아데노바이러스 캡시드의 포스트 엔트리 분류 이해; 백신 벡터 속성을 변경할 기회 1부
Mar 03, 2023
추상적인:
아데노바이러스 벡터 기반 유전자 백신은 SARS-CoV-2 건강 위기에 대한 강력한 전략으로 등장했습니다. 아데노바이러스는 유전자 백신의 많은 바람직한 특징을 결합하기 때문에 이러한 성공은 예상치 못한 것이 아닙니다. 그들은 고도로 면역원성이고 기술적 접근 가능성과 쌍을 이루는 낮고 잘 특성화된 병원성 프로필을 가지고 있습니다. 아데노바이러스-백신 벡터를 개선하기 위한 지속적인 노력에는 희귀 혈청형 및 비인간 아데노바이러스의 사용이 포함됩니다. 이 리뷰에서는 바이러스 캡시드와 유전자형 선택이 흡수 및 후속 세포내 분류에 어떻게 영향을 미치는지에 초점을 맞춥니다. 진입 과정 중 안정성과 같은 캡시드 특성을 이해하는 것이 진입 입자의 운명을 어떻게 바꿀 수 있고 이것이 어떻게 면역 결과의 차이로 해석되는지 설명합니다. 우리는 막 용해성 캡시드 단백질 VI의 돌연변이가 종 C 바이러스의 진입 후 분류에 어떻게 영향을 미치는지 자세히 논의하고 그러한 접근법이 백신 및/또는 벡터 개발에 더 넓은 의미를 가질 수 있는지 간략하게 논의합니다.
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1. 소개
바이러스 감염은 항생제로 치료할 수 있는 세균 감염과 달리 항바이러스 치료법이 거의 없기 때문에 여전히 건강에 위협이 됩니다. 따라서 백신접종은 인간(및 동물) 개체군을 바이러스 감염으로부터 보호하기 위해 널리 적용할 수 있는 유일한 전략입니다.
최근까지 바이러스 감염에 대한 예방 접종은 주로 아동기 질병을 예방하는 맥락에서 또는 인플루엔자 감염 예방을 위한 연례 "독감" 주사로 간주되었습니다. 2020년 SARS-CoV-2 건강 위기가 발발하면서 예방접종이 대중의 관심의 중심으로 다시 돌아왔습니다. 현재 이 대유행에서 벗어날 수 있는 유일한 지속 가능한 방법으로 여겨지기 때문입니다. 이러한 맥락에서 아데노바이러스(Ad) 벡터 기반 백신이 두 가지 주요 성공적인 백신 접종 전략 중 하나로 등장했습니다. 긴급 승인 후, SARS-CoV-2에 대한 지구적 면역을 확립하기 위한 전례 없는 노력의 일환으로 현재 전 세계 인구의 상당 부분에 Ad 백신이 주입되고 있습니다.
아데노바이러스 벡터 백신은 COVID-19 발생 이전에는 널리 사용되지 않았지만 그 성공은 예상하지 못했습니다. 바이러스는 일반적으로 매우 적합한 백신 플랫폼입니다. 그들은 생물학적으로 최적화되고 핵산 수송에 적합하며 면역 반응을 이끌어냅니다. 아데노바이러스는 특히 이상적인 백신 후보가 되는 많은 특징을 가지고 있습니다. 그들은 높은 감염성과 함께 낮고 잘 특성화 된 병원성 프로필을 가지고 있습니다. 그들은 기술적으로 접근하기 쉽고 벡터화에 광범위하게 사용되었습니다. 높은 생산 수율과 안정성으로 GMP(Good Manufacturing Practice) 조건에서 산업 생산이 가능하고 저렴한 비용으로 지역 유통을 위한 실용적인 기능(예: 저장)을 제공합니다[1]. 또한, 항원 제시 세포로의 Ad 세포 전달은 효율적이며 백신 성공을 촉진하는 보조제 역할을 하는 선천적 면역 반응을 자연적으로 유발합니다[2,3].
광고 생물학을 이해하는 것은 광고 기반(백신) 벡터를 개발하는 데 중요합니다. 예를 들어, 현재 시판 중인 일부 SARS-CoV-2 백신에서 비인간 또는 희귀 광고 혈청형을 사용하는 것은 기존 벡터 면역이 백신 효율성을 감소시키는 것을 방지하기 위해 의도적으로 선택되었습니다. 바이러스 유전자 제거 벡터를 사용하면 벡터 안전성이 향상됩니다. 그러나 Ad 기반 백신 벡터를 개발할 때 고려되지 않은 바이러스 수명 주기의 많은 측면이 여전히 있으며, 현재 SARS-CoV-2 백신으로 사용되는 것을 포함하여 희귀하거나 인간이 아닌 유전자형에 대한 지식이 제한적입니다. . 이 검토를 통해 예방 접종을 포함한 의료 목적의 광고 벡터를 개발할 때 악용될 수 있는 잠재적인 수정에 대한 인식을 높이고자 합니다.
우리는 바이러스 캡시드와 유전자형의 선택이 흡수 및 후속 세포내 분류에 어떻게 영향을 미치는지에 초점을 맞춥니다. 진입 과정 중 안정성과 같은 캡시드 특성을 이해하는 것이 진입 입자의 운명을 어떻게 바꿀 수 있고 어떤 다른 면역 결과가 관찰되는지 설명합니다. 캡시드 안정성과 운명이 어떻게 변할 수 있는지에 대한 예로서 막 용해성 캡시드 단백질 VI의 돌연변이가 종 C 바이러스에 어떤 영향을 미치는지 자세히 논의합니다. 마지막으로 이러한 접근 방식이 백신 및/또는 벡터 개발에 활용될 가능성이 있는지 간략하게 논의합니다.
1.1. 아데노바이러스는 감염성 병원체의 다양한 계열을 구성합니다.
역사적으로 Ad는 1953년 호흡기 감염 환자의 아데노이드에서 처음 분리되었으며[4], 곧 "아데노바이러스"라는 용어가 보편적으로 채택되었습니다[5]. Adenoviridae 과에는 120개 이상의 구성원이 있으며, 이들이 포유류(예: Mastadenoviridae), 조류(예: Aviadenoviridae), 파충류(예: Atadenoviridae), 양서류(Siadenoviridae) 또는 어류(Ichtadenoviridae)를 감염시키는지에 따라 5개 속으로 나뉩니다. ) [6,7]. Mastadenoviridae 속은 또한 70종 이상의 인간 광고[8,9]를 설명하며 표 1[10, 11].
또한 Ad는 자발적으로 재조합하여 새로운 종을 생성할 수 있습니다[12]. AdE4의 경우는 유일한 인간 종 E 바이러스이며 인간 종 B와 유인원 Ad[13] 사이의 재조합 결과일 가능성이 높습니다[13]. ]. 인간이 아닌 광고에 의한 인간의 감염은 자연적으로 드물지만 불가능한 것은 아닙니다[14,15]. 인간 세포를 감염(또는 형질도입)하는 다양한 비인간 광고의 능력은 매력적인 (백신) 벡터 플랫폼이 됩니다. 그 중에는 침팬지[16–18], 고릴라[19], 양[20], 소[21], 개[21,22] 또는 신세계 원숭이[23]에서 파생된 광고가 있습니다.
아데노바이러스 감염은 호흡기, 안구, 비뇨기 또는 위장관 질환을 포함하여 세포 또는 조직 친화성에 따라 다른 병리를 유발할 수 있습니다(표 1 참조). 조직 친화성은 종종 다른 광고에 의한 뚜렷한 수용체 사용의 결과이며 고유한 입자 안정성과 관련될 수도 있습니다[24]. 대부분의 광고 감염은 면역 능력이 있는 숙주에서 경미하거나 무증상입니다. 일차 광고 감염은 대부분 어린 시절에 발생하며 강력한 보호 면역을 초래합니다. 대조적으로, 면역억제된 개인에서 광고는 제어되지 않는 중증의 생명을 위협하는 전신 감염을 일으켜 심각한 세포 독성을 유발하여 과도한 염증 및 다발성 장기 부전을 일으켜 높은 사망률을 유발할 수 있습니다[12].
가장 많이 연구된 인간 광고는 주로 상기도 및 위장관 감염 환자에서 발견되고 [25] 이 검토의 주요 초점이 될 종 C 바이러스 유형 2 및 5입니다. 아데노바이러스는 면역 능력이 있는 개인[26] 또는 종 F의 Ad40/41 및 종 A의 Ad12, 18 및 31 사이에서 폐렴을 유발하는 종 B 바이러스(예: Ad3, 7 및 14)와 같은 간헐적인 발병의 원인이 될 수 있습니다. , 위장관을 감염시킵니다([26,27]에서 검토된 바와 같이). 종 D 바이러스는 매우 다양한 그룹이며 재조합되기 쉽고 안구 감염의 주요 원인입니다[28].
1.2. 아데노바이러스 캡시드는 준안정 구조임
다양성에도 불구하고 모든 광고는 유사한 구조 및 조직 프레임워크를 따릅니다. 아데노바이러스는 상대적으로 큰 26-45kb 선형 이중 가닥 DNA 게놈을 포함하는 외피가 없는 DNA 바이러스입니다[29-31]. 캡시드는 직경이 ~70–90 nm이고 20개의 면과 12개의 꼭지점을 가진 20면체 형태입니다[32]. 캡시드는 3개의 주요 구조 단백질(헥손, 펜톤 및 섬유)과 구조를 안정화시키는 다양한 부차적 시멘트 단백질(즉, 종 C 바이러스의 IIIa, VI, VIII 및 IX)로 구성됩니다. 몇 가지 Ad 캡시드의 고해상도 구조는 극저온 전자 현미경과 X선 결정학으로 얻어졌습니다[24,33-36]. 20면체 캡시드는 720개의 엑손이 캡시드의 위치에 따라 서로 다른 삼량체로 조립된 pseudo-T25 구조를 가지고 있습니다. 캡시드의 20면은 9개의 조립된 엑손(소위 Group of Nine의 경우 GON)으로 구성되는 반면, 12개의 꼭지점에서 엑손은 GOS(Group of Six의 경우)에서 조립됩니다(자세한 내용은 [37,38] 참조) ). 펜타메릭 펜톤 베이스는 12개의 꼭지점에 삽입되어 튀어나온 삼량체 섬유의 기초 역할을 합니다[39,40]. 주 캡시드 단백질과 마이너 캡시드 단백질 간의 상호작용은 주로 육각형과의 상호작용을 통해 캡시드를 안정화시킵니다.
예를 들어, GON은 IX[41]에 의해 안정화됩니다. IX 및 IIIa는 각각 GOS 및 GON과 연결되는 VIII와의 상호 작용에 의해 자체적으로 안정화됩니다[37]. VIII 분자는 GON의 윤곽을 잡고 캡시드 내부의 육각형을 안정화하는 데 도움을 줍니다. 단백질 VI는 또한 내부 바이러스 내강에 노출된 헥손 삼량체 중앙 공동을 결합하여 헥손을 안정화시킵니다[42-44].
캡시드는 바이러스 게놈, 바이러스 코어 단백질(즉, 종 C 바이러스의 V, VII, Mu) 및 말단 단백질(TP)로 구성된 바이러스 코어를 둘러싸 보호합니다. 광고 게놈. 마이너 캡시드 단백질은 캡시드와 게놈 사이의 연결을 설정하는 핵심 단백질과 상호 작용합니다. 그러나 핵심 단백질 간의 공간적 구성은 잘 알려져 있지 않습니다. V는 VI(캡시드 쪽) 및 VII(게놈 쪽)[45-47]와 상호작용하여 캡시드 내부에 DNA를 유지하고 아마도 핵 구멍에서 게놈 방출에 기여하는 것으로 나타났습니다[48]. VII는 바이러스 DNA와 관련된 주요 캡시드 단백질이며 캡시드 내부의 응축을 촉진합니다[49-51]. VII는 또한 세포 인자를 통한 면역 탐지로부터 바이러스 게놈을 보호합니다[50,52-54]. 흥미롭게도 캡시드 단백질 IX와 단백질 V는 Mastadenoviridae에만 존재하며[55,56], 바이러스 캡시드는 IX[57] 또는 단백질 VII[58] 없이도 생산될 수 있어 캡시드 구조에서 약간의 유연성을 보입니다.
인간 광고의 게놈은 약 45개의 단백질(구조 단백질 포함)을 암호화하며, 일시적으로 조절되는 전사 단위로 구성됩니다[59]. 전사 인자 E1A는 첫 번째로 발현되는 단백질이며 바이러스 유전자 발현을 시작하는 데 필요합니다[60]. 게놈은 또한 복제에 필요한 각 말단에 5' 캡슐화 서열과 역전 말단 반복(ITR)을 포함합니다[59,61-64]. 아데노바이러스는 입자에 압축되어 여러 단백질을 처리하는 아데노바이러스 프로테아제(AVP)를 암호화합니다(즉, C종 바이러스에서 IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP 및 52.55K)[65-67]. 이 단계는 성숙한 감염성 입자의 형성에 필요하며 세포 부착 및 진입 시 캡시드 분해를 위해 프라이밍된 준안정(즉, 덜 안정한) 캡시드의 형성을 유도합니다[68,69]
또한 수용체 결합에 직접적인 영향을 미치는 섬유 길이 및 유연성과 같은 인간 광고의 구조에는 종별 차이가 있습니다[70-72]. Penton 어셈블리에서도 차이를 볼 수 있습니다. 종 B 바이러스의 펜톤은 펜톤 간 접촉을 형성할 수 있으며, 그 결과 게놈이 없고 때때로 섬유가 없는 대안적이고 덜 안정적인 바이러스 유사 입자가 생성됩니다. 이러한 입자를 12면체라고 하며 Ad 벡터의 대안으로 플라스미드 또는 펩타이드의 세포 전달에 대해 연구됩니다. 12면체는 표적 세포에 결합하는 데 필요한 대부분의 Ad 종의 펜톤에 존재하는 RGD 짧은 펩티드 모티프를 더 잘 노출시킵니다[73,74]. 캡시드 안정성의 차이는 아래에서 논의되는 바와 같이 Ad 입자의 진입 운명을 결정하는 중요한 속성일 수 있습니다.
1.3. 아데노바이러스는 Lytic Life Cycle을 따릅니다.
Ad 감염 주기는 다른 곳에서 광범위하게 검토되었습니다[75-77]. 여기에서는 수명 주기의 진입 부분에 대해 간략히 설명하고 달리 언급하지 않는 한 가장 잘 연구된 종 C 바이러스를 언급할 것입니다(그림 1). 아데노바이러스는 캡시드 섬유를 일차 세포 부착 분자로 사용합니다. 종 C 바이러스를 포함한 대부분의 광고는 콕사키바이러스와 광고 수용체(CAR)를 사용하여 표적 세포에 결합합니다[78-81]. 대조적으로 일부 종 B 바이러스는 CD46 수용체[82] 또는 데스모글레인 2[83]에 우선적으로 결합하고 일부 종 D 바이러스는 시알산[84,85] 또는 v 인테그린과 직접 상호작용하는 것으로 나타났습니다(표 1 참조). 86].
따라서 종 사이의 섬유 전환은 향성을 변화시키는 매력적인 전략입니다[87-89]. 섬유 분자의 주요 역할은 v 5 [90]와 같은 펜톤과 인테그린 사이의 두 번째 상호 작용이 뒤따르는 표적 세포와의 물리적 결합을 중재하는 것입니다. 이 상호작용은 펜톤 서열의 RGD 펩티드 모티프에 의해 매개된다[91]. 종 F 바이러스에서와 같이 이 모티프의 부재는 덜 효율적인 세포 진입과 관련이 있습니다[92]. 인테그린 결합은 세포 표면에서 인테그린 클러스터링을 일으켜 [93] 신호 캐스케이드를 유발하여 액틴 세포골격 [94,95] 및 클라트린-매개 엔도사이토시스 또는 마이크로피노사이토시스 [96,97]를 통한 세포내 섭취를 유도합니다. RGD 결합은 또한 펜톤과 헥손 사이의 접촉을 감소시켜 캡시드가 코팅되지 않도록 도와줌으로써 캡시드를 불안정하게 만들 수 있습니다[99]. 결과적으로 Ad 입자는 섬유질을 잃고 엔도좀 내부에서 해리된 헥손과 펜톤을 찾을 수 있습니다[100-102]. 엔도솜은 분해성 리소좀으로 성숙하도록 준비된 동적 소기관이며 광고는 세포질로 빠르게 탈출해야 합니다. 엔도좀 산성화는 캡시드를 더욱 약화시켜 탈출 과정을 가속화할 수 있습니다[100,103]. 엔도솜 침투 과정은 내부 캡시드 단백질 VI의 방출에 의존합니다[103,104].
방출된 VI는 엔도좀의 내부 전단지에 결합하고 양의 막 만곡을 유도하는 N-말단 양친매성 나선을 특징으로 하며, 그 결과 국부적으로 한정된 막 파열이 발생합니다[75,103,105,106]. 세포는 바이러스에 의해 유발된 막 파열에 반응하고 손상된 소기관을 제거하기 위해 국소화된 자가포식 반응을 활성화합니다[107-109]. 분해를 피하기 위해 Ads는 입자가 세포질의 안전에 도달할 때까지 단백질 VI의 짧은 PPxY 펩티드 모티프를 통해 autophagy를 정지시킵니다[104,108]. 종 C 바이러스는 초기 엔도좀에서 탈출하는 것으로 나타났습니다[110]. A, B, D를 포함한 다른 종은 세포질로 탈출하기 전에 먼저 리소좀으로 이동하며[111-113], 이러한 바이러스에 의해 유발되는 면역 활성화에 영향을 미칠 수 있습니다[114].
광고가 세포질에 도달하면 다이네인 모터와 결합하고 미세소관을 따라 역행 수송을 사용하여 미세소관 구성 센터에 도달합니다[115-117]. 모터 결합은 아마도 헥손[115]에 의해 매개되며 산성 프라이밍이 필요할 수 있습니다[118]. 핵 부근에서 캡시드는 아마도 키네신 모터 단백질에 결합하고 핵 외피에 축적함으로써 수송 방향성을 전환합니다[115,117,119,120]. 그들은 핵공 복합체에 도킹한 다음 캡시드가 완전히 분해되고 게놈이 방출되어 핵으로 유입됩니다[51,121-124]. 일단 핵 안으로 들어가면 게놈의 전사 활성화와 다른 모든 초기 전사 단위의 전사 인자 역할을 하는 초기 E1A 유전자의 발현에 의해 주기가 계속됩니다[60,125-130]. 복제 효소의 발현에 따라 바이러스 게놈이 복제되고 복제 센터 주변에 축적됩니다[131].
그런 다음 구조 단백질은 주요 후기 프로모터의 제어 하에 후기 발현 단위에서 발현됩니다[132,133]. 후기 유전자의 발현은 모든 구조 단백질의 생산 및 핵 축적에서 절정에 이르며, 여기서 이들이 자손으로 조립되고 새로 합성된 게놈을 포장합니다. 차세대 광고의 핵 조립은 입자 유출 및 세포 용해를 초래합니다[42,134-136]. 위에서 언급한 바와 같이, 캡시드 조립 후 성숙, 즉 감염성 입자를 생성하기 위해 AVP에 의한 여러 캡시드 단백질의 단백질 분해 절단이 뒤따릅니다[66]. 이 과정의 중요성은 온도에 민감한 돌연변이인 Ts1이 처음에 Ad2의 돌연변이 유발 스크린에서 확인된 것으로 예시됩니다. 비허용 온도에서 이 돌연변이는 AVP 패키징에 실패하고 조립된 입자는 성숙을 거치지 않아 초안정 입자가 됩니다[137]. 책임 있는 AVP 돌연변이는 이 표현형을 유지하면서 Ad5에 유 전적으로 도입되었습니다. Ts1 캡시드는 여전히 세포 수용체에 부착할 수 있고 엔도사이토시스될 수 있지만 단백질 VI을 유리시키지 못하기 때문에 엔도좀에 갇힌 상태로 남아 있습니다[103,138,139].
2. 아데노바이러스의 면역 검출
아데노바이러스는 널리 퍼져 있으며 인구의 대다수가 주로 어린 시절에 이 바이러스에 직면했습니다. 아데노바이러스는 면역원성이 매우 높으며 모든 만남은 평생 지속될 수 있는 선천적 및 적응적 특정 항-Ad 면역의 발달을 유발합니다. 이것은 바이러스와의 싸움에서 중요하고 면역 능력이 있는 숙주에게 광고가 덜 해롭도록 만들지만 광고가 백신학이나 유전자 치료에서 벡터로 사용될 때 장애물이 될 수 있습니다[140,141]. Ad(및 그 벡터 파생물)가 면역 체계를 활성화하는 방법을 이해하면 백신의 효과와 안전성을 개선할 수 있습니다. 임상 시험에 참여하는 환자의 생체 내 관찰은 Ad 기반 벡터가 강력한 면역 활성화[142,143]를 유도할 수 있으며 때로는 치명적인 결과를 초래할 수 있음을 분명히 보여주었습니다[144].
또한 시험관 내 또는 동물 모델에서 수행된 다양한 연구[145]는 초기 면역 반응을 활성화하는 데 있어 바이러스 입자 자체(즉, 캡시드 및 통합된 DNA)의 핵심 역할을 제안합니다. 여기에서는 입력 캡시드와 관련된 면역 반응에 간략하게 초점을 맞춥니다. 보다 심층적인 개요는 이전에 게시된 리뷰[146–149]를 참조하십시오.
2.1. 아데노바이러스는 세포 내재적 면역을 유발합니다
광고가 벡터로 개발되면서 광고에 의해 유도된 세포 고유 또는 선천 면역이 침입한 비리온에 대한 반응이라는 것이 명백해졌습니다. 흥미롭게도, 복제 및 비복제 바이러스(즉, UV 불활성화 바이러스, 비복제 벡터 또는 빈 캡시드) 모두 감염된 세포에서 면역 반응을 활성화하여 캡시드가 이 반응에서 핵심 역할을 한다는 것을 보여줍니다[145,150-156] .
일반적으로 광고는 전체 바이러스 수명 주기에 걸쳐 여러 단계에서 세포에 의해 감지되고 선천적 면역 경로를 활성화합니다(그림 1). 이 활성화는 전사 인자 NF-κB의 활성화로 이어지는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 신호를 활성화하는 세포 표면 수용체 CAR에 결합하는 Ad 섬유로 시작됩니다. 이 트리거는 전 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8) 생성을 초래합니다[157,158]. 그러나 Ad 종에 따라 다른 수용체의 사용이 사이토카인 발현과 관련된 신호 캐스케이드의 강도를 조절할 수 있습니다[159]. 바이러스 펜톤과 세포 인테그린 사이의 상호 작용은 면역 활성화의 추가 트리거입니다. 뮤린 대식세포에 대한 연구는 이 결합이 RGD 모티프를 통해 IL-1의 발현을 활성화한다는 것을 보여주었습니다[160]. 이는 다른 세포 모델(예: HeLa, 상피 세포주)에서 케모카인 및 전염증성 사이토카인 생산에서 인테그린/RGD 상호작용의 역할이 확인되지 않았기 때문에 면역 세포로 제한될 수 있습니다[151,161,162]. 이것은 인테그린과의 상호 작용보다 면역 활성화에서 내재화 과정 자체의 더 중요한 역할을 시사합니다. 실제로, integrin에 대한 penton 결합은 phosphoinositide 3-kinase(PI3K) 신호를 활성화하여 바이러스 내재화를 증가시킵니다[163].
또한 PI3K 활성화는 Ad 감염 시 TNF와 같은 전 염증성 사이토카인의 생성을 유발하는 것으로 나타났으며 [164], 내재화 과정은 면역 활성화에 필요한 것으로 설명되었습니다 [165]. 이러한 연구는 면역 활성화가 주로 내재화 후 단계에서 발생하며 진입 후 분류의 중요성을 강조합니다([166]에서 검토됨).
일단 엔도솜에 들어가면 광고는 면역 세포에 제한된 이중 가닥 DNA 센서인 TLR9와 같은 관내 병원체 인식 수용체(PRR)에 노출됩니다. 뮤린 대식세포는 TLR9를 통해 Ad 벡터를 감지하여 전염증성 사이토카인의 생성을 유도할 수 있습니다[167]. TLR9는 또한 뮤린 형질세포형 수지상 세포(pDC)가 Ad로 챌린지되었을 때 IFN/생산에 엄격하게 요구되었습니다[168]. 그러나 TLR9 녹아웃 마우스 모델에서는 IFN/h가 여전히 생성되어 pDC 이외의 세포에서 IFN 생성이 TLR9 신호전달과 독립적으로 발생함을 시사한다[168,169].
바이러스 게놈(또는 벡터 게놈)은 바이러스의 엔도좀 탈출 도중 또는 이후 감지에 접근할 수 있게 됩니다. 세포질에 도달하면 세포질 이중 가닥 DNA 센서 cGAS에 의해 감지됩니다[168,170]. 바이러스 게놈 인식 시 cGAS는 전사 인자 IRF3의 인산화 및 핵 전위를 촉진하여 IFN/발현을 유도하여 항바이러스 상태를 유도합니다. 엔도솜 통과는 바이러스 입자의 엔도솜 탈출을 촉진하기 위해 바이러스 유도 엔도솜 막 손상을 필요로 합니다. 따라서 막 파열은 면역 활성화에 상당히 기여하며 탈출 결함 Ts1 돌연변이가 완전하고 효율적인 면역 반응을 활성화하지 못한다는 사실에 의해 강조됩니다[161,162,170,171]. Ad 막 침투 시 염증 반응에서 중추적인 역할은 탱크 결합 키나제인 TBK1에 의해 수행되며, 이는 cGAS/STING 경로를 통해 바이러스 게놈의 다운스트림 세포질 감지의 일부인 것으로 제안되었습니다[168,170].
아데노바이러스 막 손상은 또한 endo-lysosomal 구획에서 cathepsin B의 방출을 초래하여 산화 스트레스를 유발하여 NLRP3 inflammasome을 활성화하여 IL-1 성숙을 초래합니다[114]. 종 C 바이러스는 초기 엔도솜에서 탈출하는 반면, 종 B 바이러스는 아마도 수용체 사용의 차이로 인해 후기 엔도솜까지 이동합니다. 후기 엔도좀/리소좀의 산성화는 리소좀 산 가수분해효소를 활성화할 가능성이 더 높습니다. 두 종 모두 inflammasome 활성화를 유도하지만[172], 아마도 엔도솜에 머무르는 시간 때문에 반응의 정도가 다릅니다. 전 세계적으로 종 B 바이러스는 종 C 바이러스보다 더 강한 선천성 및 적응성 면역 활성화를 유도합니다[113,173,174]. 이는 B종 바이러스가 더 병원성이 강하여 면역 능력이 있는 숙주에서 발생하는 이유를 설명할 수 있습니다[26]. 또한 세포가 침투 구획(즉, 엔도좀 대 리소좀, [109])을 구별하고 면역 효율을 조정할 수 있음을 시사합니다. Ad 탈출 과정 중 Endosomal 막 손상은 그 자체로 위험 신호일 수 있습니다. 아래에서 자세히 논의되는 바와 같이, 막 손상은 내강 내 글리칸의 세포질 노출을 초래하며, 이는 세포에 의해 위험 신호로 감지됩니다([109]에서 검토된 바와 같이). 갈렉틴에 의해 노출된 글리칸의 검출은 이후 자가포식을 활성화하여 항바이러스 면역의 두 번째 분기를 촉발합니다[108].
2.2. 아데노 바이러스는 적응 면역 반응을 유발하고 세포 진입시 항 바이러스 자가 포식을 파괴합니다
Ads 또는 그 벡터에 의해 유발된 선천 면역 반응은 이후 면역 세포(호중구, 자연 살해 세포 및 대식세포)를 끌어들이고 강력한 항원 제시를 강화하는 케모카인 분비를 통해 적응 면역으로 변환됩니다[153,154]. 아데노바이러스는 면역원성이 매우 높으며 주요 면역원은 B 세포에 의한 중화 항체의 종 특이적 생성을 유발하는 주요 캡시드 단백질(헥손, 펜톤 및 섬유)입니다[175-177].
중화 항체는 대부분 헥손 단백질의 초가변 루프에 대해 지시되며 [178-180] 동일한 혈청형에서 파생된 벡터로 광고를 사용하는 데 주요 제한 사항을 나타냅니다. 이 문제는 덜 혈청적이거나 인간이 아닌 광고의 사용으로 우회되었습니다[181-185]. 이러한 항 벡터 면역에도 불구하고 광고가 백신 플랫폼으로 사용될 때(예: 임상 시험에서 에볼라에 대한 면역 보호를 유도하기 위해) 광고는 여전히 강력한 B 세포 반응을 유도하여 원하는 백신 면역원에 대한 항체를 생성할 수 있습니다. 최대 6개월 동안 [186]. 또한 혈청 유병률이 높은 AdC5 [187]를 기반으로 한 SARS-CoV-2 백신 벡터의 경우와 같이 더 높은 백신 벡터 용량으로 기존 벡터 면역을 극복할 수 있습니다.
중화 항체와 마찬가지로 Ad 감염은 주로 CD4 플러스 활성화를 통해 지속적인 T 세포 면역을 유발합니다. 이러한 보호는 성인에게서도 여전히 발견될 수 있으며 어린 시절부터 오래 지속되는 면역성을 시사합니다[188-190]. 또한, CD8 플러스의 활성화는 또한 세포독성 반응을 유지하는 것으로 설명됩니다[191-193]. 이 T 세포 활성화는 반드시 혈청형 특이적인 것은 아니며 다른 Ad 하위 그룹 및 혈청형에 대한 교차 보호를 허용합니다[192-194].
또한, Ad에 감염된 줄기세포 이식 환자에서 CD4 plus 및 CD8 plus의 강력한 활성화가 설명되었습니다[195]. 이 활성화는 헥손 펩타이드에 대한 것이며 Ad 바이러스혈증의 제거로 이어지며 면역 보호에서 CD4 플러스 및 CD8 플러스 T 세포 활성화의 주요 역할을 강조합니다. 이 T 세포 기반 면역은 Ad 입자에 대해 지시되지만 Ads는 또한 백신 항원에 대한 T 세포 반응을 기반으로 강력한 세포 면역을 유발하므로 재조합 Ad 벡터를 백신 플랫폼으로 사용할 때 오래 지속되는 면역에 유리합니다 [196,197 ]. 중요한 것은 임상 시험 데이터에서 Ad가 백신 플랫폼으로 사용될 때(원하는 항원을 이식유전자로 사용) 세포독성 CD8 + T 세포 및 CD4 + T 세포 활성화를 모두 유도하여 발현된 도입유전자[184,186,198-202].
T 세포 활성화는 주요 조직 적합성 복합체(MHC)를 통한 바이러스 펩타이드의 제시에 의존합니다. 간단히 말해서, MHC 클래스 I에 의한 항원 제시는 프로테아좀 분해의 결과이며, 얻어진 펩티드는 CD8 플러스 T 세포 활성화를 유도하여 세포독성 T 세포 반응의 프라이밍 및 증식을 허용합니다. MHC 클래스 II 항원 제시는 리소좀 단백질 분해의 결과이며 생성된 펩타이드는 제시 시 CD4 + T 세포 활성화를 유도하여 B 세포의 후속 활성화를 촉발합니다[203]. 이제 autophagy가 MHC 클래스 II 분자에 대한 펩티드 제시를 촉진한다는 것이 잘 알려져 있습니다[204]. 당연하게도, autophagy는 감염에 대한 가장 오래된 방어 메커니즘 중 하나이며 선천적 면역 반응과 적응 면역 반응 모두에 참여하는 침입하는 병원체에 대한 세포 레퍼토리의 중요한 부분입니다. 그것은 분해(xenophagy)를 위해 병원균을 직접 격리할 수 있고 면역 체계에 대한 제시에 참여할 수 있습니다[205-207]. Macroautophagy (더 일반적으로 autophagy라고 함)는 항상성 및 선천적 및 적응 면역과 같은 많은 근본적인 생리적 과정에 참여하는 보존된 리소좀 분해 경로입니다 [208-210]. Autophagy는 분해될 예정인 세포질 화물(즉, 소기관, 응집체 및 병원체)을 삼키는 "autophagosome"이라고 하는 이중 막 소포의 형성을 특징으로 합니다(그림 2). 이 과정에서 화물을 포함하는 자가포식소체는 리소좀과 융합되어 분해되고 재활용됩니다.
자가포식을 통한 항원 제시는 MHC 클래스 I과 클래스 II 모두에 대해 설명되었습니다[204]. 자가포식 유도 후, 세포내 항원은 자가포식소체에 삼켜지고 MHC 클래스 II 포함 구획과 융합하여 외부 병원체 물질을 제공합니다(그림 2)[211]. 이 특정 MHC 클래스 II 항원 제시에서 autophagy의 역할은 Epstein-Barr 바이러스 감염에 대해 처음 설명되었으며 autophagy의 억제는 CD4 + T 세포 활성화를 감소시켰습니다[212,213]. 지금까지 예로는 단순 헤르페스 바이러스[214], 인플루엔자 바이러스[215] 및 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)[216]을 포함한 여러 바이러스가 포함되며 아마도 광고까지 확장될 것입니다(아래 참조). MHC 클래스 II 제시는 세포질 방어 메커니즘이기 때문에 자가포식 과정과 일치합니다. 자가포식은 또한 세포외 항원의 MHC 클래스 II 교차 제시에 관여합니다[214]. 실제로, 세포외 오발부민의 MHC 제시는 자가포식 기구(특히 ATG5)가 기능할 때 더 효율적이며, 세포외 물질의 흡수는 LC3-연관 식세포작용이라고 하는 비표준 형태의 자가포식을 포함하는 것으로 나타났습니다. 랩) [217].
일단 LAP-some에 존재하면 일부 세포 외 항원이 MHC 클래스 II 제시를 통해 노출될 수 있습니다[218]. 자가포식은 또한 MHC 클래스 I 제시에 어느 정도 관여하지만, 대다수의 에피토프는 항원 처리(TAP) 복합체와 관련된 수송체에 엄격하게 의존하는 메커니즘을 통해 제시됩니다[219]. 자가포식에 의해 매개되는 TAP 독립적인 제시는 지금까지 TAP 고갈 조건에서만 나타났습니다[219,220]. 이 표현 방식이 실제로 존재하는지 여부는 논란의 여지가 있으며 [221] 다른 곳에서 논의됩니다 [204,222,223].
MHC 프리젠테이션을 방지하기 위해 Ads는 세포의 MHC 프리젠테이션 시스템을 약화시키기 위해 많은 양의 게놈, 즉 E3 영역을 바칩니다[224-228]. 대부분의 (백신) 벡터에는 이러한 유전자가 없으며 최근 연구에서는 MHC에 의한 항원 제시를 증가시키면 Ad 백신 효율이 향상될 수 있다고 제안합니다[229,230]. Autophagy는 Ad 유도 면역에서 MHC 클래스 II 제시를 위해 Ad 항원을 처리하는 데 중요한 역할을 합니다[108,229].
Montespanet al. Ad는 엔도좀 침투 시 자가포식을 유도하고 이 과정에서 자가포식에 의해 제거된 입자가 면역 체계에 효율적으로 제시됨을 보여주었습니다[108]. 이 관찰은 Klein et al.에 의해 발표된 연구와 일치합니다. 종양 용해 광고의 맥락에서 바이러스 항원이 JNK 의존적 형태의 autophagy에 의해 성숙된다는 것을 보여줍니다[229]. 그러나 암과 관련하여 autophagy는 이중 역할을 합니다. 항상성 유지자로서 자가포식은 종양 개시를 제한하는 반면[231] 진행된 암에서 자가포식은 종양 성장을 선호하는 생존 과정으로 작용합니다[232,233]. 따라서, 종양 용해 벡터의 맥락에서, 종양 특이적 자가포식 기능은 신중하게 평가되어야 합니다.
3. (백신) 벡터로서의 아데노바이러스
바이러스의 벡터화는 관련된 생물학적 위험을 최소화하는 동시에 자연적 특성을 이용하는 것을 포함합니다. 이러한 측면에서 광고는 백신 개발을 위한 우수한 벡터 후보입니다[234]. 아데노바이러스 벡터는 안정적이고 높은 역가로 생산하기 쉽고 큰 클로닝 용량을 가지고 있습니다. 이것은 이식유전자의 삽입, 즉 선택한 항원을 발현할 수 있게 합니다. 그들은 광범위한 감염 스펙트럼을 가지고 있고 분열하지 않는 세포를 형질도입하며, 그들의 게놈은 비통합적입니다[1]. 위에서 설명한 바와 같이, 그들은 또한 효과적인 백신 접종에 필요한 면역 반응을 증폭시키는 보조제 기능을 하는 항원 제시 세포(APC)에서 염증 반응을 유발합니다[2,3,142,235,236].
또한 Ad 유래 벡터는 그 안전성을 입증하기 위해 전임상 및 임상 시험에서 광범위하게 사용되고 있다[237,238]. 복제 주기에서 원하지 않는 부분을 제거하려면 바이러스 복제를 억제하여 세포 용해 및 바이러스 전파를 방지해야 합니다. 아데노바이러스 벡터 개발은 1990년대 초반에 유전자 치료, 종양 용해 벡터, 백신 개발과 같은 광범위한 치료적 접근을 위한 플랫폼으로 시작되었습니다. 초기 벡터 개발의 대부분은 종 C 바이러스의 변형된 버전이었습니다.
3.1. 아데노바이러스 벡터 개발, 세대별 접근
Ad 벡터의 1세대는 바이러스 게놈에서 E1 및 E3 영역을 삭제하여 만들어졌으며, 특히 즉시 초기 전사 인자를 암호화하여 이러한 벡터가 복제되는 것을 방지합니다. 이 벡터는 조절 서열이 있는 이식유전자를 삽입하기 위해 약 8kb의 클로닝 용량을 가졌습니다[239-241]. 1세대 벡터는 트랜스에서 E1 영역을 보완하는 Ad5 바이러스 게놈의 일부로 안정적으로 형질전환된 인간 배아 신장(HEK) 세포에서 생산되었습니다[242-247]. 이 시스템의 주요 단점 중 하나는 자발적 재조합 후 복제 가능 게놈의 재구성을 허용한다는 것입니다[248]. 벡터 생산에 필요하지 않은 E3의 추가 결실은 도입 유전자 카세트의 크기를 증가시키고[243] 더 나은 면역 반응을 촉진합니다[240].
불행하게도, 1세대 Ad 벡터는 전사적으로 완전히 불활성화되지 않았으며 기준선 수준에서 발현되는 바이러스 캡시드 단백질에 대해 여전히 강력한 면역 반응을 이끌어 냈습니다[141,249,250]. 이 렌티벡터 면역은 벡터 독성과 형질도입된 세포의 단기 제거에 기여했습니다[145]. Ad 벡터의 2세대는 추가로 벡터 게놈에서 E2 및 E4 영역을 제거했습니다. E2는 복제 효소와 E4 추가 조절 단백질을 암호화합니다[251-253]. 이것은 최대 4개의 발현 카세트를 포함하여 10.5kb의 이식유전자 서열을 위한 공간을 허용했습니다[254]. 마찬가지로, 추가적 결실은 원하지 않는 재조합과 장기간 도입유전자 발현을 크게 감소시켰다[255]. 이것은 아마도 항 벡터 면역을 더욱 감소시키는 비정상적인 바이러스 유전자 발현 감소의 결과일 것입니다[141,250,251]. 3세대 아데노바이러스 벡터는 개념적으로 다릅니다. 패키지된 벡터 게놈과 벡터 입자를 생성하는 패키지되지 않은 바이러스 게놈(헬퍼 바이러스)으로 구성됩니다. 이러한 벡터는 "헬퍼 의존성", "무감각" 또는 "고용량"(HC-Ad) 벡터로도 알려져 있습니다. 그들은 가능한 가장 높은 복제 용량을 가지고 있으며 최대 36kb [256–258]의 시퀀스를 전달할 수 있습니다. 고용량 광고에는 ITR과 게놈 패키징을 허용하고 헬퍼 바이러스에 없는 짧은 캡슐화 신호를 제외한 바이러스 코딩 시퀀스가 없습니다[259-262]. 이 전략을 통해 대부분의 항 벡터 면역을 마침내 극복할 수 있었고 이식유전자의 장기간 발현이 가능해졌습니다[263–267]. 그러나 HC-Ad는 현재 백신 벡터 레퍼토리의 일부가 아닙니다.
3.2. 백신 벡터로서의 아데노바이러스
Ad 벡터가 어떻게 악용되었는지 알아보기 전에 Ad 종 B 바이러스 유형 4 및 유형 7 자체에 대한 백신이 1970년대 초에 개발되었다는 점을 언급하는 것이 주목할 만합니다[268]. 이 경구 생백신은 2011년부터 미국의 신병 모집에 의무화되었으며 감염률을 극적으로 감소시켜 사실상 0에 도달했습니다[269-271]. 이는 백신으로서 광고의 본질적인 효율성과 안전성을 부각시켰고 광고를 백신 플랫폼으로 사용할 수 있는 분야를 열었습니다. 현재까지 200개가 넘는 광고 기반 백신이 임상 시험에 들어갔다[272]. 그들 중 다수는 HIV-1 및 에볼라[230,273,274]와 같은 감염성 병원균에 대한 것입니다. 아데노바이러스 기반 백신에 결점이 없는 것은 아닙니다. 종 C 바이러스 Ad5를 기반으로 최근에 개발된 항 HIV 백신은 HIV-1 gag, pol 및 nef 유전자를 발현하는 벡터의 혼합물을 사용했습니다[275,276]. 벡터는 안전하고 면역원성이었으며 내약성이 우수했습니다. 불행하게도 결과적인 STEP 임상 시험은 조기에 중단되어야 했습니다[277–279]. 이 백신은 HIV 감염을 예방하지 못하는 것으로 나타났을 뿐만 아니라 역학 데이터에 따르면 이 경우 Ad 백신 접종은 HIV 감염 위험을 증가시켰습니다[280-282]. Ad5에 대한 기존 면역을 갖는 것은 잠재적인 백신 접종 후 위험 인자로 확인되었다[283,284]. 그러나 이러한 관찰은 유사한 연구[285,286]에서 확인되지 않았으며 기계적으로 불분명한 상태로 남아 있습니다[287,288]. HIV 다음으로 서아프리카에서 재발하는 위협인 에볼라(Ad-EBOV)와의 싸움에서 광고 기반 벡터 백신이 개발되었습니다[289]. 모든 Ad-EBOV 백신은 에볼라 당단백질(GP)을 백신 항원으로 사용합니다. 설치류와 영장류에 대한 초기 전임상 시험에서는 Ad5를 사용했으며 중화 항체 생산과 CD8 플러스 활성화로 3개월 동안 보호를 보여주었습니다[273,290-292]. 이 백신은 2상 임상 시험을 거쳤습니다. 그러나 예방 접종을 받은 집단에서 Ad5에 대한 기존의 면역은 유도된 중화 항체의 수준에 변화를 가져왔습니다[293-297]. 이 문제를 극복하기 위해 덜 널리 퍼진 D Ad26 종을 기반으로 한 백신이 개발되었습니다[186,298,299].
그러나 Ad26은 인간에서 면역원성이 낮아 예방접종 효율이 떨어지고 홍역 바이러스 기반 백신(MVA)을 사용한 프라임 부스트가 필요했습니다. 이 백신 접종 요법은 3상 임상 시험에 도달했습니다[289,300,301]. 인간이 아닌 Ad 벡터의 사용도 개발 중입니다[184]. 침팬지 ChAd3를 EBOV에 대한 백신 플랫폼으로 사용하면 설치류와 침팬지에서 보호 효과가 나타났으며[302,303], 이러한 벡터를 사용하는 임상 시험은 서로 다른 진행 단계에 있습니다[17,300,301,304-306].
최근까지 HIV-1 및 EBOV 백신은 광고 벡터 기반 백신 적용의 두 가지 주요 예였지만, 유일한 것은 아닙니다. Mycobacterium tuberculosis[307-310], 뎅기 바이러스[311-313], B형 및 C형 간염[314-320], 광견병[321-324] 또는 인플루엔자와 같은 다양한 병원체에 대해 Ad 백신 벡터를 사용하려는 다양한 시도가 있었습니다. [325–328]. 그러나 그 효능은 항상 기대 이하였습니다(자세한 내용은 [18,142,300,329] 참조). EBOV 백신 후보는 실질적으로 적용되는 유일한 Ad 백신으로 남아 있으며 콩고 민주 공화국에서 일부 제한 사항과 함께 사용됩니다. 이 백신은 Ad26 type(Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO)을 기반으로 하며, 2020년 5월 현재 20,339명이 1차 접종을 받았고, 9,560명이 접종을 완료했다[230,301,330].
아데노바이러스 벡터화 백신은 SARS-CoV-2 대유행에 대응하여 대중에게 큰 호응을 얻었습니다. 상황의 긴급성으로 인해 이전에 지역적으로 한정된 SARS-CoV-1 발병을 일으킨 코로나바이러스에 대해 제기된 백신으로 얻은 경험을 포함하여 개발을 활용할 수 있게 되었습니다[331]. 코로나바이러스 스파이크(S) 당단백질은 코로나바이러스 감염에 대한 면역을 위한 최고의 백신 항원으로 확인되었습니다[332,333]. 현재까지 모두 스파이크 항원을 암호화하는 4개의 Ad 벡터 백신이 발전된 상태에 있으며 전 세계 많은 지역에서 긴급 사용이 승인되었습니다. 적용된 벡터 전략은 약간 다르지만 기본적으로 1세대 벡터를 사용합니다. 그것들은 종 C Ad5- 기반 벡터(Ad5-nCoV) 사용, 높은 벡터 용량(CanSino)으로 기존 면역 극복[187,334], 덜 널리 퍼진 종 D 바이러스 사용에 이르기까지 다양합니다. 안정화된 스파이크 당단백질(JNJ-78436735/Ad26.COV2.S)을 사용하는 Ad26[335]. 다른 접근 방식은 침팬지[336,337]의 Ad 벡터인 ChAdOx1-S-(AZD1222)를 사용합니다. 벡터 면역을 극복하기 위한 이종 프라임-부스트 전략(Gam-COVIDVac/Sputnik V)을 기반으로 사용 중인 유일한 백신은 먼저 Ad26- 기반 벡터를 적용한 다음 부스터 주입에서 Ad5 벡터를 사용합니다[338,339]. 모든 경우에 임상 시험 데이터는 높은 수준의 유도된 보호 면역을 보여 매우 유망했으며 여러 국가에서 광고 기반 백신 사용을 위해 긴급 사용이 승인되었습니다. 또한 여러 국가에서 진행 중인 백신 접종 캠페인에 대한 역학 조사는 광고 기반 SARS-CoV-2 백신 사용에서 압도적인 성공을 시사합니다.
4. 아데노바이러스(백신) 벡터 효능 조절, 캡시드가 앞장서다
아데노바이러스(백신) 벡터 디자인은 몇 가지 요인을 고려해야 합니다. 여기에는 암호화된 항원의 길고 지속적인 발현 유지 및 항원 발현을 벡터 자체가 아닌 면역원에 대한 지속적인 적응 면역으로 효율적으로 번역할 수 있는 면역학적 맥락(보조 효과)의 활성화가 포함됩니다. 면역학적 맥락은 백신 벡터가 투여 동안 유도하는 선천적 면역 활성화에 의해 제공됩니다. 이러한 맥락에서 선천적 면역 센서가 벡터를 감지하는 효율성이 중요하며 적응 반응의 진폭을 결정하게 됩니다. 위 섹션에서 설명한 바와 같이, 선천성 면역 감지는 주로 진입 후 수준에서 발생하며 Ad 엔도좀 침투와 동시에 발생합니다. (백신) 항원의 효율적인 발현은 벡터 클리어런스 수준 대 벡터 게놈의 핵으로의 성공적인 전달 및 발현 사이의 균형에 따라 달라집니다. 캡시드 디스플레이 벡터의 개발로 인해 면역 활성화를 유도하기 위해 도입 유전자의 발현이 필요하지 않습니다. 이 전략은 관심 있는 에피토프를 Ad 캡시드 단백질에 삽입하여 면역 체계에 직접 노출시키는 것을 기반으로 합니다. 이 접근법이 몇 가지 장점이 있더라도 대부분의 백신 벡터는 유전적으로 암호화된 유전자에 의존합니다. 캡시드 디스플레이 벡터에 대한 자세한 내용은 이 리뷰 [340,341]를 참조하십시오.
바이러스 벡터에 대한 기존 면역(예: 지리적 위치에 따라 종 C 바이러스 Ad5에 대한 30-90%)은 벡터 흡수를 감소시키고 항원 발현 및 그에 따른 면역 반응을 감소시킬 수 있습니다[342-344]. 항 벡터 면역을 감소시키기 위한 몇 가지 전략이 개발되었으며 최근에 검토되었습니다[249]. 간단히 말해서, 중화 항체는 주로 엑손의 초가변 루프를 인식하고 결과적으로 혈청형 특이적입니다[178-180]. 따라서 이러한 초가변 루프는 덜 널리 퍼진 다른 혈청형 [178,345]의 루프로 대체될 수 있습니다. 이것은 벡터가 중화되고 비활성화되는 것을 방지합니다. Ad5가 가장 흔한 유형이므로 Ad26, Ad35 또는 비인간 광고와 같은 드문 혈청형을 사용하면 이 문제를 피할 수 있습니다[177,346-350].
그러나 희귀종 사용의 주요 단점은 면역원성이 낮아 백신 개발 효율성이 낮다는 점입니다[298]. 따라서 가장 효율적인 벡터를 얻기 위해서는 벡터 면역원성을 강화하는 전략과 병행하여 항벡터 면역을 감소시키는 전략이 개발되어야 한다. 벡터에 대한 중화 항체의 초기 수준이 낮더라도 주어진 벡터 유형으로 백신을 접종하면 향후 사용을 막는 반응을 유발할 수 있습니다. 항 벡터 반응의 프라이밍은 벡터 입자가 항원 자체로 분류되고 처리되는 진입 후 수준에서도 발생합니다. 예방접종 성공에 대한 면역학적으로 유리한 상황을 도출하는 것은 벡터 면역에 대한 프라이밍 증가를 희생하는 대가로 올 수 있습니다. 섭취 후 광고 벡터의 운명을 결정하는 매개변수를 이해하면 벡터 디자인을 위한 기회를 제공할 수 있습니다.
4.1. 종의 안정성
endo-lysosomal 구획에서 수용체 매개 흡수 및 탈출은 Ad 감염 및 벡터 형질 도입의 특징입니다. 초기 흡수는 바이러스 섬유 및 펜톤 분자와 세포 수용체의 상호작용에 의해 결정됩니다. Fiber와 penton은 모든 광고에 공통적이지만 종에 따라 서로 다른 세포 수용체와 결합합니다(표 1). 종 C 바이러스는 CAR을 사용하고 유입 입자는 초기 엔도솜 구획에서 탈출합니다[79]. 종 C 바이러스(Ad5)가 종 B 바이러스(Ad16)의 섬유 분자를 포함하도록 조작된 경우 결과 입자(Ad5F16)는 초기 입자 대신 리소좀 구획(리소좀 마커 LAMP1으로 염색하여 표시됨)에서 탈출합니다. 엔도좀[351]. 이 리소좀으로부터의 지연된 탈출은 테스트된 모든 종 B 바이러스와 공유되는 특징입니다[111,352,353].
또한, 잡종 Ad5F16 및 종 B 바이러스는 종 C 바이러스보다 더 강력한 전염증성 반응을 유도합니다[159,351]. 이것은 면역 세포에서 intraluminal TLR9를 통한 증가된 검출에 기인합니다[354]. 또한, 리소좀 막 손상은 초기 엔도솜 손상과 달리 강한 산화적 스트레스를 유발한다. 리소좀 파열은 미토콘드리아를 손상시킬 수 있는 카텝신 B와 같은 리소좀 가수분해효소를 공동 방출하여 인플라마좀 활성화를 통해 손상 반응을 증폭시킵니다[355-357]. Ad 섭취 과정은 캡시드를 불안정하게 만들어 바이러스 단백질 VI의 방출을 허용합니다[103,106]. 방출된 단백질 VI는 바이러스가 세포질에 접근할 수 있도록 endo-lysosomal 구획 내에서 막을 관통합니다. 종 C와 B를 비교하면 두 바이러스 모두 세포질 진입과 게놈 전달에서 동등하게 효율적이지만 탈출 역학이 다릅니다[111]. 간단한 섬유 교환이 종 B에서 종 C 바이러스로 진입 및 면역원성 특성을 옮길 수 있다는 사실은 주목할 만합니다. 특정 속성을 가진 하이브리드 벡터를 설계할 수 있다는 개념 증명을 제공합니다. 근본적인 차이점은 단백질 VI 방출이 종 B 바이러스(또는 하이브리드 바이러스)에서 지연되고 산성화 또는 다른 알려지지 않은 분해 트리거가 필요할 수 있다는 것입니다.
이 경우 단백질 VI 방출이 지연되기 때문에 이는 증가된 캡시드 안정성을 반영할 수 있습니다. 실제로 종 C Ad5 바이러스는 세포 결합 시 섬유 분자를 방출하는 것으로 나타났습니다. 이 단계는 캡시드를 약화시키고 단백질 VI 방출을 위한 분해 과정을 시작하는 것으로 추정됩니다. 이러한 맥락에서 섬유가 없는 Ad5는 천연 입자보다 덜 안정적인 것으로 나타났습니다[358]. 반면에 성숙되지 않은 매우 안정적인 Ts1 Ad2/5는 섬유소나 단백질 VI를 방출하지 않으며 TLR9를 유발하지도 않고 막 손상을 일으키지도 않기 때문에 염증을 잘 유발하지 않습니다[114,138,359,360].
종 B와의 섬유 교환이 초기 섬유 방출을 방지하고 종 C 캡시드를 더 안정적으로 만드는지 여부는 조사되지 않았지만 가능성이 있습니다. 캡시드 안정성은 진입 후 캡시드 운명의 필수 결정 요인일 수 있으며 확장하여 벡터 설계에 활용할 수 있는 기능일 수 있습니다. 종 B 바이러스는 다른 수용체를 사용하거나 독특한 섬유-펜톤 상호작용을 통해 더 안정적일 수 있습니다. 대조적으로 종 F 바이러스 Ad40/41은 위장관을 감염시키고 가혹한 장 환경에 대한 적응과 향성으로 인해 캡시드 안정성이 증가했습니다[24,361]. 내장은 종 C 바이러스가 표적으로 삼는 상기도보다 몇 도 높은 고유 온도를 가지고 있습니다(37ºC vs. 33ºC) [362]. 따라서 Ad40/41은 본질적으로 열에 더 안정적이어서 감염 과정을 지원하고[24] 전파하기 어렵게 만듭니다[24,361,363].
또한 펜톤 분자에 RGD 모티프가 없기 때문에 세포 유입이 더욱 감소합니다[92]. 이러한 고유한 캡시드 특성이 리소좀 구획으로부터의 탈출로 변환되는지 또는 진입 시 부분 분해/단백질 VI 방출 결함으로 변환되는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 대조적으로, 이러한 특성은 경구용 백신 적용 개발을 위한 맥락을 제공할 수 있습니다. 종 B 섬유와 달리 종 F 섬유 함유 벡터는 표준 환경 조건에 적용될 때 면역 활성화가 감소합니다[364]. 주어진 인간 광고 종이 이제 맥락에서 벗어나 백신 벡터로 사용된다면, 이 벡터의 자연 친화성(natural tropism)을 살펴보고 그 행동을 예측하는 단서를 찾는 것은 가치가 있을 수 있습니다. 현재 사용되고 있는 Ad26 기반의 백신 벡터는 종 D 바이러스이며, 그 천연 향성은 눈과 위장관이다[365]. Ad26을 포함한 종 D 바이러스는 Ad5보다 면역원성이 낮고[366] 단백질 VI 방출 지연과 관련하여 후기 엔도솜 구획으로 이동하는 것으로 나타났습니다.
결과적으로 후기 엔도솜 구획의 산성화를 차단하면 면역원성이 더욱 감소했습니다[113]. 인간 광고와 달리 백신 접종 및 벡터화에 사용되는 비인간 광고에 대한 지식은 매우 제한적입니다. ChAd3을 포함한 침팬지 유래 광고는 종 D 바이러스와 밀접한 관련이 있습니다[367,368]. 흥미롭게도, Ad5 벡터는 침팬지 유래 Ad 벡터보다 더 면역원성이고 더 높은 형질도입 가능성을 갖는다. 이 관찰은 penton RGD 모티프 또는 섬유의 차이와 연결되지 않았으며 그 기계적인 이유는 아직 알려지지 않았습니다[369]. 캡시드 안정성의 잠재적 차이는 조사되지 않았습니다. 벡터로 악용되는 또 다른 사람이 아닌 광고는 개 광고 유형 2(CAV-2)입니다. 이 벡터는 동일한 수용체를 사용함에도 불구하고 Ad5 제어 벡터와 달리 신경교 세포를 둘러싸지 않고 뉴런을 선택적으로 형질도입하는 놀라운 특성을 가지고 있습니다[370-372]. 이 능력은 증가된 캡시드 안정성과 연결되어 뉴런 세포에서만 코팅을 벗길 수 있습니다. 개는 사람보다 체온이 ~2ºC 더 높기 때문에 종 F 바이러스와 유사하게 잠재적으로 CAV-2 캡시드 안정성이 높아집니다[373]. CAV-2는 표적 세포에서 효율적인 분해가 부족한 것과 일치하는 선천적 면역 반응을 잘 이끌어 내지 못합니다[372]. 따라서 CAV2 벡터는 자연 친화성 또는 숙주와 연결된 생물물리학적 특성이 새로운 벡터 특성을 제공할 가능성이 있는 또 다른 예일 수 있습니다.
4.2. 캡시드 구조 미세 조정, 종 C Ad2/5에서 단백질 VI의 예
캡시드 안정성 및 단백질 VI 방출이 바이러스 캡시드의 다운스트림 운명을 결정하는 경우, 이것이 Ad 벡터에서 변형될 수 있는지, 즉 바이러스 벡터에 새로운 특성을 부여할 수 있는지에 대한 의문이 제기됩니다(그림 3). 광고가 endo-lysosomal 구획에 침투하는 방법에 대한 대부분의 이해는 종 C 바이러스 Ad2/5에서 비롯됩니다. 막 용해 인자로서 단백질 VI의 발견은 이 과정을 이해하는 데 필수적이었습니다[103,106]. 단백질 VI는 단백질의 실제 막 용해 부분인 N-말단 양친매성 나선을 암호화합니다. 바이러스 생산 중에 단백질 VI는 양친매성 나선을 통해 헥손 삼량체와 결합하는 전구체 단백질로 발현됩니다[42,374]. 복합체는 바이러스 조립 및 바이러스 프로테아제에 의한 성숙 동안 제거되는 단백질 VI의 N- 및 C-말단에 인코딩된 수송 신호를 통해 핵으로 유입됩니다. C-말단 11개 아미노산 펩티드는 또한 프로테아제를 활성화하여 양친매성 나선의 차폐와 바이러스 조립을 연결하는 스마트한 방법을 제공합니다. Ts1 Ad2/5 돌연변이 바이러스는 프로테아제에 대한 패키징 결함이 있으며 단백질 VI를 포함한 캡시드 단백질 중 어느 것도 처리되지 않습니다. 생성된 입자는 매우 안정적이고 섬유질을 유지하며 단백질 VI를 배치하지 않습니다.
결과적으로 Ts1 입자는 수용체 매개 엔도사이토시스에 따라 리소좀으로 분류됩니다. 성숙한 바이러스에서 단백질 VI의 정확한 위치는 명확하지 않지만 절단된 N-말단은 개인 주변 엑손의 내부 육각형 표면에 국한됩니다[37,104,375]. 단백질 VI, G33A 및 S28C의 두 점 돌연변이는 Ad5 캡시드 안정성을 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 3A)[376,377]. 첫 번째 돌연변이는 단백질 VI의 N-말단 프로테아제 절단 부위에 선행하며 처리를 손상시킵니다. 생성된 입자는 부분적으로 미성숙하고 엔도솜 용해 결함을 특징으로 하며, 이는 단백질 VI의 N-말단이 비리온 내 단백질-단백질 상호작용을 안정화함을 시사합니다[376]. 두 번째 돌연변이는 분자 내 이황화 가교를 형성하는 능력 때문에 선택되었습니다[377].
이 바이러스는 잠재적으로 단백질 VII를 포함하여 부분적으로 가공되지 않은 단백질을 포함하고 있었지만 놀랍게도 증가된 안정성에도 불구하고 어떠한 감염성 결함도 보이지 않았습니다. 바이러스 중 하나가 변경된 면역 활성화 프로필을 가지고 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 바이러스 운명에 영향을 미치는 단백질 VI의 또 다른 점 돌연변이는 양친매성 나선에 직접 위치한 단백질 VI L40Q 돌연변이입니다(그림 3A)[378,379]. 이 돌연변이가 있는 바이러스는 정상적으로 성숙하지만 엔도솜 용해 단계에 부분적으로 결함이 있습니다. 위에서 언급한 돌연변이와 달리 L40Q 비리온은 야생형보다 덜 안정적입니다. 지연 대신 단백질 VI와 펜톤이 L40Q 캡시드에서 조기에 방출됩니다. L40Q 비리온은 감염성이 적고 부분 리소좀 분류의 대상입니다. 그러나 L40Q 돌연변이는 막 용해를 완전히 제거하지 못하고 일부 바이러스는 세포질로 탈출하여 L40Q 벡터의 감염력을 전체적으로 ~4배 감소시킵니다[379,380]. 관찰은 양친매성 나선이 입자 안정성에 대한 상호 작용에 기여함을 시사합니다. L40Q 돌연변이가 Ad5 벡터의 면역원성 특성을 변경하는지 여부와 그 방법은 알려져 있지 않습니다. 최근 관찰에 따르면 캡시드에서 단백질 VI의 방출은 엑손에서 동일하거나 겹치는 결합 부위에 대한 단백질 VII와의 내부 경쟁에 의해 유발됩니다[375].
일관되게 단백질 VII가 없는 돌연변이 바이러스는 엔도솜에서 빠져나오지 못하고 엔도솜 용해에 결함이 있습니다[58]. 내부 캡시드(즉, 단백질 VI) 및 코어 단백질(즉, 단백질 V 및 VII)의 구조적 및 동적 구성에 대한 추가 이해는 입자 및 세포 진입 동안 캡시드 안정성(가역적)을 결정하는 요소를 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다.
Ad 벡터의 면역 활성화 효율을 제어하는 것은 백신 개발의 주요 관심사이며 항원의 MHC 제시를 확장하면 백신 개발이 향상될 것입니다[381]. 이전에 언급한 바와 같이 자가포식은 면역 활성화를 조절하고 펩티드를 MHC에 공급합니다. Autophagy는 감염에 대한 가장 오래된 세포 방어 메커니즘 중 하나이지만 적응된 인간 병원체인 Ads는 진입 시 autophagy를 피하는 메커니즘을 진화시키지 않았습니다. 대신, 그들은 autophagy 활성화를 수용하고 책임을 감염 촉진으로 전환하는 것처럼 보입니다. 단백질 VI는 세포의 자가포식 반응을 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. 단백질 VI에 의한 아데노바이러스 막 용해는 세포에서 위험 신호로 인식되는 갈렉틴 3 및 갈렉틴 8의 동원을 유도합니다(그림 3B)[108,109,382]. 갈렉틴에 의한 Ad 침투 부위의 검출은 자가포식 수용체(예: NDP52 및 p62) 및 LC3 반점 형성[108]의 동원에 의해 예시된 바와 같이 감염된 세포에서 선택적 자가포식을 활성화합니다.
흥미롭게도, Ad5 벡터 입자는 파열된 엔도솜에서 탈출하여 핵으로 이동할 수 있습니다. autophagy를 억제하는 것은 바이러스 감염성에 영향을 미치지 않지만 핵으로의 게놈 전달을 지연시켜 광고가 이익을 위해 세포 기계를 납치한다는 것을 보여줍니다[108]. 따라서 엔도솜에서 탈출하면 바이러스가 활성 과정을 통해 자가포식에 의한 분해를 피할 수 있습니다. 이 과정은 또 다른 단백질 VI 돌연변이인 M1 돌연변이에 의해 발견되었습니다. 모든 인간 광고(및 여러 비인간 광고)는 단백질 VI에서 고도로 보존된 PPxY 펩티드 모티프를 인코딩합니다. M1 돌연변이에서 이 모티프는 PGAA로 변경되었습니다(그림 3)[104]. 야생형과 M1 돌연변이체는 진입 시 효율적으로 단백질 VI를 방출하고 엔도솜 막이 파열된 후 자가포식을 유발합니다. 그러나 M1 돌연변이 바이러스는 세포질로 효율적으로 탈출할 수 없으며 EM 이미지는 M1 돌연변이 바이러스가 autophagy의 표적이 되는 파열된 엔도좀에 갇혀 있음을 보여주었습니다.
결과적으로, M1 돌연변이 바이러스는 자가포식의 약리학적 및 유전적 억제 시 회복되는 강력한 감염성 결함을 갖는 것으로 나타났다. 이 연구는 야생형 바이러스가 PPxY 모티프를 사용하여 ubiquitin ligase NEDD4.2를 모집하고 세포질로 탈출할 수 있을 만큼 충분히 오래 autophagosomes의 성숙을 제한한다는 것을 보여주었습니다. 게다가, 이 특성은 바이러스가 항원 제시를 제한할 수 있게 합니다[108]. 중요하게도, 마우스에 주입된 M1 돌연변이 벡터는 훨씬 더 강한 항-벡터 면역 및 인코딩된 이식유전자에 대한 감소된 CD8 플러스 반응을 초래하여 간단한 캡시드 변경이 Ad5 캡시드의 면역원성에 중대한 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 다른 단백질 VI 돌연변이가 면역원성에 영향을 미치는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 그러나 L40Q 바이러스에 있는 PPxY 모티프의 존재는 벡터가 막 용해 결함에도 불구하고 상대적으로 높은 감염성을 유지하는 이유를 설명할 수 있습니다[379,380]. 엔도좀 용해가 덜 효율적이고 L40Q 벡터가 리소좀 구획에서 부분적으로 끝나기 때문에 유도된 면역 반응이 아직 야생형, Ts1 또는 M1 Ad5 캡시드와 다르다는 것을 생각할 수 있습니다.
