선천 면역 반응이 다른 두 수수 2색 계통 사이의 유전자 발현 변이

추상적인:

미생물 관련 분자 패턴(MAMPs) 유발 면역(MTI)은 미생물 인식에 대한 식물의 타고난 면역 반응의 핵심 구성 요소입니다. 그러나 MTI에 대한 현재 지식의 대부분은 농작물을 사용하여 수행된 작업이 비교적 적은 모델 식물(즉, Arabidopsis thaliana)에서 나옵니다. 이 작업에서 우리는 두 가지 Sorghum bicolor 유전자형인 BTx623 및 SC155-14E에서 MAMP 트리거 산화 폭발(ROS) 및 전사 반응을 연구했습니다. SC155-14E는 탄저병 저항성이 높은 계통이고 BTx623 계통은 탄저병에 취약하다. 우리의 결과는 두 라인 사이의 flagellin (flg22) 또는 키틴 추출에 대한 반응으로 유전자 발현과 ROS의 명확한 변화를 보여주었습니다. 각 MAMP와 각 계통에 대한 전사 반응은 독특했지만 상당한 정도의 중복이 있었고 수수 MAMP 전사 반응과 관련된 핵심 유전자 세트를 정의할 수 있었습니다. GO 항 및 KEGG 경로 농축 분석은 동일한 처리를 한 BTx623에서보다 MAMP 처리 SC155-14E 샘플에서 더 많은 면역 및 병원체 저항성 관련 DEG를 발견했습니다. 결과는 질병 저항성을 강화하기 위한 노력을 포함하여 수수의 선천적 면역 경로를 조사하기 위한 향후 연구의 기준선을 제공합니다.

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키워드:

수수 이색; ROS; 선천성 면역; MAMP; RNA-seq; 유전자 발현

1. 소개

식물은 자연적으로 수많은 박테리아, 곰팡이 및 바이러스 병원체를 포함한 다양한 스트레스에 노출됩니다[1]. 식물은 미리 형성된 구조와 화학 물질, 면역 체계의 감염 유발 반응을 사용하여 병원균으로부터 자신을 보호합니다. 식물의 면역 체계는 서로 연결된 2개의 수용체 층이 있는 2층 인식 시스템을 사용합니다.

첫 번째 계층은 표면에 국한된 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 활성화되며, 이는 MAMP(Microbe-Associated Molecular Patterns)라고 하는 보존된 구조 모티프의 감지를 통해 침입하는 병원체를 인식하여 세포 외부의 분자를 감지합니다. 그러나 광범위하고 방어적인 대응[2]. Flagellin, chitin, lipopolysaccharides, peptidoglycans (PGNs) 및 elongation factor Tu는 잘 연구된 MAMP의 예입니다[3-5]. 이러한 방어 반응을 MTI(MAMPtrigged Immunity)라고 합니다[6]. ETI(Effector-Triggered Immunity)로 알려진 두 번째 방어 단계는 저항성 단백질의 작용을 통해 식물이 인식하는 특정 병원체 유래 이펙터 단백질에 대한 반응으로 발생하여 강력하지만 매우 특정한 면역 반응을 일으킵니다. ETI는 종종 과민 반응(HR)이라고 하는 국소화된 세포 사멸의 유도에 의해 인식될 수 있습니다[7]. MTI와 ETI 시스템 모두 병원균을 감지하고 감염된 세포와 이웃 세포에서 항균 방어를 활성화하여 대응합니다[3,8]. 식물은 또한 NBS-LRR 클래스의 단백질을 포함하여 매우 가변적인 병원체 효과자를 인식하는 면역 수용체를 가지고 있습니다[9].

또한 전신 획득 저항성(SAR)은 병원균에 대한 초기 국지적 노출 후에 발생하는 "전체 식물" 저항성 반응입니다. SAR은 광범위한 유전자(병인 관련 유전자)의 유도와 관련이 있으며, SAR의 활성화에는 내인성 살리실산(SA)의 축적이 필요합니다[10].

주로 Arabidopsis를 사용하여 수행된 연구에 따르면 MTI는 반응성 산소종 생성(ROS), 산화질소(NO)와 같은 반응성 질소종 생성, 캘로스 침착, 세포내 칼슘 수준, 혈장을 통한 이온 플럭스의 변화를 포함한 다양한 반응을 유발할 수 있습니다. 막, 여러 식물 방어 관련 유전자 발현의 유도 또는 억제, 식물 세포벽의 변경, 항균 화합물의 유도 및 병인 관련(PR) 단백질의 합성[3,11].

이러한 MTI 반응 중 일부는 일반적인 식물 반응으로 간주될 수 있지만, 그 크기는 식물 종에 따라 다르고 품종에 따라 다를 수 있습니다[12–17]. 식물 MTI 반응을 정량화하는 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법에는 ROS 또는 NO 생산, 미토겐 활성화 단백질 키나아제 인산화, 특정 MAMP 유도 유전자 발현, 묘목 성장 억제, 리그닌 및 세포벽 결합 페놀, 박테리아 및 진균 병원체에 대한 MAMP 유도 저항성 측정이 포함됩니다[18-20].

Sorghum bicolor (L.) Moench는 다양한 서식지에 적응하고 다양한 목적을 위해 사육된 핵심 글로벌 곡물입니다[21]. 수수 재배는 식품 및 바이오매스 생산을 위한 주요 작물 중 하나로 전 세계적으로 상당히 증가할 것으로 예상됩니다[22].

수수 재배 관행과 지리적 면적이 증가함에 따라 질병 압력이 증가하는 것은 불가피합니다. 수수는 비정상적으로 광범위한 질병에 의해 다른 곡물과 구별되며, 이는 생산에 가장 중요한 제약 중 하나입니다. 전 세계적으로 널리 퍼진 진균병은 가장 파괴적인 수수의 질병으로 곡물의 양과 질 모두에서 수확량에 막대한 손실을 초래합니다[23]. 탄저병은 수수 곡물 수확량과 바이오매스 생산에 영향을 미치는 가장 심각한 곰팡이 질병 중 하나입니다. 이 병원균으로 인한 수확량 손실은 감수성 품종에서 50~70%가 될 수 있습니다[24,25]. 식물은 병원체 침입에 맞서 싸우기 위해 다양한 방어 전략을 개발했습니다. 수수에서 이러한 전략에는 PR 단백질의 활성화[26], 과산화수소의 축적[27], 플라보노이드 피토알렉신의 생합성[28]이 포함됩니다. 수수의 저항성 반응을 연구하고, 방어 화합물을 식별하고, 탄저병에 대한 물리적 장벽을 식별하기 위해 다양한 접근 방식이 사용되었습니다(검토를 위해 참조 [29,30] 참조). 유전자 발현 연구는 저항성과 감수성 품종 또는 비접종 식물과 병원체 접종 식물 사이의 차등 발현을 기반으로 식물에서 후보 저항성 유전자를 식별하는 데 널리 사용되었습니다(예: 참고문헌 [31-37]). Wang 등[37]은 C. subline-ola에 대한 수수 품종 BTx623의 반응을 연구하기 위해 transcriptomic 분석을 수행했습니다. 그들은 페닐프로파노이드 대사에 관여하는 유전자와 2차 대사산물의 생합성이 비접종 대조 식물에 비해 병원체 감염에 대한 반응에서 차등적으로 발현되는 것으로 확인되었다고 보고했습니다.

그러나 이러한 실험은 감수성 품종 BTx623의 묘목으로 수행되었습니다. 감수성 및 저항성 수수 품종에서 병원체에 대한 유전자 발현 반응을 비교하기 위한 추가 전사체 연구는 가치가 있을 것이다. 따라서 수수 기초병 저항성을 조절하는 유전적 구조와 정량적 병 저항성과의 연관성을 이해하는 것이 중요하다.

이 방향의 초기 단계로 우리는 최근 flg22 및 키틴 유발에 대한 반응의 변화와 곰팡이 질병 저항성에 대해 다양한 수수 생식질 세트를 스크리닝했습니다[38]. 이 경우 MAMP 유도 시 ROS 생산을 측정하여 MTI를 정량화했습니다. 이 초기 연구의 결과 중에는 MAMP 유도에 대해 강하거나 약한 반응을 보이는 수수의 유전자형이 확인되었습니다.

차세대 고처리량 시퀀싱 및 전사체 연구는 식물의 곰팡이 감염 반응을 명확히 하고 숙주 반응에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다. Transcriptome 분석은 곡물을 포함한 많은 식물 종에서 진균 감염에 대한 식물 반응을 연구하는 데 널리 사용되었습니다(예: 참고문헌 [31-37]).

그러나 곡물의 비교 transcriptome 분석에 대한 발표된 데이터는 주로 다양한 병원균에 대한 반응에 초점을 맞췄습니다. 수수에서 몇몇 간행물은 탄저병을 포함하여 다양한 병원균으로 처리된 식물의 전사체 비교에 중점을 두었습니다[35,37]. 일부 이전 간행물에서는 MAMP에 대한 반응과 진균병 사이에 유의미한 상관관계가 없다고 제안했습니다. 예를 들어, Zhang et al. [17]은 두 개의 MAMP flg22에 대한 반응과 옥수수 매핑 모집단의 키틴 사이에 강한 상관관계가 있다고 보고했지만 진균병에 대한 반응과는 일치하지 않았습니다. Kimballet al. [38]은 또한 BTx623/SC155-14E 모집단을 포함한 두 개의 수수 RIL 모집단에서 flg22-유도 ROS 반응 점수와 표적 잎 반점 저항성 점수 사이의 낮은 상관관계를 보고했습니다. 따라서 데이터가 부족한 상황에서 MAMP 처리에 대한 수수 반응을 전사적으로 프로파일링하는 것이 중요하다고 느꼈습니다.

이 현재 보고서에서 우리는 MAMP 유도에 대한 글로벌 전사 반응을 측정하여 이전 분석을 확장합니다. 우리는 수수 유전자형 BTx623 및 SC155-14E에서 flg22 또는 키틴 처리에 대한 응답으로 전사 변화를 조사하기 위해 Illumina 기반 RNA 시퀀싱 분석을 사용했으며, 이전에는 각각 약하고 강한 MTI 응답자로 특성화했습니다. BTx623은 Sorghum bicolor genome reference line[22]이고 SC155-14E는 상승된 탄저병 저항성을 보여주는 라인입니다[39]. Patil et al. [39] SC155-14E는 테스트한 모든 환경에서 탄저병에 대해 높은 수준의 안정적인 저항성(거의 질병이 없음)을 보인 반면 BTx623은 이 곰팡이 질병에 취약하다고 보고했습니다. 우리의 RNA-seq 분석은 flg22 및 키틴으로 처리된 BTx623에서 각각 5252 및 8085개의 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 식별했고, flg22 및 키틴으로 처리된 SC155-14E에서 각각 3849 및 5786 DEG를 미처리 모의 대조군과 비교하여 식별했습니다. 이 두 유전자형 중.

또한 두 개의 다른 생물정보 파이프라인을 사용하여 선택한 DEG를 비교한 결과 매우 유사한 결과가 나타났습니다. 차별적으로 발현된 유전자의 발현 프로필, 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석 및 KEGG 경로 농축 분석은 MTI 관련 유전자 발현에서 명확한 유전자형 기반 변이를 보여주었습니다. GO 항과 KEGG 경로 강화 결과는 MAMP 처리된 SC{{4} } MAMP 처리된 BTx623에 대한 E 샘플. 결과는 수수 MTI 반응의 다양한 구성 요소를 식별하기 위한 기준선을 제공합니다.

2. 결과 및 논의

2.1. 다른 수수 잎에서 산화 버스트의 변이

다양한 수수 유전자형의 MTI 반응에 대한 우리의 이전 분석은 유전자형 BTx623과 SC155-14E[38] 사이의 MAMP 유발 산화 버스트에서 상당한 변이를 드러냈습니다. 또한, SC155-14E 계통은 탄저병 저항성이 높고, BTx623 계통은 탄저병에 취약하다[39]. 이러한 이유로 RNA-seq를 사용하여 비교하기 위해 이 두 가지 유전자형을 선택했습니다.

초기 ROS 측정을 수행하는 동안 동일한 플랜트 내에서도 상당한 변동이 발견되어 이 변동의 원인을 보다 면밀히 조사하게 되었습니다. 구체적으로, 우리는 15일 된 BTx623 및 SC155-14E 식물의 아래쪽에서 위쪽으로 가는 세 세트의 잎을 사용하여 ROS 생산을 테스트했습니다. 잎은 그림 1A와 같이 아래에서 위로 #1, #2 및 #3으로 표시되었습니다. ROS 분석 결과(그림 1B)는 다음과 같이 밝혀졌습니다. (1) ROS 생산 수준은 오래된 잎(잎 #1)에서 더 낮았고, flg22 또는 키틴에 대한 반응으로 가장 높은 수준의 ROS 생산은 가장 어린 잎에서 나왔습니다( 잎 #3). (2) MAMP 처리 및 처리되지 않은 BTx623 2nd 가장 어린 잎(잎 #2)은 비교적 낮은 수준의 ROS 생산을 생성했습니다.

대조적으로, SC155-14E의 MAMP 처리된 두 번째 막내 잎은 처리되지 않은 모의 것뿐만 아니라 처리된 BTx{ {5}}번째 막내 잎. (3) 두 유전자형의 가장 어린 잎(잎 #3)의 잎 디스크에서 flg22 또는 키틴의 적용에 의해 유발된 산화 폭발이 검출되었지만 이전에 관찰된 바와 같이 ROS 생산 수준은 MAMP 처리된 SC에서 더 높았습니다. 155-14E는 BTx623에 상대적입니다. SC155-14E 두 번째 막내 잎에서 flg22-촉발 및 키틴 유발 ROS 생산의 시간 경과에 따르면 키틴 유발 ROS 생산은 flg22- 유발 ROS 생산보다 일찍 발생했습니다(그림 1C ). 비슷한 결과가 Zhang et al. [17] flg22 및 키틴 처리된 옥수수 모종에서 키틴 유발 ROS 생산이 flg22- 트리거 ROS 생산보다 일찍 나타났습니다. flg22에 반응하여 ROS 생성이 12분경에 가장 높았고 애기장대에서 30분에 가장 낮은 것으로 보고되었다[40]. 수수에서의 ROS 분석 결과는 flg22 처리 후 13분경에 ROS 생성이 가장 높았고, flg22 처리 후 30분에 가장 낮았으며 이는 Arabidopsis의 결과와 매우 유사합니다. 우리의 목표는 두 유전자형의 MTI 반응을 비교하기 위한 최적의 조건을 찾는 것이었기 때문에 RNA 추출 및 후속 transcriptomic 분석을 위해 15-일 된 식물의 두 번째로 어린 잎을 선택했습니다. 단일 수수 식물의 잎 사이의 변화는 주어진 실험의 소스, 타이밍 및 기타 기능에 따라 실험 간에 결과가 달라질 수 있으므로 실험 매개변수를 신중하게 제어해야 함을 상기시켜줍니다.

반응성 산소 종(ROS)의 신속하고 일시적인 생산인 산화 폭발은 식물의 방어 반응에서 가장 초기에 관찰 가능한 측면 중 하나입니다[41]. ROS 버스트가 즉각적인 반응이라는 점을 고려할 때 MTI 관련 유전자의 전사 반응은 약간 늦을 것으로 예상됩니다. RNA-Seq 분석을 위해 MAMP 처리 60분 후 샘플을 수확했습니다.

2.2. MAMP 처리에 대한 반응으로 BTx623 및 SC155-14E의 차별적으로 발현된 유전자(DEG)

각 샘플에 대해 주석이 달린 수수 2색 단백질 코딩 유전자의 발현 수준을 평가하기 위해 각 유전자에 매핑된 RNA-seq의 클린 리드 수를 계산한 다음 FPKM(백만 매핑된 조각당 kb 엑손 모델당 조각)으로 정규화했습니다. BTx623 및 SC155-14E의 MAMP 처리 잎원반에서 모의(물) 처리와 비교하여 각 유전자의 발현 변화를 조사하였다. 총 발현 유전자는 두 유전자형의 모든 처리에서 유사했습니다: BTx623 모의, flg22- 처리 BTx623, 키틴 처리 BTx623, SC{ {22}}E, flg22-처리된 SC155-14E 및 키틴 처리된 SC155-14E. SC155-14E에 대한 특정 참조를 사용할 수 없기 때문에 두 줄의 읽기 매핑에 BTx623 참조 게놈을 사용했습니다. 위의 모든 조건으로 BTx623 및 SC{{30}}E에서 검색된 발현된 유전자 번호는 두 계통이 유사한 수의 발현된 유전자를 공유한다는 것을 보여주었습니다. SC155- 14E 모의(3회 반복), flg22로 처리된 SC155-14E(3회 반복), 키틴으로 처리된 SC155-14E(3회 반복) 샘플의 전체 읽기 매핑 비율 , BTx623 모의(3회 반복), flg22로 처리된 BTx623(3회 반복), 키틴으로 처리된 BTx623(3회 반복)은 93.6%, 93.9%, 93.9%, 93.8%, 93.9%, 93.6%, 93.5%, 93.5% , 93.1퍼센트 , 96.9퍼센트 , 97.0퍼센트 , 97.0퍼센트 , 97.2퍼센트 , 96.8퍼센트 , 97.0퍼센트 , 96.9퍼센트 , 97.{80}} 퍼센트 , 97.0 퍼센트 각각. 이러한 결과는 BTx623 및 SC155-14E의 전사체에 대한 MAMP 처리의 다른 효과가 두 유전자형 간의 게놈 서열 차이로 인한 것이 아님을 시사합니다.

유전자 발현 PCA 플롯은 샘플 간의 연관성에 대한 통찰력을 제공합니다. 샘플의 유사성을 알아보기 위해 PCA 분석을 수행했습니다. PC1 및 PC2에 대한 샘플 플로팅(그림 2)은 4개의 실험 조건(BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_키틴 및 SC{ {10}}E_키틴)은 광범위하게 분리되었습니다. 대조적으로, 각 수수 라인과 각 MAMP 처리 및 모의 처리의 세 가지 생물학적 복제물은 각각 밀접하게 모여 있어 생물학적 복제물 간의 우수한 재현성을 나타냅니다(그림 2).

그림 3의 Volcano 플롯은 flg22 또는 키틴으로 처리된 두 수수 계통의 유전자 발현을 보여줍니다. 화산 플롯은 통계적 유의성(p-값) 대 변화의 크기(배기 변화)를 보여주는 일종의 산점도입니다. 또한 통계적으로 유의미한 대규모 변화가 있는 유전자를 시각적으로 빠르게 식별할 수 있습니다. 이들은 생물학적으로 가장 중요한 유전자일 수 있습니다. 그림 3에서 −log10(p-값)이 3 이상인 유전자는 DEG로 간주됩니다. 빨간색 점은 DEG를 나타내고 검정색 점은 비 DEG를 나타냅니다. 각 플롯에서 log2(배_변화)가 0보다 큰 유전자는 상향 조절된 유전자이고 그렇지 않으면 하향 조절된 유전자입니다. 가장 많이 상향 조절된 유전자는 오른쪽에 있고, 가장 많이 하향 조절된 유전자는 왼쪽에 있으며, 통계적으로 가장 유의미한 유전자는 위쪽에 있습니다.

차별적으로 발현된 유전자(DEG)는 발현의 중요성에 따라 각 처리에서 선택되었습니다(p-값 0.001). 이 보고서에서 DEG를 선택하기 위해 임계값으로 0.001의 p-값을 사용했지만 FDR(q-값)은 사용하지 않았다는 점에 유의해야 합니다. FDR(q-값)도 이 수준에서 중요했습니다(표 S2–S5). p-값 0.001에서 FDR은 BTx623 with flg22 처리, SC155-14E flg22 처리, BTx623 키틴 처리 및 SC{{{{{{ 26}}각각 키틴 처리된 E. 모든 조건에서 BTx623 및 SC155-14E 유전자의 p-값 및 q-값은 표 S2–S5에 나열되어 있습니다. BTx623 및 SC155-14E의 MAMP 처리된 잎에서 이들 유전자의 발현 패턴을 분석함으로써, 우리는 flg22 또는 키틴 이후에 큰 차이를 나타내는 다수의 유전자(전체 발현 유전자의 14-30%)를 관찰했습니다. 두 수수 라인 모두에서 처리. 키틴 처리된 BTx623(8085)의 총 DEG 수는 탄저병 병원체 C. subline-ola(8078)에 감염된 BTx623의 이전 transcriptome 연구에서 보고된 것과 매우 유사했습니다[37]. DEG의 수는 SC155-14E(각각 14% 및 21%)에 비해 flg22(19%) 또는 키틴(30%) 처리된 BTx623 잎에서 더 높았습니다.

SC155-14E에 비해 MAMP 처리된 BTx623에서 더 많은 DEG가 이 두 유전자형의 ROS 반응과 반대였지만 MAMP 처리에 대한 ROS 반응 및 유전자 발현 반응이 다른 시간, 대체로 독립적이며 다른 메커니즘에 의해 조정됩니다[42,43]. GO 항 및 KEGG 경로 강화는 MAMP 처리된 SC155-14E 샘플에서 제시된 더 많은 면역 및 병원체 저항성 관련 DEG를 나타냈습니다. 더욱이, flg22로 처리된 샘플에 비해 키틴으로 처리된 샘플에서 DEG의 수가 더 높았다는 사실은 ROS 반응 분석(그림 1B)과 잘 일치하여 키틴 처리 시 더 강한 ROS 반응을 보였습니다.

BTx623과 SC155-14E에서 flg22와 키틴 처리 간에 유전자와 생물학적 과정이 어느 정도 공유되는지 조사하기 위해 DEG를 더 자세히 비교했습니다. 그림 4A의 벤 다이어그램은 0.001의 p-값에서 상향 및 하향 조절된 유전자 세트 전체에서 DEG의 중첩을 보여줍니다. 총 10,535개의 DEG 중에서 2272개의 핵심 유전자 세트가 두 수수 라인 모두에서 flg22 및 키틴 처리에 모두 반응했습니다. 마찬가지로 총 5410개의 상향 조절된 유전자에서 1778개의 핵심 유전자 세트가 두 유전자형 모두에서 상향 조절된 반면, 총 5125개의 하향 조절된 유전자 중 474개의 핵심 세트는 두 유전자형 모두에서 하향 조절되었습니다. 유전자형.

여기에 제시된 RNA seq 데이터는 Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 및 Cufflinks 2.2.1(Cuffmerge, Cuffdiff) 도구와 기본 매개변수(파이프라인 #1)가 있는 생물정보학 파이프라인을 사용하여 분석되었습니다. 분석 결과를 추가로 확인하기 위해 HiSat2, HTSeq 및 edgeR과 함께 다른 파이프라인(파이프라인 #2)을 사용하여 분석을 수행했습니다. HiSat2는 TopHat2의 차세대 개발품입니다. 두 파이프라인을 사용하여 선택한 각 조건(즉, flg22 또는 키틴으로 처리된 두 가지 유전자형, 모두 상향 또는 하향 조절된 DEG)의 DEG를 비교했습니다. 결과(그림 5)는 두 파이프라인을 사용하여 선택한 DEG 번호가 매우 근접한 것으로 나타났습니다.

파이프라인 #1 대 파이프라인 #2로 선택된 총 DEG는 BTx623_flg22: 5241 대 5413이었습니다. SC155-14E_flg22: 3849 대 3476; BTx623_키틴: 8085 대 8320; SC155-14E_키틴: 5786 대 5383. 파이프라인 #1 대 파이프라인 #2에서 선택된 상향 조정된 DEG는 BTx623_flg22: 3074 대 3076이었습니다. SC155-14E_flg22: 2591 대 2483; BTx623_키틴: 4156 대 4583; SC155-14E_키틴: 3486 대 3346. 파이프라인 #1 대 파이프라인 #2에서 선택된 하향 조절된 DEG는 BTx623_flg22: 2152 대 2237이었습니다. SC155-14E_flg22: 1257 대 993; BTx623_키틴: 3919 대 3757; SC155-14E_키틴: 2296 vs. 2037. 또한 그림 5의 결과는 두 파이프라인을 사용하여 선택된 DEG의 높은 비율이 모든 조건에서 중첩됨을 보여주었습니다. 파이프라인#1을 사용하여 선택한 중복 DEG 번호/DEG 번호의 비율은 79.6% 및 73.7%였습니다. BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_키틴 및 SC155-14E{{73}의 총 DEG의 80.8% 및 74.4% }각각 키틴; 83%, 80.6%, 85.3% 및 81.1%의 BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_키틴 및 SC{{ 88}}E_키틴, 각각; BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_키틴 및 SC{{{ 105}}E_키틴. 따라서 이러한 비교 결과는 두 가지 분석 방법 중 어떤 방법을 사용하든 제시된 RNA seq 데이터가 정확함을 입증했습니다.

3개의 생물학적 복제에 대해 flg22 또는 키틴으로 처리된 BTx623 및 SC155-14E의 DEG의 클러스터된 발현 프로필의 히트맵이 그림 6에 나와 있습니다. 유전자 발현 값은 z-점수로 정규화되었습니다. 값이 증가함에 따라 색상이 보라색에서 빨간색으로 변하며 유전자 발현이 낮음에서 높음을 나타냅니다. 이 히트맵은 flg22 또는 키틴 처리에 대한 반응으로 BTx623 및 SC155-14E 유전자의 차등 조절을 명확하게 보여줍니다. 또한 결과는 각 조건에서 3개의 생물학적 복제물의 히트맵이 매우 근접하여 생물학적 복제물 간의 우수한 재현성을 나타냅니다.

또한, flg22와 키틴 처리의 상향 및 하향 조절된 DEG 사이의 쌍별 비교(그림 7A)는 BTx623과 SC155-14E 사이에 큰 중첩이 있음을 보여주었습니다. BTx623에서 3074개의 flg22- 유도 유전자 중 83.8%가 키틴 처리에 대한 반응으로 BTx623에서도 유도된 반면, 2591개의 flg22-유도 유전자 중 SC155-14E, {{ 16}}.6%도 키틴 처리된 SC155-14E에 반응했습니다. Arabidopsis thaliana의 이전 연구에서 일반적인 MTI 경로를 정의하는 다양한 MAMP에 반응하는 유전자에서 상당한 중첩이 나타났기 때문에 이것은 아마도 놀라운 일이 아닙니다[44-46].

또한 Zhang et al. [17]은 또한 옥수수에서 flg22와 키틴 반응 사이에 상당한 상관관계가 있다고 보고했습니다. 동일한 MAMP로 처리된 BTx623과 SC155-14E 리프 디스크 간에 더 적은 중첩이 관찰되었습니다(그림 7A). BTx623에서 flg22- 유도 유전자의 64.3%가 flg22- 처리된 SC155-14E에서 유도되었고 BTx623에서 68.3%의 키틴 유도 유전자가 키틴 처리된 SC155-14에서 유도되었습니다. 이자형. 마찬가지로, BTx623의 flg22 처리 시 하향 조절된 2152개 유전자 중 높은 비율(75.9%)이 BTx623의 키틴에 의해 하향 조절되었습니다. SC155-14E에서 flg22에 의해 하향 조절된 1257개 유전자 중 70.8%는 SC155-14E에서 키틴에 의해 하향 조절되었습니다. 그러나 BTx623에서 flg22 하향 조절된 유전자의 29%만이 flg22- 처리된 SC155-14E에서도 하향 조절되었고 BTx623에서 키틴 하향 조절된 유전자의 45%가 하향 조절되었습니다. 키틴 처리된 SC155-14E에서(그림 7A). 따라서 비교된 두 유전자형의 flg22 및 키틴에 대한 MTI 경로에서 상당한 수렴이 있었지만 데이터는 이 두 유전자형이 서로 다른 MAMP에 어떻게 반응하는지에 대한 흥미로운 복잡성을 암시합니다.

2.3. BTx623과 SC155-14E의 MTI 반응을 비교한 유전자 기능 강화 분석

flg22 또는 키틴에 대한 반응으로 조절되는 유전자의 기능적 범주와 테스트된 두 수수의 차등 반응을 결정하기 위해 우리는 PlantRegMap [47,48] 플랫폼을 사용하여 생물학에서 검출된 DEG를 기반으로 한 유전자 세트 강화 분석을 수행했습니다 프로세스 범주. 그림 8A 및 B는 BTx623 및 SC155-14E 모두에서 상향 조절된 DEG 및 하향 조절된 DEG가 있는 생물학적 과정이 풍부한 유전자의 상위 GO 항을 보여줍니다. DEG의 전체 목록은 표 S6–S13에 제공됩니다. 이러한 유전자 중 다수는 스트레스 반응, 식물 방어 반응, 자극에 대한 반응, 생물학적 자극에 대한 반응, 박테리아에 대한 반응, 다른 유기체에 대한 반응, 세포 통신, 인 대사 과정 및 단백질 인산화를 포함한 과정과 관련이 있습니다.

그림 8A 및 B의 결과는 두 가지 수수의 유전자형 사이에서 일반적으로 선천성 면역과 관련된 유전자 발현의 명확한 차이를 보여줍니다. 풍부한 GO 용어에서 일부 고유한 DEG는 중첩되는 각 조건에서 발견되었습니다. 예를 들어, GO 용어 방어 반응(GO 0006952): 91 및 84 상향 조절된 DEG는 각각 flg22로 처리된 BTx623 또는 SC155-14E에서 강화되었습니다. 이러한 DEG 내에서 24DEG는 BTx623에서 고유했고 15DEG는 SC155-14E에서만 발견되었으며 나머지는 두 수수 유전자형 모두에 표시되었습니다. 유사하게, 102개 및 93개의 상향 조절된 DEG는 각각 키틴으로 처리된 BTx623 또는 SC155-14E에서 강화되었습니다. 이러한 DEG 내에서 20DEG는 BTx623에서 고유했고 14DEG는 SC155-14E에서 고유했으며 나머지는 두 수수 유전자형 모두에 표시되었습니다.

"키틴에 대한 반응(GO: 0010200)"의 GO 용어에서 키틴으로 처리된 SC155-14E 샘플에서 풍부한 이 범주의 총 ​​779개 유전자 중 18개의 상향 조절된 DEG를 관찰했습니다(그림 8 ), 키틴 처리된 BTx623 샘플에서는 유전자가 풍부하지 않았다. 또한, 16개의 상향 조절된 DEG는 flg22- 처리된 SC155-14E 샘플에서 강화되었고, 12개의 상향 조절된 DEG는 flg22- 처리된 BTx623 샘플에서 강화되었습니다(그림 8). flg22 및 키틴 처리된 BTX623 및 SC155-14E(표 S9)에서 GO 용어 "키틴에 대한 반응"의 DEG 목록을 비교하면 DEG가 flg22 또는 키틴 처리된 SC155- 14 E는 키틴이 flg22보다 2개 더 많은 DEG를 유도한 것을 제외하고는 동일했습니다. 대조적으로, flg22-처리된 BTX623에서 강화된 모든 12 DEG는 SC155-14E에서 MAMP에 의해 유도된 DEG와 다릅니다. 이러한 MAMP로 유도된 DEG는 SC155-14E에서 탄저병의 저항 반응에 기여할 수 있습니다. 키틴은 식물 면역 반응을 유도하는 곰팡이 세포벽의 전형적인 MAMP 분자이기 때문입니다. Stringliset al. [49]는 키틴, flg22 및 식물에 유익한 뿌리박테리아 Pseudomonas simiae WCS417 처리된 애기장대 식물로부터 "키틴에 대한 반응"이라는 GO 용어에서 상향 조절된 DEG 세트가 풍부하다고 보고했습니다. Matet al. [33]은 저항성 품종의 벼 잎 RNA-seq 분석에서 "키틴에 대한 반응"이라는 GO 용어에서 21 DEG가 농축되었지만 곰팡이 병원체 Fusarium fujikuroi 감염 후 감수성 품종에서는 그렇지 않다고 보고했습니다.

PR(Pathogenesis-related) 유전자는 식물 면역 반응에 관여하며[50] 많은 식물병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는다[51]. PR-10 단백질은 수수를 포함한 식물 종의 방어 반응과 관련된 항진균 특성을 가진 작고 주로 산성인 세포내 단백질입니다[52]. PR-10 유전자 가족 구성원은 다양한 식물 종에서 병원체 공격에 의해 유도되었습니다[53]. 수수에서 Lo et al. [26]은 PR-10 발현이 잎 진균 병원체인 C. heterostrophus 및 C. sublineolum에 대한 수수의 활성 숙주 방어의 일부로 유도되었다고 보고했습니다. Katieet al. [54]는 현장 테스트에서 C. lunata와 F. capsicum의 진균 포자를 접종한 후 몇 가지 수수 품종이 PR-10의 표준화된 상대적 양의 상당한 유도를 보였다고 보고했습니다. 온실 조건에서, 접종된 식물의 포영은 PR-10 mRNA의 유도를 보였고, 반응은 2개의 감수성 품종에 비해 테스트된 2개의 저항성 품종에서 더 컸다.

그 결과 식별된 DEG 중에서 4개의 PR-10 유전자(SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001)가 발견되었습니다. G401000). SC155-14E에서 4개의 PR-10 DEG는 모두 flg22 또는 키틴 처리에 의해 상향 조절되었습니다. 반면에 BTx623에서는 SORBI_3001G401000이 DEG에서 발견되지 않았고 SORBI{{15} }G401300(상향 조절됨)은 키틴 처리된 BTx623에서만 나타났지만 flg22 처리에서는 나타나지 않았습니다. 이것은 PR 유전자의 발현이 SC155-14E에서 MAMP 처리 및 탄저병에 대한 저항성 후 더 높은 ROS 생성물 수준에 반응하여 사용될 수 있음을 나타냅니다.

살리실산(SA)은 국소 방어 반응과 전신 획득 저항 모두에 필수적인 식물 면역 신호입니다. 그것은 병원균의 공격에 대한 저항성과 식물 방어에 중요한 역할을 합니다[55]. 수수에서 Tugizimana et al. [56] C. subline-ola에 감염된 수수에서 jasmonic acid, salicylic acid conjugates 및 abscisic-acid 수준의 정량적 변화를 보고했습니다. C. subline-ola는 탄저병의 원인균입니다. 강화된 수준의 아미노산(트립토판 및 티로신), 자스몬산 및 살리실산 결합체, 제아틴을 함유한 수수 유전자형은 탄저병에 대한 내성이 더 컸습니다. 이 연구에서 19개의 상향 조절된 DEG를 포함하는 GO 용어 '살리실산에 대한 반응'(GO:0009751)은 특히 키틴으로 처리된 SC155-14E에서만 강화되었습니다(표 S9). 따라서 살리실산 신호 전달 경로는 MAMP 처리 후 더 높은 ROS 생산 수준과 SC155-14E에서 탄저병에 대한 저항성에 반응하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다.

또한 169개의 상향 조절된 DEG는 키틴으로 처리된 SC155-14E에서만 스트레스에 대한 GO 용어 반응이 강화되었습니다(표 S9). MAMP로 처리된 SC155-14E에서만 발견되고 동일한 처리로 BTx623에서는 발견되지 않는 다른 GO 용어는 2차 대사 과정(GO:0019748), 포스파티딜콜린 생합성 과정(GO:0006656) 및 지질 생합성 과정( GO:0008610).

또한 169개의 상향 조절된 DEG는 키틴으로 처리된 SC155-14E에서만 스트레스에 대한 GO 용어 반응이 강화되었습니다(표 S9). MAMP로 처리된 SC155-14E에서만 발견되고 동일한 처리로 BTx623에서는 발견되지 않는 다른 GO 용어는 2차 대사 과정(GO:0019748), 포스파티딜콜린 생합성 과정(GO:0006656) 및 지질 생합성 과정( GO:0008610).

우리는 또한 flg22 또는 키틴 처리 후 두 유전자형과 모든 처리에서 DEG의 핵심 세트와 GO 농축 분석에 의한 두 유전자형 사이에서 공동 조절되는 유전자의 구성을 조사했습니다(그림 4B 및 7B). DEG의 전체 목록은 표 S14 및 S15에 제공됩니다. 그림 4B는 모든 처리를 포함하는 BTx623 및 SC155-14E의 총 상향 및 하향 조절 DEG의 핵심 집합에 대한 강화된 GO 항을 보여줍니다. MAMP 반응 및 식물 방어와 관련된 GO 용어(예: 키틴 결합, 방어 반응, 단백질 키나아제 활성, 단백질 인산화, 단백질 세린/트레오닌 키나아제 활성)는 상향 조절된 DEG에서 상당히 풍부했으며, GO 용어는 2차 대사산물 생합성 과정, 철 이온 결합, 옥시도리덕타제 활성은 하향 조절된 DEG에서만 강화되었습니다. 이 결과는 유도자(P. simile WCS417 및 P. aeruginosa PAO1의 flg22 펩티드, 키틴 및 P. simile WCS417의 박테리아 세포)에 대한 반응과 관련된 GO 용어가 상향 조절된 DEG의 핵심 세트 [49].

그림 7B는 flg22 또는 키틴 처리 후 BTx623과 SC155-14E 사이에서 DEG의 공동 조절(즉, 두 유전자형 모두에서 상향 또는 하향 조절) 세트의 상당히 강화된 GO 항을 보여줍니다. 결과는 MAMP 반응 및 식물 방어(예: 방어 반응, 단백질 키나아제 활성, 단백질 인산화, 단백질 세린/트레오닌 키나아제 활성)와 관련된 GO 용어가 두 유전자형 모두에서 flg22 또는 키틴 상향 조절된 DEG에서만 풍부하다는 것을 밝혔고, GO 용어는 2차 대사산물 생합성 과정, 헴 결합, 철 이온 결합, 산소 한 원자의 산화환원효소 활성 및 포스파티딜콜린 생합성 과정은 하향 조절된 DEG 세트에서만 강화되었습니다.

2.4. BTx623 및 SC155-14E의 MTI 응답에 대한 KEGG Pathway Enrichment 분석

그림 9는 DAVID 온라인 도구를 사용하여 MAMP 처리된 BTx623 및 SC155-14E 샘플에서 발견된 상향 조절된 DEG의 KEGG 경로 농축 분석을 보여줍니다[57]. DEG의 전체 목록은 표 S16–S20에 나와 있습니다. 결과는 두 가지 수수 유전자형에서 MTI 활성화의 결과로 농축된 특정 상위 KEGG 경로를 식별합니다. KEGG 경로 "식물-병원체 상호작용"에서 우리는 키틴 처리된 SC155-14E 샘플에서 24개의 상향 조절된 DEG가 강화된 반면 키틴 처리된 BTx623 샘플에서는 DEG가 강화되지 않았음을 관찰했습니다. 유전자형 SC155-14E의 더 강한 키틴질 반응은 이 유전자형이 진균병인 탄저병에 대한 더 큰 저항성과 관련이 있습니다[39]. 또한, KEGG 경로 농축은 flg22로 처리된 SC155-14E에서 용어 페닐프로파노이드 생합성과 관련된 28개의 유전자를 밝혀냈습니다. 페닐프로파노이드 생합성 경로는 플라보노이드, 벤제노이드, 쿠마린, 하이드록시신나메이트 및 리그닌과 같은 방향족 화합물로 전환될 수 있는 페닐알라닌으로 시작됩니다[58,59]. 많은 페닐프로파노이드와 플라보노이드가 질병 저항성 반응에 관여했습니다[28,60]. phytoalexins의 생산은 수수의 탄저병 병원체 C. subline-ola[28]에 대한 주요 방어 반응입니다. 3- 데옥시 안토시아니딘은 수수에서 파이토알렉신으로 인식되는 특이한 플라보노이드 그룹입니다. 파이토알렉신은 병원체 감염 후 생성되는 항균 활성을 가진 작은 분자입니다[61]. Wang et al. [37] 또한 수수의 transcriptomics 연구에서 KEGG 용어 페닐프로파노이드 생합성이 C. subline-ola 감염 식물의 DEG에서 상당히 풍부하다는 것을 발견했습니다. KEGG 경로 농축 결과(그림 9)는 또한 식물-병원체 상호작용에서 역할을 할 수 있는 일부 경로(예: 경로 페닐알라닌 및 트립토판 생합성, 항생제 생합성)에서 MAMP 처리 후 BTx623의 더 높은 반응을 보여주었다는 점에 주목해야 합니다.

또한, 하향 조절된 DEG의 KEGG 경로 농축 분석 결과 10개의 하향 조절된 DEG는 '광합성-안테나 단백질'로 주석이 달렸고 84개의 DEG는 '2차 대사 산물의 생합성'에 참여하는 것으로 주석이 달렸습니다. BTx623. 그러나 이러한 유전자 발현 연구는 MAMPs 처리 또는 병원체 감염에 반응하여 차등적으로 발현되는 유전자를 확인할 수 있지만, 이러한 유전자가 특정 병원체에 대한 내성에 중요하다는 것을 반드시 입증하지는 않습니다. 따라서 RNA-Seq 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 두 유전자형 모두에서 진균 저항성과 KEGG 경로의 활성화 사이의 인과 관계를 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요할 것입니다.

우리는 또한 flg22 또는 키틴 처리 후 두 유전자형 사이의 공동 조절 DEG뿐만 아니라 모든 조건(그림 4C)에서 DEG의 핵심 세트에 대한 KEGG 경로 농축 분석을 수행했습니다(그림 7C). 결과는 식물-병원체 상호작용 경로를 포함하는 6개의 중요한 경로가 DEG의 상향 조절된 코어 세트에서만 풍부하고 하향 조절된 DEG 코어 세트에서는 풍부하지 않다는 것을 보여주었다. 유사하게, 식물-병원체 상호작용 경로를 포함한 7개 및 3개의 경로는 각각 BTx623 및 SC155-14E에서 키틴 상향 조절된 DEG 및 flg22 상향 조절된 DEG에서 상당히 풍부했습니다. 대조적으로, 진핵생물 경로에서 리보솜 생물발생만이 두 유전자형 모두에서 키틴 하향 조절 DEG가 풍부하였다.

2.5. 선별 유전자의 정량적 RT-PCR을 사용한 RNA-Seq 데이터 검증

RNA-seq에서 얻은 유전자 발현 프로파일링 데이터를 확인하기 위해 qRT-PCR 분석을 수행하여 9개의 선별된 후보 유전자의 발현을 평가했습니다. 이 9개의 유전자는 세 가지 범주에서 RNA-seq에 의해 관찰된 발현을 기반으로 선택되었습니다: (a) flg22 또는 키틴 처리로 BTx623 및 SC155-14E에서 유사하게 발현됨; (b) SC155-14E로 처리된 MAMP에서만 발현되지만 처리된 BTx623에서는 발현이 매우 낮고 (c) BTx623에 비해 SC155-14E로 처리된 MAMP에서 2~21-배 높게 표현됨 . qRT-PCR 분석 결과(표 1)는 평가된 9개 유전자 각각에 대해 RNA-seq 분석에 의해 결정된 발현 수준과 완전히 일치함을 보여주었습니다. 이러한 결과는 RNA-seq에 의한 측정이 MAMP 처리에 대한 수수의 전사 반응을 반영한다는 확신을 줍니다.

2.6. 결론

이 연구에서 우리는 먼저 3개의 잎 세트를 사용하여 ROS 생산을 테스트하여 두 유전자형의 MTI 반응을 비교하기 위한 최적 조건을 찾았고 RNA 추출 및 후속 transcriptomic 분석을 위해 15일된 식물의 두 번째로 어린 잎을 선택했습니다. 수수 계열 SC155-14E(그림 1C)에서 flg22- 유발 및 키틴 유발 ROS 생산의 시간 경과에 따르면 키틴 유발 ROS 생산은 flg22 처리에 의해 유발된 것보다 더 일찍 발생했습니다. 진균병 탄저병 저항성 수수 이색 유전자형 SC155-14E의 ROS 생산에 대한 MAMP 처리에 대한 높은 반응성 및 감수성 유전자형 BTx623의 초기 단계에서 MAMP 처리에 대한 ROS 생성물에 대한 낮은 반응성의 발현 프로파일을 얻었다. 선천적 면역반응의

결과는 MAMP 처리에 대한 반응으로 수수 유전자형 BTx623 및 SC155-14E에서 유전자 발현의 명확한 변이를 보여줍니다. 두 MAMP에 대한 응답은 각 라인 내에서 상당한 중복(86.6–70.8%)을 보였지만 서로 달랐습니다. 더 낮기는 하지만 동일한 MAMP에 대한 두 라인의 응답 간에 일부 중복(68.3–29%)도 관찰되었습니다. 10,535개의 DEG 중 2272개의 상당한 수의 DEG가 네 가지 조건 모두에서 식별되었으며 잠정적으로 핵심 MAMP 응답을 정의합니다. 이 유전자 목록은 MAMP 치료에 대한 유전자 발현 반응을 프로파일링하려는 실험실에 유용해야 합니다. RNA-seq 분석은 flg22 또는 키틴으로 처리된 BTx623 및 SC155-14E에서 이 두 계통의 처리되지 않은 모의 대조군과 비교하여 차별적으로 발현되는 많은 유전자 세트를 식별했습니다. 또한 두 가지 다른 생물 정보학 파이프라인을 사용하여 선택한 DEG를 비교한 결과 매우 유사한 결과를 보였습니다. 이러한 DEG의 상세한 발현 프로필 분석, GO 농축 분석 및 KEGG 경로 분석은 두 유전자형의 유전자 발현 반응에서 명확한 변화를 나타냈습니다. GO 용어 및 KEGG 경로 농축은 MAMP 처리된 SC에서 더 많은 면역 및 병원체 저항성 관련 DEG(PR 유전자, 키틴에 대한 유전자 반응, 살리실산에 대한 유전자 반응, 스트레스에 대한 반응, 페닐프로파노이드 생합성 등)를 발견했습니다.{{18} }동일한 처리로 BTx623과 관련된 E 샘플. 이 정보는 이 주요 작물의 선천적 면역 체계가 MAMPs 유도에 어떻게 반응하는지에 대한 중요한 기본 정보를 제공합니다. 애기장대 모델에 비해 작물의 선천적 면역 반응에 대한 정보가 일반적으로 부족하다는 점을 감안할 때, 설명된 유전자 목록과 방법은 병원균에 대한 수수의 반응을 더 탐구할 수 있는 자원을 제공하고 궁극적으로 질병 저항성을 개선하기 위한 노력을 촉진해야 합니다. 이 중요한 식품 및 바이오매스 작물.

3. 재료 및 방법

3.1. 식물 재료

William Rooney 박사(Texas A&M University, College Station, USA)와 Dr. Stephen Kresovich(Clemson University, Clemson, USA)가 제공한 두 개의 수수 계통이 이 연구에 사용되었습니다. BTx623은 전체 게놈 염기서열이 있는 표준 수수 계통[22]이고, SC155-14E는 탄저병 저항성을 위해 개발된 계통이다[39].

3.2. ROS 분석

BTx623 및 SC155-14E의 수수 종자를 표면 살균(1분 동안 70% 에탄올, 10분 동안 10% 표백, 오토클레이브 ddH2O로 헹구기)하고 오토클레이브된 Sunshine 포팅 믹스에 심고 성장 챔버에서 발아했습니다( 16시간/8시간 밝음/어두움, 28/26 ºC, 60–70% 습도). 15일된 식물을 실험에 사용하였다.

2개의 MAMP, flg22(Genscript 카탈로그# RP19986) 및 게 껍질의 키틴(Sigma-Aldrich, 카탈로그# C3641)이 이 연구에 사용되었습니다. Flg22는 식물 병원성 박테리아의 플라젤린 N-말단에서 유래한 펩타이드로 식물에서 특정 선천 면역 반응을 유도하는 것으로 잘 알려져 있습니다[62]. 키틴은 곰팡이 세포벽에서 파생된 전형적인 MAMP 분자로 식물 면역 반응을 유도합니다[3]. ROS 분석은 Kimball et al. [38]. 개별 유전자형 내 MAMP 반응의 변이와 잎의 위치를 ​​평가하기 위해 각 유전자형 식물의 완전히 확장된 세 잎 모두를 개별적으로 평가했습니다. 각 유전자형의 15일된 수수 식물체의 아래에서 위로 잎을 잎 #1, #2, #3으로 표시하였다. 우리는 ROS 생산을 측정하기 위해 샘플링을 위해 잎의 중간 부분만을 사용했습니다. 처리 직후, Photek CCD 카메라(Photek Ltd., East Sussex UK)를 사용하여 각 샘플의 화학발광 신호를 30분 동안 기록하였다. 8개의 웰은 모의 처리(MAMP 없음)로 구성되었고 8개의 웰은 처리(MAMP 포함)로 구성되었습니다. 모든 경우에 총 8개의 샘플을 포함하는 3개의 생물학적 복제물을 각 처리에 대해 비교했습니다.

3.3. MAMP를 사용한 샘플 처리

15일된 식물을 실험에 사용하였다. MAMP 처리는 Valdes-Lopez et al. [12] 약간의 수정. 간략하게, 각 수수 라인에 대한 5개 식물로부터의 두 번째 잎(위에서, 즉 두 번째로 어린 잎)을 분리한 다음 오토클레이브된 ddH2O로 2분 동안 진공 침투시켰다. 약 50개의 직경 1cm 잎 원반을 각 유전자형의 물이 침투된 잎에서 잘라내어 모았습니다. 각 유전자형의 45개 잎 디스크를 3개의 다른 페트리 접시(각 페트리 접시에 15개 잎 디스크)로 옮긴 다음 플레이트를 알루미늄 호일로 덮은 상태로 오토클레이브된 ddH2O에서 실온에서 밤새 부유시켰습니다. 다음날, 모든 페트리 접시에서 물을 제거하고 ddH2O(모의) 10mL, 1μM flg22 10mL 또는 20mg/mL 키틴 용액 10mL로 교체했습니다. 60-분 처리 후 모의 및 MAMP 처리된 잎 조각을 다른 튜브에 수확하고 즉시 액체 질소에서 동결했습니다. 잎 조각 샘플(모의, flg22 또는 키틴 처리가 있는 101개의 "ies ied-11272) 면역BTx623 및 SC155-14E, 3개의 생물학적 복제물)은 RNA 추출을 위해 -80ºC에 보관되었습니다. 모두 위에서 설명한 절차는 가능한 모든 광합성 효과를 제거하기 위해 어두운 조건에서 수행되었습니다.

3.4. RNA 추출, 시퀀싱 및 라이브러리 구축

Zymoresearch(카탈로그 번호 R2071)의 Direct-zol RNA Miniprep Plus 키트를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 RNA 추출을 수행했습니다.

High-throughput sequencing은 University of Missouri DNA Core Facility에서 수행되었습니다. Illumina의 TruSeq mRNA 좌초 샘플 준비 키트에 제공된 시약을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 18개의 라이브러리를 구성했습니다. 샘플 농도는 Qubit HS RNA 분석 키트를 사용하여 Qubit fluorometer(Invitrogen)로 결정했고 RNA 무결성은 Fragment Analyzer 자동 전기영동 시스템을 사용하여 확인했습니다. 간단히 말하면, 폴리-A 함유 mRNA를 총 RNA(1μg)로부터 정제하고, RNA를 단편화하고, 단편화된 RNA로부터 이중 가닥 cDNA를 생성하고, 어댑터를 포함하는 인덱스를 말단에 결찰시켰다. 증폭된 cDNA 구축물은 Axyprep Mag PCR Clean-up 비드를 첨가하여 정제했습니다. 각 정제된 라이브러리의 최종 구성은 Fragment Analyzer 자동 전기 영동 시스템을 사용하여 평가하고, Qubit HS dsDNA 분석 키트를 사용하여 Qubit 형광계로 정량화하고, NextSeq 500에서 시퀀싱하기 위한 Illumina의 표준 시퀀싱 프로토콜에 따라 희석했습니다. 시퀀싱 길이는 단일이었습니다. 75 염기에서 읽습니다.

3.5. RNA-Seq 읽기 매핑 및 처리

시퀀스 데이터는 모의, flg22 또는 키틴 처리가 있는 BTx623 및 모의, flg22 또는 키틴 처리가 있는 SC155-14E의 6가지 조건을 나타냅니다. 각 조건은 3개의 생물학적 복제로 표시되어 총 18개의 샘플이 생성되었습니다. 첫째, 읽기의 30 끝은 cutadapt를 사용하여 Illumina 어댑터, 모호한 뉴클레오티드(N) 및 (NextSeq 기술로 인해) 인공 poly-G(G{100}로 표시됨)에 대해 "트림"되었습니다. 버전 1.15(http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, 2019년 8월 21일 액세스) 30개의 끝이 90% 동일성을 가진 최소 3개의 염기에 대해 어댑터와 겹치는 읽기용. 이 트리밍 후 판독에 10개 미만의 염기가 포함된 경우 폐기되었습니다(해당되는 경우 쌍을 이룬 판독과 함께). 트리밍 후 RNA seq 데이터에 대한 품질 점수는 FASTQC(버전 0.11.9) [63]를 사용하여 조사되었습니다. 읽기의 모든 위치에 대해 품질 점수 중앙값은 약 34이며 이는 기본 호출 정확도가 99.9%보다 높다는 것을 나타냅니다. 각 샘플에 대한 읽기는 Tophat 2.1.1을 사용하여 참조 게놈(Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level.fa)에 정렬되었습니다. 결과 정렬 파일은 Cufflinks 2.2.1에 제공되어 각 샘플에 대한 성적표를 조립했습니다. 이 연구에 사용된 주석 버전은 Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3입니다. Cuffmerge를 사용하여 동일한 조건의 샘플을 병합했습니다. 그 목적은 각 조건에서 유전자 및 전사체 발현을 계산하기 위한 균일한 기준을 제공하는 것이었습니다.

3.6. RNA-Seq 데이터의 생물정보학적 분석

RNA seq 데이터는 생물정보학 도구 Bowtie{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 및 Cufflinks 2.2.1(Cuffmerge, Cuffdiff)을 기본 매개변수와 함께 사용하여 분석했습니다. Trapnell et al.에 설명된 대로 이러한 도구와 동일한 파이프라인을 사용했습니다. [64]. 분석 결과를 추가로 확인하기 위해 HiSat2(버전 2.1.0), HTSeq(버전 0.12.4) 및 edgeR(버전 3.26.8)과 함께 다른 파이프라인을 사용하여 분석을 수행했습니다. HiSat2는 TopHat2의 차세대 개발품입니다. 먼저 HiSat2를 사용하여 Sorghum 참조 게놈을 사용하여 정렬을 수행했습니다. 그런 다음 HTSeq를 사용하여 각 유전자에 매핑된 읽기 수를 세었습니다. 이를 위해서는 이전 단계에서 생성된 bam 파일과 게놈 주석(gif 파일)이 필요했습니다. 참조 게놈과 주석 파일은 원래 파이프라인에서 사용한 것과 동일합니다. 마지막으로 R 패키지 edgeR을 사용하여 각 조건에서 차별적으로 발현되는 유전자를 결정했습니다.

3.7. 차별적으로 발현된 유전자의 확인
병합된 어셈블리는 발현 수준을 계산하고 두 조건 사이에서 관찰된 변화의 통계적 유의성을 테스트하는 Cuffdiff에 공급되었습니다. 우리는 각각 BTx623과 SC155-14E에 대해 mock vs. flg22, mock vs. chitin 사이의 조건을 비교했습니다. 차별적으로 발현된 유전자는 0.001 p-값 임계값을 사용하여 추출되었습니다. flg22 또는 키틴으로 처리된 BTx623 조건 및 flg22 또는 키틴으로 처리된 SC155- 14E 조건에서 각각 유전자 발현 변화의 중요성을 보여주기 위해 R 패키지(ggplot2 V3.3.0)를 사용하여 화산 플롯을 만들었습니다. -log10(p-값)이 3 이상인 유전자 점을 DEG로 간주했습니다. 각 플롯에서 log2(폴드_변화)가 0보다 큰 유전자 점은 상향 조절된 유전자이고, 그렇지 않으면 하향 조절된 유전자입니다.

3.8. PCA 플롯

각 수수 라인의 세 가지 생물학적 복제물의 유전자 발현 값과 각 MAMP 처리 간의 관계를 조사하기 위해 R 패키지(ggfortify V{0}}.4.10, ggplot2 V3)를 사용하여 주성분 분석(PCA) 플롯을 생성했습니다. .3.0). 각 점은 원래의 특징 공간(유전자 발현)에서 처음 두 개의 주성분으로 매핑한 후의 조건을 나타냅니다. 동일한 조건에 속하는 점들은 함께 모여 있는 경향이 있습니다.

3.9. DEG의 히트 맵

1 미국 미주리주 컬럼비아주 미주리대학교 CS Bond 생명과학센터 식물과학기술 및 생화학과 65211; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 전기 공학 및 컴퓨터 과학과, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Plant Science Research Unit, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, USA

* Correspondence: staceyg@missouri.edu