생존 가능한 열 사멸 프로바이오틱 균주는 구강 점막의 IgA 농도를 높여 구강 면역력을 향상시킵니다.

추상적인

구강-비강 점막 면역은 박테리아 및 바이러스 침입으로부터 신체를 보호하는 데 중요한 역할을 합니다. 인간의 면역력과 구강 건강을 강화하기 위해 안전한 프로바이오틱스 제품이 사용되었습니다. 본 연구에서는 Lactobacillus salivarius subsp.로 구성된 혼합된 생존 가능한 프로바이오틱 정제의 유익한 효과를 검증했습니다. salicinius AP-32, Bifdobacteriumanimalis subsp. lactis CP-9, Lactobacillus paracasei ET-66, 그리고 L. salivarius subsp.로 구성된 열분해 프로바이오틱 정제. salicinius AP-32 및 L. paracasei ET-66, 45명의 건강한 참가자를 대상으로 한 구강 면역에 관한 연구입니다. 참가자들은 무작위로 생존 가능한 프로바이오틱스 그룹, 가열 사멸된 프로바이오틱스 그룹, 위약 그룹으로 나뉘었습니다. 치료 투여는 4주 동안 지속되었다. 타액 샘플은 0주, 2주, 4주, 6주에 수집되었으며 Lactobacillus, Bifidobacterium 및 Streptococcus mutans 개체군과 IgA 농도가 측정되었습니다. PBMC 세포의 IgA 농도와 TGF-베타 및 IL{15}} 수준을 ELISA 방법으로 정량화했습니다. 결과는 타액 IgA 수치가 두 생존균(119.30±12.63%, ***P) 투여 시 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다.<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

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소개

흡입된 항원과 접촉하는 관문인 구강-비점막은 인간 면역체계의 최전선 방어선입니다[1, 2]. 일반적으로 병원성 바이러스나 박테리아는 국소 면역체계와 건강한 미생물군에 맞서 싸워 구강-비강 점막 표면을 침범합니다[3]. 침입성 병원성 바이러스와 세균에 대한 면역반응으로 인해 기침, 인후통, 콧물, 발열 등의 염증 및 증상이 발생한다[4]. 또한 면역글로불린 A(IgA)는 타액의 주요 면역 인자이며 구강 미생물군의 항상성을 조절합니다[5]. 여러 연구에서 분비형 IgA가 호흡기 세포융합 바이러스[6], 로타바이러스[7] 및 인플루엔자 바이러스[7]를 포함한 바이러스 병원체에 의한 감염으로부터 신체를 보호하는 능력이 보고되었습니다. 분비 IgA는 점막 상피를 보호하는 기능을 합니다. 니콜라스 밀레(Nicolas Millet) 외. 점막 IgA가 구강 내 공생 Candida albicans dysbiosis를 예방할 수 있음을 발견했습니다 [8]. 또한 치석을 유발하는 구강 병원균인 Streptococcus mutans의 응집을 방지합니다[9].

게다가, 연구자들은 구강 미생물군과 그 대사산물이 구강 장벽의 면역에 국소적으로 영향을 미칠 수 있음을 발견했습니다[10]. 이전 연구에서는 구강 점막의 IgA 농도를 높이는 데 있어 프로바이오틱스의 효과가 입증되었습니다[11]. Ericsonet al. Lactobacillus reuteri가 함유된 츄잉껌이 타액 IgA 수준을 증가시켜 건강한 피험자의 적응 면역 반응에 참여한다는 것을 입증했습니다 [12]. 인간의 경우 면역 사이토카인인 TGF-베타와 IL{4}}는 IgA 생산과 상관관계가 있습니다[13].

그러나 경구 미생물군이 사이토카인 TGF-베타 및 IL-10을 통해 분비 IgA 수준을 증가시켰는지 여부는 여전히 불분명합니다. 또한, 구강 병원체에는 S. mutans, P. gingivalis 및 F. nucleatum subsp.가 포함됩니다. 다형성과 A. actinomycetemcomitans는 치주질환 및 구취와 높은 상관관계를 보였다[14]. 프로바이오틱스 제품은 구강 병원균인 Fusobacterium nucleatum을 억제함으로써 치주염에 대한 잠재적인 대체 치료법이 될 수 있지만, Porphyromonas gingivalis와 Aggregatibacter actinomycetemcomitans는 유의미한 감소를 보이지 않았습니다[15]. 프로바이오틱스 보충은 또한 병원성 감염을 예방할 수 있습니다[16]. 미생물총의 주요 종이 병원성 연쇄상구균 폐렴의 성장을 제한하는 것으로 보고되었습니다[17]. 따라서 프로바이오틱스 균주의 흡수를 통해 균형 잡힌 미생물 생태계를 유지하는 것은 구강 면역을 조절하고 구강 건강을 향상시키는 대안이 될 수 있습니다. 프로바이오틱스 균주에 의한 경구 병원체 억제에 대한 이전 연구 결과에 따르면 Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacteriumanimalis subsp. lactis CP-9 및 Lactobacillus paracasei ET-66는 in vitro에서 우수한 항균 효과를 나타냅니다. 그러나 H2O2 수준을 증가시키는 메커니즘은 아닙니다[18]. 구강 병원성 성장을 제한하기 위한 프로바이오틱스 균주의 주요 전략은 구강 내 병원체 공동 응집, 생물계면활성제 생산, 구강 환경 변화, 항균물질 생성 등이었다[19]. 또한, 시험관 내 연구에서는 L. salicinius AP{14}} 매개 염증성 사이토카인[인터루킨(IL)-8, IL-10]이 인간 상피 세포에서 발현되는 것으로 나타났습니다[20]. 따라서 본 연구에서는 L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B.animalis subsp. lactis CP-9 및 L. paracasei ET-66, 그리고 L. salivarius subsp.로 구성된 열분해 프로바이오틱 정제. Salicinius AP-32 및 L. paracasei ET-66는 TGF-베타, IL-10를 통해 면역 기능을 개선하거나 타액 IgA 농도 수준을 높였습니다. 구강 내 프로바이오틱스 제품 흡수의 항균 기능을 테스트했습니다.

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재료 및 방법

참가자들

총 20~40세의 건강한 참가자 45명을 모집하여 생존 가능한 프로바이오틱 경구 정제, 열 사멸 프로바이오틱 경구 정제 및 위약 그룹의 세 가지 하위 그룹으로 무작위로 나누었습니다. 각 그룹은 15명의 참가자로 구성되었습니다. 흡연 및 빈랑 섭취 습관이 있는 참가자는 제외되었습니다. 경구 정제는 참가자들에게 맹목적으로 할당되었습니다. 모든 참가자는 4주 동안 하루 3회(아침, 점심, 저녁) 경구 정제를 복용했습니다. 0주차, 2주차, 4주차, 6주차에 IgA 농도와 미생물 개체수를 측정하기 위해 타액 샘플(2mL)을 수집했습니다. 본 연구에 포함된 모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜은 대만 청산 의과대학 기관 검토 위원회(CS19052)의 승인을 받았습니다.

실행 가능한 프로바이오틱 경구 정제

생존 가능한 프로바이오틱 경구 정제(1g)에는 3개의 생존 가능한 프로바이오틱 균주인 L. salivarius subsp.가 포함되어 있습니다. salicinius AP-32, B.animalis subsp. lactis CP-9 및 L. paracasei ET-66. 경구 정제에 0.01011 집락 형성 단위(CFU) 단일 프로바이오틱스 1g을 혼합했습니다. 각 단일 프로바이오틱스 균주는 약 0.33 * 109CFUs/g으로 측정되었습니다. 경구 정제의 총 프로바이오틱스 함량은 109 콜로니 CFU/g이었습니다. 프로바이오틱 경구 정제의 활성 복용량은 이전에 발표된 연구를 따랐습니다[18]. 모든 프로바이오틱스 균주는 Biofag Biotech Co., Ltd.(대만 타이난) 연구소에서 구입했습니다. L. 살리바리우스 subsp. salicinius AP-32는 건강한 사람의 장에서 분리되어 대만 식품 산업 연구 개발 연구소(ID: BCRC 910437) 및 중국 우한 대학교(ID: CCTCC-M2011127)에 기탁되었습니다. B. 동물성 subsp. 젖산 CP-9는 건강한 모유에서 분리되어 대만 식품 산업 연구 개발 연구소(ID: BCRC 910645) 및 우한 대학교(ID: CCTCC-M2014588)에 기탁되었습니다. L. paracasei ET-66는 건강한 사람의 모유에서 분리되어 대만 식품 산업 연구 개발 연구소(ID: BCRC 910753)와 중국 베이징의 중국 일반 미생물 배양 수집 센터(ID: CGMCC{ {22}}). 유산균. 타액류 subsp. salicinius AP-32 및 L. paracasei ET-66를 de Man, Rogosa 및 Sharpe(MRS) 한천 플레이트(110,660, Merck, Darmstadt, Germany)에서 배양하고 37도에서 통성 혐기성 조건에서 배양했습니다. 48시간 동안. B. 동물성 subsp. Lactis CP-9를 0.05% 시스테인이 첨가된 MRS 한천에서 배양하고 37도에서 48시간 동안 혐기적으로 배양했습니다. 프로바이오틱스 균주를 배양한 후 박테리아 CFU를 정량화하기 위해 콜로니 계수를 수행했습니다[18].

시스탄체 식물의 면역 체계 증가

가열 처리된 프로바이오틱 경구 정제

열 사멸된 프로바이오틱 경구 정제(1g)는 비활성화된 L. salivarius subsp. salicinius AP-32 및 L. paracasei ET-66. 이전에 설명한 대로 생존 가능한 균주를 배양하고 배양했습니다. 그런 다음, 생존 가능한 균주를 MRS 배지에서 100도에서 1시간 동안 배양하여 AP-32 및 ET-66를 비활성화했습니다. 경구 정제의 프로바이오틱스 함량은 1×1010개 세포/g이었습니다. 열분해 프로바이오틱 경구 정제의 활성 투여량은 이전에 발표된 시험관 내 테스트를 따랐습니다[11]. 모든 실험 절차는 Biofag Biotech Co., Ltd.(대만 타이난) 실험실에서 수행되었습니다.

타액 샘플의 락토바실러스 및 비피도박테리움 개체군 측정

타액 샘플(2mL)은 0주, 2주, 4주, 6주차에 각 참가자로부터 수집되었습니다. 타액 샘플(100μL)을 연속적으로 희석하여 MRS에 추가했습니다. 접시. 락토바실러스 집단을 측정하기 위해 락토바실러스를 MRS 한천 플레이트에서 37도에서 48시간 동안 통성 혐기성 조건에서 배양하고 배양했습니다. Bifdobacterium 개체수를 측정하기 위해 Bifdobacterium을 배양하고 0.05% 시스테인이 보충된 MRS 한천에서 37도에서 48시간 동안 혐기적으로 배양했습니다. 프로바이오틱스 균주를 배양한 후 박테리아 CFU를 정량하기 위해 콜로니 계수를 수행했습니다. 락토바실러스 및 비피도박테리움 개체군 비율은 0주차에 프로바이오틱스 개체수로 정규화되었습니다. 0주차에 수집된 락토바실러스 및 비피도박테리움 개체군 비율은 100%로 간주되었습니다. 실험 방법은 이전에 발표된 연구[18]를 따랐습니다.

구강 점막의 IgA 농도 측정

타액 샘플(2mL)은 0주, 2주, 4주 및 6주차에 각 참가자로부터 수집되었으며 20도에서 유지되었습니다. IgA Human Uncoated ELISA Kit(카탈로그 번호 88-50600-88; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)를 사용하여 IgA 농도를 분석했습니다. 먼저, 우리는 항인간 IgA 항체를 96-웰 플레이트에 코팅했습니다. 샘플 또는 표준물질에 존재하는 타액 IgA를 마이크로웰에 첨가한 후, HRP-접합 항-인간 IgA 항체를 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. TMB 기판을 각 웰에 30분 동안 피펫팅합니다. 마지막으로, IgA 결합은 450 nm에서 분광광도계로 측정되었습니다. 모든 실험 절차는 제조업체의 지침에 따라 3회 반복하여 수행되었습니다. 0주차에 수집된 IgA의 농도 비율은 100%로 간주되었습니다. 실험 방법은 이전에 발표된 연구[18]를 따랐습니다.

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PBMC에서 TGF-Beta 및 IL-10 농도 측정

이전 연구에 이어 프로바이오틱스에 의해 유발된 TGF-베타 및 IL{2}} 수준의 상승을 테스트합니다[20]. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 건강한 기증자의 혈액 샘플(대만 혈액 서비스 재단 타이난 혈액 센터)에서 채취했습니다. Ficoll-Hypaque 구배(스웨덴 Pharmacia)를 통해 전혈을 원심분리하여 42.5%-50% 경계면에서 광밀도 분획을 용출했습니다. 1% FBS(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)가 포함된 100μl RPMI-1640에 4 * 105 세포 추출된 PBMC 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩합니다. 그런 다음 잘 파종된 각 PBMC에 5 * 105 cfu/20 µl 프로바이오틱 처리제를 첨가합니다(세포: 프로바이오틱 균주=1:10). 양성 대조군은 각각 TGF-, IL-10 생산을 위해 PBMC 파종 웰에 10μg/ml Phytohaemagglutinin(PHA)(Sigma-Aldrich, 뮌헨, 독일)을 첨가했습니다[21]. 48시간 동안 PBMC와 프로바이오틱스를 공동 배양합니다. 사이토카인 IL-10 및 TGF-를 함유하는 상청액을 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 분석(Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA)으로 측정합니다. 모든 실험은 측정되었으며 적어도 3회 이상 상용 프로토콜을 따랐습니다.

구강 내 항균기능 평가

스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 전염병이나 생물막을 형성하여 치아 우식을 유발하는 일반적인 구강 건강 위협입니다[22]. Streptococcus mutans 샘플은 면봉에서 수집되었으며, 이를 통해 0주, 2주, 4주 및 6주에 치은연상 부분, 치은 및 구강 점막에서 S. mutans를 수집했습니다. S. mutans는 트립신에서 유지되었습니다. 50% 글리세롤이 보충된 간장 국물(TSB, 5 mL). S. mutans 배지를 연속적으로 희석하여 Mitis Salivarius-Bacitracin Agar(MSBA, 0.2 U/mL) 플레이트에 첨가하고 37도에서 2일 동안 배양하였다. 마지막으로, 각 참가자 샘플의 S. mutans 콜로니 수를 계산하여 병원성 생존율을 계산했습니다. 0주차에 수집된 S. mutans의 생존율은 100%로 간주되었습니다. 실험 방법은 이전에 발표된 연구[18]를 따랐습니다.

경구용 정제의 시험관 내 항균 활성

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>1010 CFUs) 프로바이오틱 균주를 각각 TSB 및 뇌심장 주입 배지에 용해시켜 최종 농도 0.1 g/mL를 얻었습니다. 공백군은 배지만 사용하였고, 위약군은 프로바이오틱스 성분이 없는 정제(1g)를 각각의 배지에 용해시켰다. 그런 다음 경구 병원균(106 CFU)을 정제 용액에 도입하고 2(S. mutans) 또는 3(Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum 및 Aggregatibacter actinomy cetemcomitans)에 대해 37도에서 공동 배양했습니다. d. 병원균은 BCRC에서 얻었습니다. 경구 병원체 억제율(%)은 다음과 같이 계산되었습니다: (CFUblank 대조군-CFU실험군)/CFUblank 대조군. 실험 방법은 이전에 발표된 테스트를 따랐습니다[11].

통계 분석

GraphPad Prism 소프트웨어는 양측 t-검정 결과의 통계 분석에 사용되었습니다. 데이터는 평균 표준 편차(SD) 또는 2~3개의 독립적인 실험 결과의 평균으로 표시되었습니다. 통계적 차이는 P 값에서 유의미한 것으로 간주되었습니다.<0.05.

결과

프로바이오틱 정제는 구강 내 비피도박테리움 개체수를 증가시켰습니다

프로바이오틱 정제 투여 후 구강 내 비피도박테리움 개체수가 안정적으로 증가했습니다. 치료 후 박테리아 개체수는 치료 전 박테리아 개체수로 정규화되었습니다(개체 비율 %=치료 후 CFU/치료 전 CFU). 생존 가능한 프로바이오틱스 그룹에서는 2주차에 개체군 비율이 244.14±164.96%로 크게 증가했습니다(**P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

프로바이오틱 정제는 구강 내 유산균 개체수를 증가시켰습니다

프로바이오틱스 정제 투여로 인한 경구 유산균 개체수의 변화는 경구 비피도박테리움 개체수의 변화와 유사한 패턴을 나타냈다. 처리 후 박테리아 개체수는 처리 전 박테리아 개체수로 정규화되었습니다. 생균제군에서는 2주차에 락토바실러스 개체군 비율이 447.74±337.89%로 크게 증가했습니다(**P<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

그림 1a 구강 점막 표면의 비피도박테리움 개체수 측정. V 생존 가능한 프로바이오틱 정제; H 열 사멸된 불활성화된 프로바이오틱 정제; C 위약 정제(대조군); 및 LAB 유산균. 0주, 2주, 4주, 6주차에 타액 샘플을 수집하고 분석했습니다. 데이터는 평균 표준편차(SD)로 제시되었습니다. 통계적 차이를 분석하기 위해 양측 t- 테스트가 사용되었습니다. 통계적 유의성은 *P로 표시되었습니다.<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

AP-32, ET-66, CP-9를 함유한 프로바이오틱 정제는 구강 점막의 IgA 농도를 크게 높였습니다.

프로바이오틱스 정제(생존 가능 또는 가열 살해) 섭취가 구강 내 비피도박테리움 및 락토바실러스 수치를 높이는 것으로 입증되었기 때문에 우리는 프로바이오틱스 제품의 섭취로 인해 발생한 타액 IgA 농도 변화를 추가로 분석했습니다. 치료 후 IgA 수준은 치료 전 IgA 수준으로 표준화되었습니다. 생존 가능한 프로바이오틱스 그룹에서 타액 IgA 농도는 2주차에 1{19}}3.24 ± 8.10%(그림 2), 4주차에 104.81 ± 13.26으로 약간 증가했지만 통계적으로 유의미한 차이는 없었습니다. 그러나 생균제군의 타액 IgA 농도는 위약군에 비해 0주차에 비해 6주차(4주차 이후 2주 동안 생균제 정제 투여 없음)에 119.30±12.63%로 유의하게 증가하였다(4주차 이후 생균제 정제 투여 없음). ***피<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

PBMC에서 IL-10 및 TGF-베타 수준이 증가된 생존 가능한 균주

10 µg/ml Phytohaemagglutinin(PHA)의 양성 대조군은 IL-10(58.2 ± 7.9 pg/ml, ***P < 0.001, 그림 3a) 및 TGF-의 수준을 성공적으로 높였습니다. (53.4±8pg/ml, ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

그림 2 타액 샘플의 면역글로불린 A(IgA) 농도. V 생존 가능한 프로바이오틱 정제; H 열 사멸된 불활성화된 프로바이오틱 정제; C 위약 정제(대조군); 및 LAB 유산균. 0주, 2주, 4주, 6주차에 타액 샘플을 수집하고 분석했습니다. 데이터는 평균 표준편차(SD)로 제시되었습니다. 통계적 차이를 분석하기 위해 양측 t- 테스트가 사용되었습니다. 통계

AP-32, ET-66 및 CP-9를 함유한 프로바이오틱 정제는 타액 내 S. mutans 개체군을 억제했습니다.

증가된 비피도박테리움 및 락토바실러스 개체군과 증가된 타액 IgA 농도는 구강 병원성 미생물과의 싸움에 기여할 수 있습니다. 후속 실험에서 우리는 프로바이오틱스 개입으로 인한 구강 병원체 S. mutans 개체군의 변화를 테스트했습니다. 처리 후 박테리아 개체수는 처리 전 박테리아 개체수로 정규화되었습니다. 생존 가능한 프로바이오틱스 그룹에서 S. mutans 개체군은 2주차에 크게 감소했습니다(53.55±31.60%, ***P).<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

그림 3. 생존 가능한 균주는 PBMC에서 IL{1}} 및 TGF-베타 수준을 증가시켰습니다. PBMC의 IL-10 및 b TGF-베타 수준은 프로바이오틱 균주를 처리하여 테스트되었습니다. 5 * 105 cfu/20 µl CP-9, AP-32 및 ET-66의 생존 가능한 균주를 PMBC 10 µg/ml에 추가합니다. 피토헤마글루티닌(PHA)을 양성 대조군으로 사용했습니다. 음성 대조군은 RMPI-1640 배지로만 처리된 PBMC였습니다. 세 번의 테스트가 수행되었습니다. 데이터는 평균 표준편차(SD)로 제시되었습니다. 통계적 차이를 분석하기 위해 양측 t- 테스트가 사용되었습니다. 통계적 유의성은 P로 표시되었습니다.<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

그림 4. 구강점막 표면의 병원성 Streptococcus mutans 개체수 측정. V 생존 가능한 프로바이오틱 정제; H 열 사멸된 불활성화된 프로바이오틱 정제; C 위약 정제(대조군); 및 LAB 유산균. 0주, 2주, 4주, 6주차에 타액 샘플을 수집하고 분석했습니다. 데이터는 평균 표준편차(SD)로 제시되었습니다. 통계적 차이를 분석하기 위해 양측 t- 테스트가 사용되었습니다. 통계적 유의성은 *P로 표시되었습니다.<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

체외 시험을 통한 프로바이오틱 정제의 경구 병원체 성장 억제 능력 확인

시험관 내 연구에서는 생존 가능한 프로바이오틱 정제가 구강 병원체의 생존율을 유의하게 억제하는 것으로 나타났습니다(그림 5a). 처리 후 박테리아 개체수는 처리 전 박테리아 개체수로 정규화되었습니다. 위약군에 비해 생균제군에서 S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum 및 A. actinomy cetemcomitans의 생존율은 4.23%로 감소했습니다(***P < 0 .001, 위약=91%), 8.64%(***P < 0.001, 위약=89%), 5.77%(**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

논의

위약 그룹과 비교하여, 생존 가능한 프로바이오틱 정제 또는 가열 사멸된 프로바이오틱 정제를 4주 동안 공급하면 락토바실러스 및 비피도박테리움의 경구 개체수가 크게 증가할 것입니다. 또한 유산균 및 비피도박테리움 수치는 생균제 섭취를 중단한 후에도 2주 동안 유의하게 높은 수준을 유지했습니다(그림 1a 및 b). 유사하게, Camila Casuccio Almeida et al. 프로바이오틱스 치료를 4주간 투여하면 유당 불내증 환자의 증상이 프로바이오틱스 섭취 중단 후 최소 3개월 동안 호전될 수 있음이 입증되었습니다[23]. 그러나 장기간 치료에서 프로바이오틱스의 지속적인 효과는 향후 평가가 필요합니다. 또한, 생존 가능하고 열사멸된 프로바이오틱 정제를 투여한 경우 타액 IgA 농도가 유의하게 증가했습니다. 열살균군과 생존 프로바이오틱스군 모두 4주 동안 경구용 정제를 투여하여 타액 IgA를 증가시켰으나 위약군과 통계적 차이는 나타나지 않았습니다. 열 사멸 및 생존 가능한 프로바이오틱스 그룹의 IgA 농도는 6주차에 유의미한 증가를 보였습니다. 그러나 2주 동안 프로바이오틱스 투여를 중단한 후 IgA 상승 메커니즘에 대해서는 추가 조사가 필요합니다(그림 2). Braathen et al. 구강 내 프로바이오틱 균주의 면역 조절 역할에 대한 유사한 결과를 보고했습니다[24]. 또한, 프로바이오틱 균주는 암퇘지와 새끼 돼지의 대변 IgA 농도를 크게 증가시키는 것으로 보고되었습니다[25]. 그러나 상기도 감염의 IgA 완화 증상에 대한 연구는 여전히 불충분합니다. 프로바이오틱 균주 CP-9, AP-32 및 ET-66에 의한 상부 기도 감염 억제 및 예방의 상세한 분자 메커니즘은 향후 연구에서 조사될 수 있습니다. 본 연구에서, 생존 가능한 균주 CP-9, AP-32 및 ET-66는 PBMC 세포에서 IL-10 및 TFG-베타의 수준을 높일 것입니다. AP-32는 PHA 양성 대조군과 비교하여 PBMC에서 IL-10 및 TFG-베타를 증가시키는 효과적인 능력을 보여주었습니다(그림 3a 및 b). 생존 가능한 균주 CP-9, AP-32 및 ET-66가 IL-10 및 TFG-베타를 분비하는 B 세포를 유도하여 타액 IgA 수준을 증가시킬 수 있다고 추정했습니다. 그러나 타액 IL{36}}, TFG-베타 및 타액 IgA 간의 상관관계는 추가로 테스트되어야 합니다[26]. 게다가, 가열 살해된 프로바이오틱스가 IL-10 및 TFG-베타를 유도하여 IgA를 증가시켰는지 여부는 여전히 불분명합니다. 시험관 내 테스트에서는 열 처리된 AP-32가 인터페론 및 IL{45}}p70 분비를 촉진하고 IL{47}} 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다[27]. 따라서 본 임상 연구에서는 프로바이오틱 CP-9, AP{50}} 및 ET{51}} 균주와 열 사멸된 AP-32 및 ET-66의 능력을 확인했습니다. 구강 내 병원성 박테리아를 억제하는 균주가 추가로 검증되었습니다(그림 4). 생존 가능한 프로바이오틱스 사탕은 유기산, 항균 펩타이드[28], 엑소폴리사카라이드(EPS)[29] 박테리오신[30]을 분비하여 열사멸 사탕보다 더 나은 항병원성 능력을 나타냈습니다(그림 5a 및 b). 생존 가능한 프로바이오틱스 균주에 의해 생성된 기능성 항균 성분은 향후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 액체 크로마토그래피(LC) 질량 분석기를 통해 검출되어야 합니다[31]. 열 살해된 프로바이오틱스는 생존 가능한 프로바이오틱스의 주요 이점을 보유하지만 생존 가능한 프로바이오틱스 균주의 특정 안전성 문제는 없는 것으로 보고되었습니다[32]. 그러나 가열사멸된 프로바이오틱스의 항균성분에 대해서는 추가적인 검증이 필요하다.

그림 5. in vitro 테스트를 통해 프로바이오틱 정제의 경구 병원균 증식 억제 능력 확인. 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)를 포함한 구강 병원균의 생존율을 억제하는 생존 가능하고 열 사멸된 프로바이오틱 정제의 능력이 검증되었습니다. 빈 그룹, 매체 전용; 위약 그룹, 프로바이오틱스 성분이 전혀 없는 정제(1g). 세 번의 테스트가 수행되었습니다. 데이터는 평균 표준편차(SD)로 제시되었습니다. 통계적 차이를 분석하기 위해 양측 t- 테스트가 사용되었습니다. 통계적 유의성은 *P로 표시되었습니다.<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

결론

L. salivarius subsp.로 구성된 혼합된 생존 가능한 프로바이오틱 정제. salicinius AP-32, B.animalis subsp. 젖산 CP-9 및 L. paracasei ET-66 및 L. salivarius subsp.를 포함한 열 사멸 프로바이오틱스. salicinius AP-32 및 L. paracasei ET-66는 Lactobacillus 및 Bifdobacterium의 구강 개체수를 증가시키고 구강 내 S. mutans를 감소시키며 건강한 참가자의 타액 IgA 농도를 증가시킴으로써 유익한 기능을 발휘했습니다. 시험관 내 테스트 결과는 생존 가능한 프로바이오틱스가 S. mutans, P. gingivalis 및 F. nucleatum subsp.를 포함한 구강 병원체를 효과적으로 억제한다는 것을 입증했습니다. 다형성 및 A. actinomycetemcomitans. 구강-비점막 면역은 침입하는 미생물에 대한 최전선 방어로서 이것이 중요한 이슈가 되었습니다. 따라서 본 연구에서는 구강 면역력과 구강 건강을 유지하기 위한 대체 전략(프로바이오틱스 보충)을 제시하고자 합니다.

cistanche 보충 혜택 - 면역 체계를 강화하는 방법

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