룹에서 동일한 수의 배양액을 사용하여 실험을 정규화했습니다. 간단히 말하면, 처리된 각 샘플의 3 x 106 뉴런을 Hank의 평형 염 용액(1000g, 10분)으로 세척하고 튜브 바닥에 형성된 펠릿을 균질화했습니다. 1ml 용해 완충액(pH 7.4에서 10mM Tris, 5mM EDTA, 1% Triton X-100)을 사용하여 얼음 위에서 20분 동안 처리합니다. 11000g, 20rain, 4°C에서 원심분리한 후 조각난 DNA가 포함된 상등액을 제거하고 37°C에서 20mg/ml RNase A로 1시간 동안 분해하고 56°C에서 0.1mg/ml Proteinase K로 분해했습니다. 추가로 1시간 동안 단편화된 DNA를 페놀과 클로로포름을 사용하여 추출하고 1O000g에서 4C에서 1회 원심분리했습니다. 수성상을 새로운 Eppendorf 튜브로 옮기고 2배 부피의 얼음처럼 차가운 에탄올과 혼합한 다음 DNA를 침전시키기 위해 적어도 1시간 동안 20도에 두었습니다. 15,000g에서 4도에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 DNA 펠릿을 80% 에탄올로 1회 세척(4도에서 15분간 15,000g)한 후 공기 건조시킨 후 20μL에 용해시켰습니다. pH 7.6의 TE 완충액. 전체 샘플을 85V에서 1시간 동안 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 겔을 검사하고 Ultra Violet Products Gel Documentation System(GELDOC-2000, Bio-Rad, USA)을 사용하여 사진을 찍었다.
세포 내 ROS 형성 측정
세포 내 과산화물의 형성은 비형광 화합물인 2"7"-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)[13]를 사용하여 공초점 스캐닝 레이저 현미경으로 검출되었으며, 이는 내인성 에스테라제에 의해 세포 내에서 탈에스테르화되어 이온화된 자유 산, 2;7"-디클로로플루오레세인. 2",7-디클로로플루오레세인은 수소산화방지제에 의해 형광성 2"7"-디클로로플루오레세인(DCF)으로 산화될 수 있습니다. 세포를 10 μM DCFH-DA와 함께 37도에서 30분 동안 배양했습니다. 배양물을 Hank의 균형 잡힌 염 용액으로 두 번 세척하고 동일한 배지에서 이미지화했습니다. 이미징은 공초점 스캐닝 레이저 현미경을 사용하여 수행되었으며 DCF는 488nm에서 여기되었고 방출 필터는 510nm 배리어 필터였습니다. 유효한 비교를 제공하기 위해 모든 관찰에 동일한 획득 매개변수가 사용되었습니다. 셀 중앙의 최적의 수직 위치를 설정한 후 필드를 빠르게 스캔했습니다. 488 nm의 여기 파장에서의 조명은 이 염료의 산화로 인해 형광을 증가시켰기 때문에 각 필드는 동시에 빛에 노출되었습니다. 자극되지 않은 세포의 기준선 값은 MPP+ 처리된 세포와 존재 또는 부재를 비교하기 위한 대조 값으로 사용되었습니다.튜불로사이드 B. 스캐닝 후, 현미경 필드당 15-20 신경 세포체의 평균 상대 형광 강도를 처리 조건당 4개의 개별 배양물에서 정량화했습니다.
통계 분석
얻은 모든 값은 평균 ±SD로 표시되었습니다. 그룹 간 차이의 통계적 유의성은 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었습니다. 0.05 미만의 계산된 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
결과
그림 2에서 볼 수 있듯이 MPP+는 PCI2 세포의 생존력을 용량 의존적으로 감소시켰습니다. 대조적으로, 잘 알려진 신경 영양 인자인 EGF는 100ng/mL에서 세포 생존력을 크게 보호했으며 MPP+로 유발된 세포 독성 효과는 또한 튜불로사이드 B(5, 10, 50 또는 100 ug-ml{{12} }), 참조보다 효능은 낮지만
약물(그림 3). 이러한 농도의 Tubuloside B는 용량 의존적으로 세포 보호 효과를 나타냈으며 화합물 단독으로는 뚜렷한 세포 독성을 일으키지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 48시간 동안 200μM MPP+로 처리된 PCI 2 세포의 DNA 추출물의 겔 전기영동은 DNA 래더링(laddering)을 보여주었습니다. 세포사멸의 전형적인 특징인 Tubuloside B는 10 및 100μg·ml의 용량에서-1DNA 사다리의 형성을 유도했습니다(그림 4) ． 그림 5는 튜불로시드 B의 존재 또는 부재 하에 PC12 세포에서 MPP+에 의해 유발된 세포사멸의 유세포 분석에 대한 전형적인 히스토그램을 보여줍니다. PI를 사용한 세포 주기 프로파일의 정량화는 이배체 이하 특성을 갖는 세포의 수를 나타냅니다(M1 영역) 세포자멸사 DNA 단편화를 나타냅니다. 처리되지 않은 세포에서, 세포자멸사 이배체 부분은 전체 10000개 세포 중 5.94%까지 최소였습니다(그림 5 A). MPP+에 48시간 노출시킨 후, 세포사멸 비율은 43.02;j로 증가했습니다(그림 5 B). 세포 배양물에 첨가하면, 튜불로사이드 BMPP+-유발 세포사멸 억제용량 의존적으로. 10 ug·ml-1 농도에서 튜불로사이드 B에 의한 보호는 통계적으로 유의하지 않았지만, 50 및 1 00ug·ml-1에서는 각각 45% 및 63% 감소했습니다. 관찰되었다. 생존 세포의 비율 증가(그림 5D, E).
세포 내 ROS의 축적은 DCFH-DA를 사용하여 검출할 수 있습니다. 200 uM MPP+로 48시간 동안 처리한 PC12 세포는 DCFH-DA 염료로 염색한 후 세포 내부에서 강한 형광을 나타냈습니다(그림 6). Tubuloside B(10 및 100ug·ml 용량) 동시 처리는 MPP+1 유도 ROS 생성을 억제했습니다(감소율은 각각 24.52% 및 55.63%).
파킨슨병 치료용 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%
논의
PD의 발병기전에는 강한 산화 스트레스, 항산화 수준 감소, 미토콘드리아 결함이 포함됩니다. 모두 여러 세포 시스템에서 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있습니다. 특히, 자유 라디칼은 뉴런의 활성 세포 사멸을 유발하는 것으로 나타났습니다[14]. MPTP는 인간의 흑질선조체 도파민성 뉴런의 선택적 변성을 유발하는 비가역적이고 심각한 파킨슨병 유사 증후군을 생성합니다. 이 신경독은 다음을 생성하는 데 사용되었습니다. PD의 동물 모델을 먹었습니다.[15]．MPTP는 모노아민 산화효소 B에 의해 Mpp+로 전환되어 미토콘드리아에 축적됩니다. 미토콘드리아 복합체 I과 미토콘드리아 장애를 억제하는 곳입니다. 기능은 세포사멸을 유발합니다[16]. 따라서, 도파민성 뉴런에서 MPP+1로 유발된 신경독성은 신경보호제를 선별하기 위한 PD의 병인학적 모델로 광범위하게 사용되었습니다.
본 연구에서 우리는 PC12 세포에서 산화 스트레스를 통해 유발된 MPP+-세포 사멸이 튜불로사이드 B에 의해 감소되었음을 입증했습니다. 또한, 우리는 튜불로사이드 B가 MPP{{ 3}}DNA 겔 전기영동 및 유세포 분석을 사용하여 측정한 결과 DNA 사다리꼴 및 세포사멸이 유도되었습니다. 더욱이, 더 높은 농도의 튜불로사이드 B를 동시에 처리하면 MPP로 유발된 ROS 생성이 억제되었습니다. 따라서, 튜불로사이드 B는 다기능적으로 신경 보호 효과를 나타냈습니다. 여러 메커니즘이 개별적으로 또는 연관되어 튜불로사이드 B의 작용에 관여할 수 있습니다. 항산화 효과는 튜불로사이드 B 매개 신경보호에 대한 가능한 메커니즘입니다. Xiong Q는 튜불로사이드 B가 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질 라디칼과 크산틴]크산틴 산화효소 생성 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼에 대해 강력한 자유 라디칼 소거 활성을 나타냄을 발견했습니다.
몇몇 페닐에타노이드는 최근 자유 라디칼 소거 특성을 갖고 산화 스트레스로 인한 독성 손상을 보호하는 것으로 보고되었습니다. 과산화수소, 과산화물 음이온 및 하이드록실 라디칼과 같은 MPP+에 의해 생성된 ROS는 생물학적 분자를 쉽게 손상시켜 궁극적으로 세포 사멸 또는 괴사 세포 사멸을 초래할 수 있습니다. 따라서, 튜불로사이드 B는 ROS에 대해 직접적인 소거 효과를 가질 수 있습니다. 우리의 데이터는 튜불로사이드 B가 ROS 축적을 억제하는 정확한 위치를 확립하지 못했지만 신경 보호 메커니즘이 항산화 경로의 자극과 관련이 있음을 시사합니다. Tubuloside B의 분자 구조에 대한 연구는 또한 다음과 같은 강력한 능력을 가지고 있음을 나타냅니다.자유 라디칼 제거(개인 커뮤니케이션).
다른 메커니즘도 관련될 수 있습니다. 예를 들어, 튜불로사이드 B는 미토콘드리아 투과성 전이 공극의 개방과 기능 장애를 억제함으로써 MPP+의 독성에 대응하는 능력을 가질 수 있습니다. 또한, 튜불로사이드 B가 신경세포에 직접적인 성장촉진 효과를 갖는지도 고려해야 한다. Tubuloside B의 신경보호 작용의 정확한 기전은 아직 불분명합니다. 신경 보호 효과의 전체 그림을 밝히기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
결론적으로, 튜불로사이드 B는시스탄체 살사 추출물MPP+-유발 세포사멸 및 산화 스트레스에 대한 확실한 보호 효과가 있습니다. MPP + 독성에 대한 신경 보호 효과는 중요할 수 있으며 PD 예방 및 치료에 치료 잠재력이 있을 수 있음을 시사합니다.
파킨슨병 치료용 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%
