종양 세포는 종양 유전자에서 유래된 MHC-II 제한 에피토프를 CD4+ T 세포에 제시하지 못합니다.
Oct 09, 2023
CD4+ T 세포는 MHC 클래스 II(MHC-II)에 제시된 펩타이드 항원을 인식하여 항종양 면역에 중요한 역할을 합니다. 일부 고형암은 MHC-II를 발현하도록 유도될 수 있지만, 이것이 종양 특이적 CD{4}} T 세포에 의해 직접 인식을 가능하게 하는 정도는 불분명합니다. 우리는 두경부 편평 세포 암종 환자의 2가지 종양 단백질, HPV-16 E6 및 활성화 KRASG12V 돌연변이에 특이적인 자연적으로 프라이밍된 CD{5}} T 세포로부터 T 세포 항원 수용체(TCR)를 분리하고 특성화했습니다. 및 췌관 선암종에 대해 각각 연구하고 자가 또는 인간 백혈구 항원 일치 항원 발현 종양 세포를 인식하는 능력을 확인했습니다. 우리는 두 경우 모두에서 항원이 내인성으로 발현되어 엔도솜 경로로 향했지만 종양을 인식하지 못한 경우 TCR이 관련 MHC-II 또는 B 세포 항원 제시 세포(APC)를 발현하는 펩타이드가 탑재된 표적 세포를 인식할 수 있음을 발견했습니다. IFN-에 의한 표면 MHC-II 발현 유도 후에도 소스 단백질을 발현하는 세포 또는 CIITA를 이용한 형질도입. 이러한 결과는 핵(E6)과 막 관련(KRAS) 종양 단백질 모두의 프라이밍 및 기능적 인식이 MHC-II를 발현하도록 유도된 종양 세포의 직접적인 인식을 통하기보다는 교차 제시 APC에 주로 국한되어 있음을 시사합니다.
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소개
체세포의 악성 형질전환은 세포 성장 경로를 조절하지 못하고 확인되지 않은 증식을 일으키는 활성화된 종양유전자의 작용에 의해 시작됩니다(1). HPV 관련 암의 경우, HPV 초기 유전자 E6 및 E7의 발현은 각각 종양 억제 유전자 p53 및 Rb를 억제하여 종양 발생에 기여합니다(2). 대안적으로, 구성적 종양유전자 활성화는 RAS 계열과 같은 세포 성장 및 증식 경로를 조절하는 유전자의 체세포 돌연변이를 통해 발생할 수 있습니다. 실제로 KRASG12V와 같은 KRAS 돌연변이 활성화는 췌장암, 결장암, 폐암 환자에게서 흔히 발견됩니다(3). 종양유전자는 질병을 촉진하지만 숙주 면역 체계의 표적을 제공할 수도 있습니다. 최근 몇 년 동안 HPV 관련 암을 통제하는 데 있어 면역 체계의 역할이 널리 인식되었습니다. HPV E6 및 E7뿐만 아니라 기타 HPV 단백질을 인식하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포가 HPV 관련 환자의 말초 혈액 및 종양 침윤 림프구(TIL)에서 확인되었습니다. 암 (4-6). 치료용 암 백신과 TIL 또는 TCR 조작 T 세포를 이용한 입양 세포 요법(ACT)을 포함하여 이러한 항원을 표적으로 하는 면역요법은 전임상 및 임상 연구의 활발한 영역입니다(2). 발암성 돌연변이에 대한 T 세포 반응도 널리 설명되어 있습니다(7-9). 또한, 돌연변이 KRAS를 표적으로 하는 TIL을 포함하는 ACT가 객관적인 반응을 촉진할 수 있다는 직접적인 임상 증거가 있습니다(10). 종양유전자에서 유래된 에피토프를 인식하는 CD8+ T 세포가 종양 세포에 대한 직접적인 세포독성을 매개하지만(11-13), 항종양 면역에서 CD4+ T 세포의 역할은 잘 알려져 있지 않습니다. 최근 연구에서는 인간 암에서 그랜자임 B(GrzmB)와 같은 세포독성 마커를 발현하는 CD{27}} T 세포의 하위 집합이 강조되었습니다(14, 15). 그러나 이들 세포의 항원 특이성과 그에 따른 치료 가능성은 아직까지 거의 알려져 있지 않습니다. 더욱이, 이러한 세포독성 CD{30}} T 세포가 종양 세포를 인식하고 죽이기 위해서는 종양 세포가 MHC-II를 발현해야 할 뿐만 아니라 관련 항원도 적절한 제시 경로로 유도되어야 합니다. 본 연구에서는 종양 단백질 HPV{33}} E6 및 KRASG12V에 특이적인 CD{32}} T 세포가 항원 발현 종양 세포를 인식하는 능력을 조사했습니다. 두 TCR 모두 내인적으로 처리되어 HLA 일치 B 세포의 엔도솜 구획으로 향하는 항원을 직접 인식할 수 있었지만, 둘 다 MHC-II의 발현이 유도된 항원 발현 종양 세포를 인식할 수 없었습니다. 전반적으로, 우리의 결과는 특정 항원만이 MHC-II+ 종양 세포에 직접적으로 제시되며, 이는 종양 세포를 직접 인식하고 제거할 수 있는 CD{42}} T 세포의 풀을 제한할 수 있음을 시사합니다.
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결과
두경부 편평 세포 암종의 TIL에서 HPV-16 E6-특이적 CD4+ 및 CD{3}} T 세포 반응을 식별합니다. 우리는 HPV-16+ 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)이 있는 환자(Hu-56)로부터 2~4mm 종양 조각에서 분리된 일련의 개별 TIL 배양물을 스크리닝했습니다(보충 표 1, 보충 자료). 다음으로 구성된 펩타이드 풀을 사용하여 HPV{14}} 바이러스 종양 단백질 E6 및 E7에 대한 T 세포 반응을 확인하기 위한 IFN-ELISPOT 분석을 통해 이 기사를 온라인으로 확인할 수 있습니다(https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1). E6 및 E7 단백질의 길이에 걸쳐 겹치는 15-머. 특히, TIL 단편 12 및 29는 E6 펩타이드 풀로 재자극할 때 배경 위에 상당한 수의 반점을 생성하고 CD{23}} 및 CD{24}} T 세포를 모두 포함했습니다(그림 1A 및 보충 그림 1A). 관련 T 세포 하위 집합을 확인하기 위해 우리는 사이토카인 분비 분석을 사용하여 이러한 TIL 배양을 분석했습니다. 이를 통해 TIL 단편 29(F29)에는 E6-반응성 CD8+ T 세포가 포함되어 있는 반면, 단편 12(F12)에는 CD4+ 및 CD{34}} T 세포가 모두 포함되어 있음이 밝혀졌습니다. E6 펩타이드 풀을 인식합니다(그림 1B). CD{37}} T 세포 중 어느 것도 E6 재자극에 반응하여 IL-5을 생성하지 않았으며 이는 Th1-유사 표현형을 검증합니다. E6-특이적 TIL의 TCR 클론성을 확인하기 위해 F12에서 단일 IFN 분비 CD4+ T 세포를, F12와 F29에서 CD{45}} T 세포를 분류했습니다. TCR 시퀀싱을 통해 IFN- 분비 CD4+ T 세포(시퀀싱된 31개 세포 중 n= 31)에 의해 발현되는 단일 TCR과 IFN- 분비 CD{{53에 의해 공유되는 단일 TCR 클론이 밝혀졌습니다. }} F12와 F29 모두의 T 세포(각각 시퀀싱된 38개 세포 중 n{56}} 및 38개 세포 중 37개)(보충 표 2). 이러한 결과는 E6에 반응하는 단일클론 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 이 환자의 TIL 내에 존재함을 나타냅니다. HLA-A*02:01 – TIL의 제한된 CD8+ T 세포는 환자 유래 종양 세포주에서 제시된 E6을 인식합니다. F29의 TIL은 E629-38 펩타이드로 재자극되었을 때 IFN-을 생성했는데, 이는 F29 TCR이 이전에 설명한 HLA-A*02:01 제한 에피토프를 인식했음을 시사합니다(보충 그림 1B)(11). 이는 E629-38/HLA-A*02:01을 사용하여 인간 CD8을 발현하는 TCR 결핍 J76 세포에 라벨을 붙이고 이전에 설명한 E628-38 특이적 TCR을 양성으로 사용하는 사량체 결합 연구를 통해 확인되었습니다. 제어(그림 2A)(11). 적정 농도의 E629-38 펩타이드로 펄스된 자가 B 림프구 세포주(B-LCL)로 자극한 후 J76에서 급성 활성화 마커 CD69의 상향 조절에 의해 입증된 것처럼 두 TCR 모두 유사한 수준의 기능적 결합력을 나타냈습니다(그림 2, B와 C). 이러한 데이터는 임상 환경에서 테스트된 TCR과 기능적 특성이 유사한 E6의 알려진 에피토프에 특이적인 CD{95}} T 세포 클론의 존재를 검증합니다(16). 다음으로 우리는 E6-특이적 CD8+ TCR이 내인성으로 발현된 항원을 인식하여 항종양 세포독성을 중재할 수 있는지 여부를 확인하려고 했습니다. 이를 위해 우리는 잘 특성화된 HLA-A*02:01+ HPV-16+ 종양주인 CaSki와 다음을 통해 생성된 자가 종양 세포주인 HNSCC-56를 사용했습니다. 시험관 내 세포독성 분석에 대해 이전에 설명한 대로(17) 원발성 종양 조직의 세포 재프로그래밍. RNA-Seq 분석은 원발 종양 샘플과 자가 세포주 모두에서 E6를 포함한 HPV{108}} 초기 유전자의 발현을 검증했습니다(보충 그림 1C). F29 TCR을 발현하는 1차 인간 CD8+ T 세포는 시험관 내에서 다양한 효과기 대 표적 비율로 CaSki와 HNSCC-56 모두의 세포 사멸을 중재할 수 있습니다(그림 2, D 및 E). 함께, 이들 데이터는 F29 TCR이 내인성으로 발현된 E6 항원을 인식한다는 것을 입증합니다. TIL에서 HLA-DQ 제한 E6-특정 CD4+ T 세포 식별. 추가 기능 분석을 위해 E6-특정 TIL을 확장하기 위해 이전에 설명한 OKT-3와 함께 빠른 확장 배양 프로토콜을 사용하고 조사된 동종 PBMC를 사용하여 F12에서 TIL을 확장했습니다. 1차 F12 배양물에는 원래 E6 반응성을 갖는 CD8+ 및 CD4+ T 세포가 모두 포함되어 있었지만 급속 확장 후 최종 세포 생성물에는 99% CD{130}} T 세포가 포함되어 있었으며 그 중 약 38.33개였습니다. %는 IFN-에 대한 세포내 사이토카인 염색에 의해 입증된 바와 같이 E6에 대한 반응성을 입증했습니다(그림 3A).
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IFN- 외에도 자극된 E6-특이적 CD4+ TIL은 TNF-를 분비할 수 있지만 IL-2은 분비할 수 없습니다(보충 그림 2A). GrzmB+ 세포의 총 빈도는 항원 자극으로 증가하지 않았지만 TNF-분비 세포에 대한 게이팅은 E6-특이적 CD4+ TIL이 비특이적 TIL보다 저장된 세포내 GrzmB를 더 많이 포함하고 있음을 보여주었습니다(보충 그림 2B). ). IFN-분비 CD4+ TIL은 또한 종양 반응성 CD4+ TIL의 공개된 시그니처와 일치하는 공동 억제 마커 프로그래밍된 세포 사멸 1(PD{14}})을 표현했습니다(보충 그림 2C)( 18, 19). E6-특정 CD4+ TIL은 이러한 세포가 1ug/mL 미만의 펩타이드 농도에서 사이토카인을 분비할 수 있기 때문에 높은 기능적 결합력을 보여주었습니다(그림 3B). F12 TIL 배양의 특이성을 결정하기 위해 원래 E6 풀에 포함된 37개 펩타이드 각각에 해당하는 개별 펩타이드로 자가 B-LCL을 펄스했습니다(보충 표 3). F12의 CD4+ TIL은 11개 아미노산 핵심 서열을 공유하는 펩타이드 E61-15 및 E65-19로 자극될 때 IFN-을 분비했습니다(보충 그림 2D). HLA 차단 Ab가 있는 경우의 공동배양 실험에서는 B-LCL이 항HLA-DQ Ab로 차단되었지만 항HLA-DR 또는 이소형 대조 Ab로 차단되지 않은 경우 TIL에 의한 IFN 분비가 크게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 3C). 어떤 HLA-DQ 대립유전자가 이 에피토프의 발현을 담당하는지 확인하기 위해 우리는 알려진 HLA-DQ 대립유전자(보충 표 4)를 E61-15로 표현하는 B-LCL을 펄스화하여 HLA-DQA1*01을 발현하는 KAS011 세포를 발견했습니다. :02 및 DQB1*05:02(DQA1*05:05 및 DQB1*03:01을 발현하는 Hu{55}} B-LCL은 자가 Hu와 유사한 방식으로 TIL에 항원을 제시할 수 있음) } B-LCL(그림 3D). 마지막으로, 우리는 이전에 확인된 TCR 서열이 실제로 E6 인식을 담당하는지 확인하려고 했습니다. 일차 인간의 건강한 기증자 CD4+ T 세포에서 F12 TCR의 발현은 CD69 및 PD-1의 상향 조절에 의해 입증된 바와 같이 E61-15 펩타이드의 인식을 촉진하기에 충분했습니다(그림 3E). ). 종합하면, 이러한 결과는 단일클론 CD4+ TIL에 의해 인식되는 E6의 HLA-DQ 제한 에피토프의 식별을 보여줍니다. E6-특이적 CD4+ T 세포는 MHC-II를 발현하는 자가 종양 세포를 인식하거나 죽이지 않습니다. 최근 연구에서는 일부 인간 암에서 세포독성 CD{79}} TIL의 유전적 특징이 확인되었습니다(14, 15). 그러나 세포독성 CD{82}} T 세포가 HPV 유발 암에서 역할을 하는지 여부는 알려져 있지 않습니다. TIL의 E6-특이적 CD4+ T 세포가 HNSCC-56를 직접 인식할 수 있는지 확인하기 위해 먼저 MHC-II 발현 상태를 조사했습니다. 종양 세포는 배양물에서 검출 가능한 표면 MHC-II를 발현하지 않았지만, 72시간 동안 IFN-로 처리하면 MHC-II의 상향 조절을 유도하기에 충분했습니다(그림 4A). 다음으로 CD4+ F12 TIL을 사용하여 HNSCC-56를 배양했습니다. 중요하게도, IFN-로 전처리된 MHC-II+ 종양 세포는 IFN-분비로 측정했을 때 CD{99}} TIL을 자극할 수 없었습니다(그림 4B).
그림 1. HPV-16+ HNSCC의 E6-반응성 CD4+ 및 CD{3}} TIL 식별. (ㅏ)
그림 2. Hu-56 TIL의 HLA-A*02:01 제한 E6-특정 TCR의 기능적 특성. (ㅏ)
그러나 TIL을 첨가하기 전에 E61-15로 펄스된 IFN 처리 종양 세포주는 T 세포 반응을 자극할 수 있었으며 이는 내인적으로 발현하는 세포주에서 제한적인 HLA-DQ 대립유전자의 표면 발현을 나타냅니다. E6은 종양 인식에 충분하지 않았지만 표적 펩티드의 외인성 로딩이 필요했습니다. 외인성 표적 펩타이드 로딩에 대한 동일한 요구 사항이 CIITA 형질도입 종양 세포(HNSCC-56 CIITA)에서 관찰되었으며, 이는 구성적으로 높은 수준의 표면 MHC-II를 발현합니다(그림 4B). CD4+ TIL이 APC에서 내인적으로 처리되고 제시된 버전의 E6 에피토프를 인식할 수 있는지 테스트하기 위해 MHC-에 융합된 E6의 처음 50개 아미노산을 인코딩하는 발현 구조를 사용하여 자가 B-LCL을 레트로바이러스 방식으로 형질도입했습니다. I 막횡단 도메인(E6-MITD)은 융합된 아미노산 서열의 원형질막 위치화를 유도하고 엔도솜 트래피킹을 통해 MHC-II에 대한 제시를 지원합니다(20). E6-MITD 구조를 발현하는 B-LCL은 E6-특이적 CD{20}} TIL을 자극할 수 있으며, 이는 이러한 TIL에 의해 인식되는 펩타이드 에피토프가 다음과 같은 경우에 자연적으로 처리되어 MHC-II에 제시될 수 있음을 나타냅니다. 적절한 경로로 이동합니다(그림 4C).
그림 3. 클론 확장, HLA-DQ 제한, E6-특이적 CD4+ TIL의 기능적 특성. (ㅏ)
다음으로, F12 E6-특이적 CD4+ TIL이 직접적인 종양 세포독성을 나타낼 수 있는지 여부를 확인하려고 했습니다. 당사의 인식 분석 데이터와 일관되게 E6-특이적 CD4+ TIL은 MHC-II를 발현하지 않는 HNSCC-56 종양 세포의 성장을 제한할 수 없었습니다(그림 4D). . 또한, HNSCC-56 CIITA 종양 세포도 CD4+ TIL 존재 시 억제되지 않고 성장했습니다. 그러나 E61-15 펩타이드로 펄스된 HNSCC-56 CIITA 종양 세포의 성장은 효과기 세포 용량 의존 방식으로 억제되었습니다. 전반적으로, 이러한 데이터는 HNSCC-56가 CD8+ T 세포에 E6 에피토프를 제시할 수 있지만 E6-특이적 CD4+ TIL이 MHC-를 직접 인식하고 용해할 수 없음을 시사합니다. II+ 자가 종양 세포. 항원 제시에 관여하는 유전자는 암에서 자주 돌연변이가 발생하는데, 이는 T 세포의 인식을 방해할 수 있습니다(21). HNSCC-56 종양 세포에 MHC-II의 항원 제시를 방해하는 체세포 돌연변이가 포함되어 있는지 확인하기 위해 참조 샘플로 Hu-56의 종양 세포와 PBMC의 전체 엑솜 시퀀싱을 수행했습니다. 확인된 104개의 비동의 체세포 돌연변이 중에서 HLADMA, HLADMB 및 CD74를 포함한 MHC-II 제시 경로의 구성 요소에는 명백한 돌연변이가 없었습니다(보충 표 5). 췌관 선암종 환자의 혈액에서 HLA-DRB5*01:01 제한, KRASG12V 특이적 TCR 식별. 이러한 결과에 따라 우리는 종양 세포가 MHC-II에 항원을 제시할 수 없다는 것이 다른 종양 유전자에도 해당되는지 여부를 확인하기 시작했습니다. 순환하는 종양 특이적 T 세포가 인간 암 환자에서 확인되었다는 점을 고려하여(8, 22), 우리는 펩타이드 풀을 사용하여 췌관 선암종 환자(Hu{39}})(보충 표 1)의 PBMC를 자극했습니다. ELISPOT에 의한 관련 T 세포 반응을 확인하기 위해 개별 펩타이드로 재자극하기 전 14일 동안 일반적인 발암성 돌연변이(보충 표 6)에 해당합니다. 이러한 결과는 KRASG12V 아미노산 1-15에 대한 반응으로 배경에 비해 IFN-스팟의 수가 증가한 것으로 입증되는 것처럼 KRASG12V에 대한 T 세포 반응의 존재를 나타냅니다(그림 5A). 이 반응과 관련된 관련 TCR을 확인하기 위해 우리는 사이토카인 분비 분석을 다시 사용하여 IFN-분비 세포를 분류했습니다. 사이토카인 분비 분석에서는 KRASG12V를 사용한 재자극에 반응하여 CD{53}} T 세포에 의한 IFN-의 특정 생산이 밝혀졌습니다(그림 5B). 분류된 IFN-분비 세포의 TCR 사슬을 이 환자의 확장되지 않은 PBMC에 존재하는 TCR 사슬과 비교하면 두 집단 모두에서 가장 높은 빈도로 존재하는 단일 TCR 클론형이 나타났습니다(그림 5C 및 보충 표 2). 이러한 결과는 이 T 세포 클론의 빈도가 PBMC의 기준선에서 확장되었음을 나타내며, 이는 확장 배양에서 시험관 내 프라이밍보다는 자연적으로 발생하는 생체 내 반응을 암시합니다. 이 TCR의 항원 특이성을 확인하기 위해 우리는 레트로바이러스 형질도입을 통해 일차 인간 CD{60}} T 세포에서 이를 발현하고 돌연변이 KRASG12V 또는 해당 WT 펩타이드로 펄스된 자가 B-LCL과 함께 이러한 세포를 배양했습니다. 조작된 T 세포는 WT, KRAS 펩타이드가 아닌 돌연변이로 자극할 때 IFN-을 분비하여 이 TCR이 KRASG12V에 특이적이라는 것을 확인했습니다(그림 5D). E6 TCR의 결과와 일치하여 KRASG12V 특이적 TCR을 발현하는 조작된 T 세포는 MITD를 포함하여 엔도솜으로 향하는 KRASG12V 단편을 발현하는 B-LCL을 인식할 수 있었지만 WT KRAS는 인식할 수 없었습니다. TCR은 내인적으로 처리되고 제시된 항원을 인식합니다(그림 5D).
그림 4. 자가 종양 세포는 MHC-II의 내인성 E61-15를 CD{3}} T 세포에 나타내지 않습니다. (ㅏ)
그림 5. 췌관 선암종 환자의 혈액에서 HLA-DRB5*01:01 제한, KRASG12V 특이적 TCR 식별. (ㅏ)
제한적인 HLA 대립유전자를 확인하기 위해 우리는 HLA 유전자의 다양한 조합을 발현하는 B-LCL을 사용하여 이러한 펩타이드 자극 실험을 반복했습니다. 공통 HLA-B7-DR15-DQ6 일배체형을 발현하는 B-LCL은 조작된 T 세포를 자극할 수 있는 반면, 이러한 대립유전자가 없는 B-LCL은 자극할 수 없습니다(그림 5E). 궁극적으로 인간 HLA-DRB5*01:01로 형질감염된 마우스 DAP3 세포주인 펩타이드 펄스 IHW03304에 의한 이들 세포의 자극은 이것이 제한적인 HLA 분자임을 입증했습니다(그림 5F). MHC-II+ NCI-H2444 및 DAN-G 종양 세포는 CD{23}} T 세포에 KRASG12V 유래 에피토프를 제시하지 않습니다. 다음으로, 우리는 MHC-II에 KRASG12V 유래 에피토프를 직접적으로 제시하는 종양 세포의 능력을 조사했습니다. 이러한 연구를 위해 HLA 일치 MHC-II+ 세포주를 생성하기 위해 우리는 인간 폐암과 췌장암에서 각각 유래된 KRASG12V+ 세포주 NCI-H2444 및 DAN-G에 CIITA 및 HLA-DRB5*01을 인코딩하는 구성을 형질도입했습니다. 잘린 CD34 리포터 유전자가 있는 01(그림 6A). 이전 결과와 일치하여, 제한적인 HLA 대립유전자를 발현하는 MHC-II+ 종양 세포는 표적 세포가 외인성 펩타이드로 먼저 펄스되지 않는 한 TCR 조작 T 세포를 자극할 수 없었습니다(그림 6B). 중요한 것은 공개적으로 이용 가능한 시퀀싱 데이터에서 NCI-H2444 또는 DAN-G에 대한 MHC-II 제시 유전자(즉, HLADMA, HLADMB, CD74)에 나열된 체세포 돌연변이가 없다는 것입니다(23). NCI-H2444 CIITA 세포는 TCR 조작 T 세포의 존재 하에서 억제되지 않은 채 성장한 반면, KRASG12V 펩타이드로 펄스된 NCI-H2444 CIITA 세포는 종양 성장이 지연되었습니다(그림 6C). HNSCC-56에 대해 얻은 결과와 일치하여 HLA-A*03:01 제한을 발현하는 CD{59}} T 세포는 KRASG12V 특이적 TCR(24)은 NCI-H2444 세포를 인식할 수 있었지만 그렇지 않았습니다. HLA-A*03:01을 발현하지만 KRASG12V는 발현하지 않는 CaSki 세포(그림 6D). 이러한 결과는 세포질에 존재하는 뚜렷한 종양 유전자가 MHC-I에서 효과적으로 제시됨에도 불구하고 MHC-II+ 종양 세포에서도 제시될 수 없음을 보여줍니다. 종양 세포에 의한 프로그램화된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)과 같은 공동억제 리간드의 발현은 T 세포에서 TCR 신호 전달을 제한합니다(25). 이 메커니즘이 CD4+ T 세포에 의한 MHC-II+ 종양 세포의 인식을 방해할 수 있는지 확인하기 위해 우리는 KRASG12V 특이적 TCR 또는 E6-특이적 TCR을 발현하는 CD{83}} T 세포를 배양했습니다. 항PD-L1 차단 Ab가 있거나 없는 NCI-H2444 CIITA 및 HNSCC-56 CIITA가 포함된 F12 TCR. PD-L1/PD-1 상호작용의 차단은 종양 세포 인식을 촉진하기에 충분하지 않았습니다(보충 그림 3). 유사하게, 항-CD28 작용제 Ab의 첨가는 종양 세포 인식을 조절하지 못했습니다. 이러한 결과는 각각 공동억제 또는 보조자극 신호의 존재 또는 부재보다는 항원 제시의 부족이 이 표현형에 책임이 있음을 시사합니다. 일부 연구에 따르면 원형질막에서 내재화된 내인성 단백질은 다른 세포하 구획과 비교하여 제시를 위해 MHC-II에 우선적으로 로드됩니다(26). KRAS 단백질은 지질 변형을 통해 막과 자주 연관되지만 막횡단 도메인을 발현하지 않으며 이러한 상호작용은 안정적이지 않습니다(3, 27). 따라서 우리는 KRASG12V의 면역원성 단편을 종양 세포의 원형질막에 고정하면 CD{103}} T 세포가 직접 항원을 인식할 수 있다고 판단했습니다. 그러나 P2A 연결 EGFP 리포터의 발현으로 입증된 바와 같이 KRASG12V-MITD 구조물을 발현하는 종양 세포는 유사하게 TCR 조작 CD{109}} T 세포를 자극할 수 없었습니다(보충 그림 4). 이러한 결과는 세포하 종양유전자의 위치가 종양 세포에 의한 MHC-II의 직접적인 발현을 결정하는 유일한 결정인자가 아님을 시사합니다. 또한, 이러한 결과는 항원의 과발현이 MHC-II의 발현을 촉진하기에 충분하지 않음을 시사합니다. 지금까지 우리의 결과는 종양 특이적 CD{114}} T 세포가 종양 세포 자체보다 APC에 의해 제시된 항원을 더 잘 인식할 수 있음을 시사합니다. 따라서 우리는 외인성 단백질에서 유래된 항원을 제시하는 HLADRB5*01:01+ DC의 능력을 평가했습니다. 시험관 내에서 생성된 HLA 일치 DC는 미성숙 DC에 KRASG12V 20-mer 펩타이드를 펄스로 공급하거나 KRASG12V 전체 단백질을 공급했지만 KRASG12V 특이적 TCR을 발현하는 TCR 조작 CD4+ T 세포를 자극할 수 있었습니다. KRAS WT 단백질이 아닙니다(그림 6E). 이러한 결과는 TCR이 종양 세포에 의해 제시된 내인성 항원을 인식할 수 없지만 DC의 맥락에서 교차 제시된 외인성 항원을 인식할 수 있음을 시사합니다.
cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.
논의
이 연구의 목표는 암 환자로부터 얻은 자연적으로 프라이밍된 T 세포에서 분리된 TCR이 종양 유전자를 발현하는 종양 세포를 인식할 수 있는지 여부를 확인하는 것이었습니다. HNSCC TIL에서 얻은 클래스 I(HLA-A*02:01) 제한 HPV-16 E629-38 TCR과 관련하여 두 가지 자가 종양 세포주에 대한 인식이 놀랍게도 확인되었습니다. 그리고 잘 특성화된 HLA 일치 및 E6-발현 종양 세포인 CaSki(중요한 점은 그림 2 참조)입니다. 동일한 TIL(그림 1)에는 상당수의 IFN 생성 E6-특이적 CD4+ T 세포(그림 3)가 포함되어 있었는데, 이와 대조적으로 E6-를 인식하지 못했습니다. IFN-처리 또는 CIITA 형질도입에 의해 올바른 제시 대립유전자(DQA1*01:02/DQB1*05:02)의 충분한 표면 MHC 클래스 II를 발현하도록 유도된 경우에도 종양 세포를 발현합니다(그림 4). CIITA 발현은 MHC-II 단백질의 표면 발현뿐만 아니라 항원 처리 및 제시에 필요한 HLA-DM 및 불변 사슬 분자도 유도합니다(28). 대조적으로, HLA 일치 B 세포는 항원이 MHC-II 경로로 향할 때 이 TCR에 의해 인식되었습니다. KRASG12V 특이적 HLA-DRB5*01:01 제한 TCR의 경우에도 비슷한 상황이 관찰되었는데, 이는 항원이 MHC-II 제시 경로. 두 TCR 모두 위에서 설명한 조건 하에서 내인적으로 발현된 항원의 인식을 중재하기에 충분한 기능적 결합력을 갖고 있으며 둘 다 펩타이드가 로드된 표적 세포의 세포독성을 중재할 수 있습니다. 이 후자의 관찰은 세포독성 CD4+ T 세포에 대한 여러 보고서에 제시된 상황을 반영하지만, 우리의 데이터는 소스 항원의 내인성 발현과 IFN-에 의한 MHC-II의 유도가 가능성이 없음을 보여줌으로써 이 관찰의 맥락을 확장합니다. 핵 또는 막 관련 항원에 대한 TCR에 대한 상피 유래 종양 세포에서 생리적 표적을 생성합니다. 인간 방광암 및 흑색종에 대한 최근 연구에서는 TIL 중 세포독성 CD{42}} T 세포에 해당하는 유전적 특징이 확인되었습니다(14, 15). 기능적으로 이러한 세포독성 CD4+ TIL은 MHC-II 의존 종양을 직접 인식할 수 있으며 궁극적으로 CD8+ 대응물과 유사한 방식으로 그랜자임에 의한 표적 용해를 유도합니다. 그러나 이러한 발견의 치료적 해석은 MHC-II를 발현하는 고형 종양이 거의 없다는 사실로 인해 제한될 수 있습니다. 실제로 2개의 독립적인 연구 결과에 따르면 흑색종 환자의 약 1/3만이 MHC-II+ 종양 세포를 갖고 있으며 종양 내 이러한 세포의 빈도는 종종 10% 미만인 것으로 나타났습니다(15, 29). 대신, 종양 미세환경에서 MHC-II의 주된 세포 공급원은 백혈구에 침투하는 것으로 보입니다(26).
그림 6. MHC-II+ KRASG12V+ 종양 세포는 CD4+ T 세포에 KRASG12V 유래 에피토프를 제시하지 않습니다. (ㅏ)
일부 고형 종양 세포는 구성적 또는 유도성 MHC-II를 발현하지만, 우리의 결과는 TIL과 PBMC 사이에 종양 유전자 특이적 CD{3}} T 세포가 존재함에도 불구하고 이러한 세포가 항원 발현을 직접 인식하고 용해할 수 없음을 나타냅니다. MHC-II+ 종양 세포는 동일한 단백질의 에피토프가 MHC-I의 CD{7}} T 세포에 효과적으로 제시될 수 있는 반면(13). 이는 단순히 표적 항원을 발현하는 것만으로는 CD{10}} T 세포가 MHC-II를 발현하는 종양 하위 집합을 인식하는 데 충분하지 않을 수 있음을 시사합니다. 또한, 이 연구에서 질의한 세포주에는 HNSCC, 폐 선암종 및 췌장암에서 유래된 세포주가 포함되어 있기 때문에 이러한 결과는 여러 종양 유형에 걸쳐 일관된 것으로 보입니다. 자연적으로 또는 CIITA 형질도입 후에 MHC-II를 발현하는 흑색종 세포주의 직접적인 CD{12}} T 세포 인식이 2개 연구에서 보고되었습니다(30, 31). 그러나 이 두 연구 모두에서 테스트된 TCR의 상당 부분은 종양 세포를 직접 인식하지 못했습니다. 이러한 TCR이 종양 항원을 인식하지 못하는 "방관자" 클론형을 나타내는지, 또는 이 연구에서 강조된 것과 같은 항원 제시 결함으로 인해 동족 항원을 인식할 수 없는 종양 특이적 TCR을 나타내는지는 확실하지 않습니다. Oliveiraet al. (31)은 CD4+ T 세포에 의한 직접적인 인식이 종양 돌연변이 부담이 매우 높은 2개의 흑색종으로 제한되어 있음을 입증했으며, 이는 이 표현형이 종양 항원의 MHC-II 제시를 허용하는 추가적인 필수 변경을 부여할 수 있음을 시사합니다. KRASG12V의 면역원성 단편에 MITD를 부착하면 CD{23}} T 세포가 종양 세포를 직접 인식하지 못하지만, 연구에 따르면 MHC-II에서 용출된 막 결합 단백질에서 파생된 내인성 펩타이드에 대한 편향이 설명되어 있습니다. 막 재활용으로 인해(26, 32). 흑색종 항원 Trp1은 원형질막에 존재하며, 이는 B16 종양 세포에 의해 CD{29}} T 세포에 직접적으로 제시되는 것을 촉진할 수 있습니다(33). 또 다른 흑색종 관련 항원인 gp100은 gp100의 막횡단 도메인에 의존하는 방식으로 종양 세포에 의해 CD{34}} T 세포에 제시됩니다(34). 쥐 육종 모델에서 신생항원 특이적 CD{38}} T 세포의 역할을 조사한 최근 연구에서, 막 결합 단백질이기도 한 돌연변이 인테그린 서브유닛에서 유래한 에피토프가 CIITA 형질도입 종양의 MHC-II에서 용출되었습니다. 세포 (35). 우리의 결과는 막 결합 단백질이 MHC-II에 대한 직접 제시를 위해 우선적으로 엔도좀으로 인신매매될 수 있지만 면역원성 막 단백질의 존재만으로는 이러한 제시를 촉진하기에 충분하지 않음을 시사합니다. 세포질 또는 핵 단백질이 MHC-II에 접근할 수 있도록 하는 다른 비고전적 제시 경로가 설명되었습니다. 여기에는 세포내 단백질의 자가포식 관련 제시 및 CD{48}} T 세포에 대한 항원 처리 의존적 제시와 관련된 수송체가 포함됩니다. 펩타이드는 아마도 막 재활용 중에 MHC-I에서 MHC-II로 전달되는 것으로 추정됩니다(36, 37). E7 에피토프에 특이적인 CD{54}} T 세포에 의한 자가 종양 세포의 MHC-II 의존적 직접 인식이 보고되었습니다(38, 39). 그러나 이들 연구는 모두 HLA-DR 분자에서 자궁경부암 세포에 의해 나타나는 덜 널리 퍼져 있는 발암성 HPV 하위 유형(즉, HPV{59}} 및 HPV{60}})에 의해 발현되는 E7 단백질에 관한 것입니다. 따라서 HPV 하위 유형, 종양 조직학 및 제한적인 HLA 대립 유전자도 MHC-II+ 종양 세포에서 핵 HPV 항원의 차별적 제시에 관련 요인일 수 있습니다. 우리의 데이터에 따르면 직접적인 종양 세포독성은 E6- 및 KRASG12V 특이적 CD4+ T 세포의 메커니즘일 가능성이 높지 않지만 CD4+ T 세포의 다른 항종양 메커니즘은 설명되어 있습니다. 암 환자에서 종양 특이적 CD{70}} T 세포의 입양 전달은 항종양 활성을 입증했습니다(7, 40, 41). 그러므로, 이 연구에서 확인된 것과 같은 MHC-II 제한 TCR은 인간 환자의 ACT에 유용할 수 있습니다. 이러한 TCR이 미국 백인의 1.27% 및 16.10%로 추정되는 HLA 일배체형으로 제한되는 운전자 종양단백질로부터 유래된 에피토프를 표적으로 삼는다는 점을 고려하면 말이죠. HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 및 HLA-DRB5*01:01(42)에 대한 모집단입니다. 특히, CD{90}} T 세포는 CD40L 의존 방식으로 항원 보유 DC를 라이센싱하여 종양 특이적 CD{92}} T 세포의 프라이밍을 돕습니다(43-45). 우리는 이 연구에서 확인된 KRASG12V 특이적 TCR이 DC의 맥락에서 교차 제시된 항원을 인식한다는 것을 입증하며, 이는 이들 세포가 이 기능을 통해 항종양 면역에 기여할 수 있음을 시사합니다. CD8+ T 세포는 IL8+ 및 IFN-와 같은 사이토카인을 분비하여 종양 내의 CD{101} T 세포에 국소적인 도움을 제공하여 CD8+ T 세포 생존을 지원하고 종양에 모집(46). 또한 CD{106}} TIL은 대식세포와 같은 골수 세포의 종양 미세환경에서 항원을 인식할 수 있습니다. 실제로, 전임상 연구에 따르면 종양 세포에 MHC-II가 없는 경우 입양 전달된 Trp1 CD{109}} T 세포는 여전히 IFN-에 의존하는 항종양 면역을 발휘할 수 있으며 대식세포의 증가된 세포독성 활성과 상관관계가 있음이 입증되었습니다(47). 그러나 이 현상은 종양 항원 분비에 의존하는 것으로 보이며, 대부분의 종양 유전자의 경우 이는 최소 수준일 것으로 추측됩니다. 전반적으로, 우리의 연구는 MHC-II+ 종양 세포에 의한 내인성 항원의 직접 제시의 선택성을 강조하고 CIITA 발현이나 막 결합 항원의 존재만으로는 CD에 의한 종양 세포의 직접적인 인식을 촉진하는 데 충분하지 않음을 보여줍니다.{115} } T 세포. 암에서 CD{119}} T 세포의 상황 의존적 역할을 완전히 이해하기 위해서는 어떤 조건에서 어떤 항원이 MHC-II+ 종양 세포에 의해 직접적으로 제시될 수 있는지 특성화하기 위해 더 많은 연구가 필요합니다.
시스탄체 식물의 면역 체계 증가
행동 양식
세포 배양. 이전에 설명한 대로 TIL을 수확하고 배양했습니다(48). 간단히 말하면, 원발성 종양 조직을 2-3 mm 조각으로 절개하고 이를 24-웰 플레이트에 넣고 1{{102}}%가 보충된 RPMI-1640에서 배양했습니다. 인간 AB 혈청, 페니실린-스트렙토마이신, HEPES, 겐타마이신 및 6,000 IU/mL IL-2. 유출된 TIL은 2-3일마다 절반 배지 교체로 배양되었습니다. 말초 혈액의 일차 인간 T 세포는 50% AIM V + 50% RPMI-1640와 10% 인간 AB 혈청, 페니실린-스트렙토마이신(100 U/ 각각 mL; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IU/mL IL-2, 5 ng/mL IL-7 및 5 ng/mL IL-15. 환자 유래 종양 세포주를 이전에 설명한 대로 생성하고 배양했습니다(17). 간단히 말하면, 원발 종양 조직을 2mm보다 작은 조각으로 절단하고 GentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)를 사용하여 분리했습니다. 종양 세포를 5 μM Rho 키나제 억제제를 함유하는 F-배지에 재현탁시키고, 조사된 3T3 섬유아세포(30 Gy)의 층 위에 플레이팅했습니다. 초기 배양 후, 종양 세포는 조사된 3T3- 조절 배지와 5 μM Rho 키나제 억제제를 함유한 F-배지의 3:1 혼합에서 증식되었습니다. CaSki(ATCC), NCI-H2444(ATCC), DAN-G(ATCC), J76 Jurkat(ATCC), 3T{46}}CD40L 및 B-LCL은 l-글루타민과 HEPES가 보충된 RPMI 배지에서 유지되었습니다( 10mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1mM 피루브산나트륨(Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM 비필수 아미노산(Gibco, Thermo Fisher Scientific) 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/ mL 각각; Gibco). 우리는 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신(각각 100U/mL, Gibco, Thermo Fisher Scientific)이 포함된 DMEM 배지 보충제에서 293GP(ATCC)를 유지했습니다. IHW03304, GM3107, KAS011, D8 및 D66 세포는 Alessandro Sette(La Jolla Institute for Immunology)로부터 선물로 받았습니다. ELISPOT 분석. TIL 또는 PBMC는 항IFN-Abs(1-D1K, Mabtech)로 코팅된 ELISPOT 플레이트에 웰당 100,000 세포로 플레이팅되었습니다. HPV-16 E6 및 E7 PepMix(JPT) 펩타이드 풀, 선택된 발암성 돌연변이를 나타내는 펩타이드 풀 또는 표시된 개별 펩타이드를 사용하여 발달 전 22시간 동안 풀의 경우 5ug/mL, 펩타이드의 경우 10ug/mL로 세포를 재자극했습니다. 제조업체의 지침(Mabtech)에 따른 ELISPOT 플레이트. 양성 대조군으로는 5ug/mL의 피토헤마글루티닌-L을 사용했습니다. 생체 외 확장 배양. PBMC를 5ug/mL의 선택된 발암성 돌연변이를 나타내는 펩티드 풀로 플레이팅했습니다. 10 IU/mL IL-2을 포함하는 신선한 배지를 4일, 7일 및 10일에 첨가했습니다. 14일에 PBMC를 ELISPOT 또는 사이토카인 분비 분석에 사용하기 위해 재자극했습니다. TCR 시퀀싱. TIL 또는 PBMC를 5 ug/mL HPV-16 E6 PepMix(JPT) 또는 KRASG12V 펩타이드로 재자극하고 IFN-분비 세포를 제조업체의 지침(Miltenyi Biotec)에 따라 Human IFN-분비 분석 키트를 사용하여 형광 태그를 붙였습니다. . 단일 IFN- + 세포를 FACSAria(BD Biosciences)를 사용하여 96-웰 플레이트로 분류하고 Illumina Miseq를 사용하여 RNA-Seq를 수행하여 쌍을 이루는 TCR과 사슬을 식별했습니다. E6-특이적 CD4+ TCR 클론의 식별을 위해 IFN-분비 세포를 위와 같이 분류하고 TCR 및 TCR 서열을 이전에 설명한 대로 중첩 다중 PCR로 증폭했습니다(49). Sanger 시퀀싱(ETON Biosciences)을 위해 PCR 산물이 제출되었습니다. TCR 빈도 분석을 위해 표시된 펩티드를 사용한 14-일 생체외 확장 전후의 PBMC를 Adaptive Biotechnologies로 보냈습니다. HPV 발현 분석. Hu-56 원발성 종양 세포 및 종양 세포주로부터 RNA를 분리하고 대량 RNA-Seq에 제출했습니다. 페어드 엔드 시퀀싱 읽기는 BWA(v0.7.12)(50)를 사용하여 HPV 전체 게놈(GenBank 등록 번호 NC{106}}.2) 및 해당 전사체에 매핑되었습니다. 결과 시퀀스 정렬 맵 파일은 정렬된 이진 정렬 맵으로 변환되고 인덱싱된 다음 SAMtools(v1.2)(50)를 사용하여 매핑된 읽기를 계산했습니다. 전체 엑솜 시퀀싱. Whole-exome sequencing과 RNA-seq는 각각 Agilent Whole-Exome Capture와 Illumina 키트를 사용하여 La Jolla Institute for Immunology Sequence Core에서 수행되었습니다. FFPE 생체 표본은 말초 혈액 표본을 사용하여 일치하는 참조 DNA와 함께 차세대 시퀀싱을 위해 무어스 암 센터에서 Tempus로 배포되었습니다. 종양 및 정상 샘플의 엑솜 시퀀싱으로부터의 서열 판독은 SpeedSeq Align(v0.1.0)(51)을 사용하여 참조 게놈 GRCh38에 정렬되었습니다. Exome 변이체는 SpeedSeq Somatic을 사용하여 식별되었으며 변이체는 SNPeff(v4.3i)(52)를 사용하여 주석을 달았습니다. 이 원고에 대한 RNA-Seq 및 전체 엑솜 시퀀싱 데이터는 NCBI BioProject(수탁 번호 PRJNA924789)에 업로드되었습니다. T 세포 레트로바이러스 형질도입. BioXP 3200(Codex)을 사용하여 TCR 뉴클레오티드 서열을 합성하고 MSGV1 레트로바이러스 백본에 클로닝했습니다. 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었습니다. 인간 TCR 불변 영역은 표면 발현을 향상시키고 우선적인 페어링을 촉진하기 위해 치환된 마우스 TCR 불변 영역으로 교환되었습니다(53, 54). 인간 PBMC는 연막으로부터 분리되었습니다. CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 자기 선택으로 제거하고 남은 모든 림프구를 포함하는 음성 분획을 50 ng/mL 항-CD3 Ab(OKT3)가 포함된 T 세포 배지에서 2분간 배양했습니다. 날.
cistanche tubeulosa-항종양의 장점
TCR 레트로바이러스 상청액은 관련 TCR 서열 및 RD113 플라스미드를 함유하는 MSGV1 벡터를 사용하여 293GP 세포를 공동형질감염시켜 생성되었습니다. 형질감염 2일 후, 레트로바이러스 상층액을 수확하여 신선하게 사용하거나 -80도에서 냉동하여 사용했습니다. 이전에 설명한 대로(5) RetroNectin 코팅 플레이트(Takara)에서 형질도입을 수행했습니다. 뮤린 TCR 불변 영역 발현을 유세포 분석법으로 평가하여 형질도입 효율을 결정했습니다. TCR 조작 T 세포는 초기 자극 후 7일 이내에 사용되었습니다. T 세포 기능 분석. 우리는 5 × 104 TIL, 형질도입된 T 세포 또는 J76 Jurkat 세포와 1 × 105 B-LCL을 지시된 농도의 펩타이드 또는 전날 파종한 5 × 103 종양 세포와 함께 밤새 {{16} }각각 U자 바닥 또는 평평한 바닥 플레이트입니다. 지시된 경우, 항-CD28 작용제(클론 CD28.2, BioLegend) 또는 항-PD-L1 차단(클론 29E.2A3, BioLegend) Ab를 T 세포 및 종양 세포 공동배양에 각각 5 및 10 ug/mL로 첨가했습니다. 사이토카인 및 활성화 마커 분석을 위해 PMA와 이오노마이신을 함유한 1X Cell Activation Cocktail(BioLegend)을 양성 대조군으로 사용했습니다. HLA 차단 연구를 위해 T 세포를 추가하기 최소 2시간 전에 다음 Ab 20ug/mL를 펩타이드 펄스 B-LCL에 추가했습니다. 항-HLA-DQ(Tü169, BioLegend), 항-HLA-DR (L243, BioLegend) 또는 마우스 IgG2a 이소형 대조군(MOPC-173, BioLegend). 표시된 경우, T 세포를 첨가하기 전에 종양 세포를 10ng/mL 재조합 IFN-와 함께 72시간 동안 배양했습니다. 18~24시간 후에 상등액을 수집하고, IFN-를 ELISA(Thermo Fisher Scientific)로 측정하고, 유세포 분석을 위해 세포 펠릿을 염색했습니다. 표시된 효과기 대 표적 비율로 T 세포와 종양 세포를 공동 배양하여 세포 독성 분석을 수행했습니다. 간단히 말하면, 5 x 103 종양 세포를 접종하고 밤새 배양한 후 지정된 비율로 T 세포를 첨가했습니다. 표적 세포 용해는 실험이 끝날 때까지 30분마다 세포 부착으로 인한 전기 임피던스를 평가하는 xCELLigence Real-Time Cell Analyser(ACEA Biosciences)를 사용하여 결정되었습니다. 데이터는 xCELLigence RTCA 소프트웨어 패키지를 이용하여 분석하였고, 결과는 T 세포를 첨가한 시점에서 1로 표준화된 세포 지수로 보고하였다. MHC-II 제시 분석. BioXP 3200(Codex)을 사용하여 다음을 인코딩하는 합성 DNA 구성물을 생성하고 MSGV1에 클로닝했습니다. 인간 HLA-B 유전자의 N-말단 25개 아미노산과 이어서 HPV-16 E6의 처음 50개 아미노산 또는 인간 HLA-B의 C-말단 55개 아미노산, T2A 자가 절단 요소 및 EGFP의 코딩 서열에 융합된 KRASG12V의 25개 아미노산. 위에서 설명한 대로 바이러스 상청액이 생성되었고, 인간 CD40L(3T{77}}CD40L)을 발현하는 조사된(0.5 Gy) 3T3 세포 베드에서 밤새 자극한 후 RetroNectin 코팅 플레이트에서 자가 B-LCL을 형질도입했습니다. EGFP 발현의 유세포 분석 정량화를 통해 형질도입 효율을 평가했습니다. 형질도입된 B-LCL은 자가 TIL과 공동배양하기 전 2~3일 동안 2회 연속 라운드 동안 200 IU/mL 재조합 인간 IL-4(PeproTech)이 있는 상태에서 3T3-CD40L로 자극되었습니다. 항원 제시 분석을 위한 DC 생성. DC는 플라스틱 접착 방법을 사용하여 생성되었습니다. 냉동 PBMC를 해동하고 DC 배지(l-글루타민, 5% 열 불활성화 인간 AB 혈청 및 각 페니실린-스트렙토마이신 100U/mL가 보충된 RPMI-1640)에 37도에서 2시간 동안 플레이팅했습니다. 따뜻한 PBS로 세척하여 비부착성 세포를 제거하고, 부착성 세포를 800 U/mL GM-CSF(Tonbo, Cytek Biosciences) 및 500 U/mL IL-4(PeproTech)을 첨가한 DC 배지에서 6일간 배양하였다. . 1ug/mL KRASG12V 펩타이드 또는 20ug/mL KRASG12V 또는 WT KRAS 단백질(Abcam)을 밤새 미성숙 DC에 직접 추가했습니다. 다음 날, DC를 수확하고 TCR 조작 T 세포와 1:1 비율로 밤새 공배양한 후 유세포 분석으로 CD137 상향 조절을 평가했습니다. 종양 세포의 레트로바이러스 형질도입. 인간 CIITA의 코딩 서열을 합성하고(Integrated DNA Technologies) Gibson Assembly를 통해 MSGV1에 클로닝했습니다. HLADRB5*01:01의 코딩 서열과 P2A 서열에 의해 분리된 사슬을 합성하고(Integrated DNA Technologies) T2A 서열 상류의 변형된 pHAGE 렌티바이러스 벡터에 이어서 Gibson Assembly에 의해 절단된 CD34 리포터 서열로 클로닝했습니다. 위에서 설명한 대로 MSGV1을 사용하여 레트로바이러스 상층액을 생성했습니다. 렌티바이러스 상층액은 293T 세포를 pHAGE, tat, rev, gag/pol 및 vsv-g 플라스미드로 공동형질감염시켜 생성되었습니다. 24시간 후에 바이러스 상청액을 수집하고 Amicon Ultra 5 튜브(MilliporeSigma)에서 원심분리에 의해 농축했습니다. 종양 세포를 플레이팅하고, 1일 후, 배지를 10ug/mL 폴리브렌이 보충된 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 상층액으로 교체했습니다. 4시간 후, 바이러스가 포함된 상청액을 흡인하고 배양 배지로 교체했습니다. MHC-II+ 및 CD34+ 종양 세포는 FACS Fusion 세포 분류기(BD Biosciences)를 사용하여 분류되었습니다. 유세포 분석. 세포는 항인간 CD3-PE(OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-Cyanine7(SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC(Hit8a, Tonbo)와 같은 항원에 대해 형광색소 결합 단일클론 Ab로 표지되었습니다. , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647(581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5(FN50, BioLegend), CD137–PE(4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650(EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC(Tü39, BioLegend) 및 항마우스 TCR -APC(H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). 죽은 세포는 DAPI 또는 LIVE/DEAD Fixable Aqua(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)로 염색되었습니다. E629-38 – HLA-A*02:01 –PE 사량체는 NIH Tetramer Core Facility에서 조립하고 라벨을 붙였습니다. 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 1ug/mL 사량체로 염색했습니다. 표면 항원에 대한 Ab 염색을 얼음 위에서 15분 동안 수행했습니다. 세포내 사이토카인 염색(ICS)을 위해 T 세포를 Brefeldin A의 존재 하에 4~6시간 동안 펩티드 펄스 APC와 함께 배양했습니다. 표면 염색 후 Cytofix/Cytoperm Kit(BD Biosciences)를 사용하여 세포를 투과화하고 세포내 사이토카인에 대해 염색했습니다. , 제조업체의 지침에 따라. 다음의 형광색소 결합 Ab가 사이토카인 염색에 사용되었습니다: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2-FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11 , BioLegend) 및 Granzyme B–PE(QA16A02, BioLegend). FACSCelesta 유세포 분석기(BD Biosciences)로 데이터를 수집하고 FlowJo v10.7 소프트웨어로 분석했습니다. 통계. Prism 8(GraphPad Software)을 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. ICS 비교에는 짝이 없는 2-테일 t-테스트가 사용되었습니다. HLA 차단 Ab-Ab 매개 T 세포 신호 억제를 비교하기 위해 2-방식 ANOVA가 사용되었습니다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 연구 승인. 본 연구에 사용된 신원이 확인되지 않은 인간 샘플은 UCSD IRB 프로토콜 101391CX, "종양 환경 표현형 분석 및 세포 분리"를 통해 사전 동의하에 얻은 것입니다. 연구에 참여한 개인은 서면 동의서를 제공했습니다.
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