천연 생성물 억제제로부터 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질의 가상 스크리닝 및 분자 역학 시뮬레이션 검증 ⅱ

 

2 결과

2.1 단백질 구조 조사

현재 PDB 데이터베이스에는 CETP 단백질의 3 가지 결정 구조가 있습니다 (2OBD, 4EWS, 4F2A). 이 연구에 사용 된 4EWS 결정 구조는 가장 높은 해상도를 가지며 강력한 억제제와 결합되며 활동은 단일 나노 몰 레벨에 도달하고 2.59Å의 해상도에 도달합니다. 단백질 및 소분자 억제제 결합이 단백질의 유일한 결합 포켓이면 위치. 포켓의 표면은 그림 1a에 나와 있습니다. 소분자 결합 위치에 큰 소수성 포켓이 있음을 알 수 있습니다. 따라서이 바인딩 포켓의 경우
구조 기반 가상 스크리닝이 수행되었습니다. 도킹 그리드 포인트의 생성은 소분자 억제제가 위치한 포켓 부위를 기반으로합니다. 도킹 그리드 포인트의 중심은 결정화 리간드로 설정되고, 도킹 외부 박스의 크기는 결정화 리간드의 크기와 유사하며, 크기는 10 × 10 × 10 Å3의 크기이며, 내부 상자의 크기는 그림 1b와 같이 10 Å3으로 설정됩니다.

 

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2.2 도킹을 기반으로 한 가상 스크리닝

위의 포켓에 기초하여, L6000 데이터베이스에서 여러 라운드의 스크리닝을 수행 하였다. 특정 프로세스는 고 처리량 가상 스크리닝, 표준 정밀 가상 스크리닝 및 초고전 가상 스크리닝 후, 100 개의 화합물이 유지되었으며, 그 중에서 가장 높은 분자 도킹 점수는 -16.991 kcal/mol (1 cal {8}}. 2 j)이었다. Kcal/mol. 100 개의 고정 된 화합물을 MM-GBSA를 사용하여 재 코팅하고, 49 개의 고유 한 화합물을 마침내 얻었다. 클러스터링 및 구조적 분석 및 원래 결정질 소분자와의 위치 중첩 후, 표 1 및도 3에 도시 된 바와 같이, 최상의 일치 정도를 갖는 19 개의 화합물은 후보 화합물로서 얻어졌다.

도 1 CETP 단백질 결합 포켓의 개략도 (A), CETP 단백질 결합 부위의 개략도 (B)

그림 2 가상 스크리닝 및 분자 역학 시뮬레이션의 흐름도

 

2.3 클러스터 분석

19 개의 선택된 화합물과 4EW의 결정화 된 리간드 사이의 유사성에 기초한 클러스터링 분석 후, 분자 구조의 겹침 정도에 따라 다음 3 가지 범주로 나뉘었다. 그림 4a는 14 개의 소분자를 함유하는 첫 번째 클러스터를 보여줍니다. 이는 대부분의 작은 분자의 골격이 유사하다는 것을 나타냅니다. 그림 4b는 1 개의 소분자를 포함하는 두 번째 클러스터를 보여주고, 그림 4c는 4 개의 소분자를 포함하는 세 번째 클러스터를 보여줍니다. 그림의 검은 색은 결정화 된 리간드이며 나머지는 가상 스크리닝에 의해 얻어진 작은 분자입니다.

2.4 결합 모드 분석

19 개의 후보 화합물의 도킹 점수 및 결합 자유 에너지를 종합적으로 고려함으로써, 결합 자유 에너지 측면에서 상위 3 개 화합물을 결합 모드 분석을 위해 최종적으로 선택 하였다.Cistanche Glycoside a, Theaflavins 및 Salvianolic acid B 디메틸 에스테르. 이들 3 가지 화합물 및 CETP 단백질의 결합 모드 다이어그램은 Pymol 소프트웨어를 사용하여 그려졌다. 3 리간드의 아미노산 잔기와 표적 단백질 CETP 사이의 상호 작용은 단백질-리간드 복합체의 결합을 촉진시켜보다 안정적인 복합체를 형성한다.
그 중에서,Cistancheside a표적 단백질의 PHE463과의 방향족 수소 결합을 형성하고, 방향족 수소 결합 및 PHE263과의 π-π 적층 상호 작용을 형성하고; Theaflavin은 표적 단백질의 His232와 고전적인 수소 결합을 형성하고, PHE263과의 방향족 수소 결합을 형성하고, PHE461과 양이온-π 상호 작용을 형성한다; 살비아놀 산 B의 디메틸 에스테르는 표적 단백질의 His232 및 PHE441과 방향족 수소 결합을 형성하고, PHE463과 π-π 적층 상호 작용을 형성한다. 다른 단백질-리간드 상호 작용은 소수성 상호 작용 및 염도를 포함하며, 결과는도 5에 도시되어있다.

2.5 분자 역학 시뮬레이션

2.5.1 RMSD 값 계산

 

도 6a에 도시 된 바와 같이, 시뮬레이션 후Cistancheside A-CETP 시스템1 0 ns의 경우, RMSD 변동 범위는 ± 0. 1 nm 미만으로 안정적이며 RMSD의 평형 상태는 시스템의 결합 강도가 양호 함을 나타냅니다. 25ns의 시뮬레이션 후, Theaflavin-CETP 시스템의 변동이 크게 느려지기 시작했고, 변동 범위는 또한 ± 0. 1 nm 미만으로 안정되어 평형에 도달했습니다. 탄닌산 B 디메틸 에스테르 -CETP 시스템의 RMSD 값은 평균 RMSD가 0의 평균 RMSD로 1 0 ns 후에 더 적은 변동이 발생했으며, 3 nm의 평균 RMSD는 0.1 nm 미만으로 안정되어 평형에 도달했습니다. 또한,이 연구는 또한 리간드의 RMSD 값을 계산했습니다.
그림에서 볼 수 있듯이 Theaflavin-CETP는 시뮬레이션의 초기 단계에서 안정적인 상태에 있었지만Cistanche A-CETP그리고 탄산 B 디메틸 에스테르 -CETP는 빠른 변동 기간 후에 신속하게 안정화되었다. 이 차이는 다른 분자 구성 및 결합 공동의 상호 작용력의 차이에 의해 야기 될 수있다. 세 가지는 일반적으로 평형 상태입니다.

 

2.5.2 RMSF 값 다른 약물 분자 및 CETP의 복잡한 시스템을 기반으로 한 값 계산

단백질, 본 연구는 각 그룹의 단백질 아미노산 잔기의 RMSF 값을 계산했다. 도 6B에서 알 수있는 바와 같이, CETP에 작용하는 3 개의 소분자 화합물의 주요 잔기의 RMSF 값은 비교적 낮은 수준이며, 평균 값은 약 0. 단백질.

 

2.5.3 SASA 값 계산

도 6C에서 알 수 있듯이, 0-15 NS 주변 시뮬레이션의 초기 단계에서 Cistanche A-CETP 및 Theaflavin-CETP의 두 가지 복합체의 SASA는 빠르게 감소했으며, 이는 리간드의 빠른 결합을 직관적으로 나타내며, 용매에 노출 된 단백질 표면의 면적은 결합 거동에 의해 감소된다. SASA의 감소는 리간드가 단백질의 활성 부위에 단단히 결합되어 있으며, 결합 포켓의 구조적 변화 또는 단백질의 형태 적 변화를 동반 할 수 있음을 추론 할 수있다. 시뮬레이션이 계속됨에 따라, 단백질 및 리간드의 원자의 일반적인 롤링 운동으로 인해, SASA는 시뮬레이션의 중간 단계에서 어느 정도 증가했으며,이 단계에서 둘 사이의 결합이 약화 된 것으로 추측된다. 이것은 단백질 형태 교란으로 인한 단계적 안정성 감소로 인한 것일 수 있습니다. 그 후 SASA는 3 단계에 들어가 시뮬레이션이 끝날 때까지 빠르게 감소했습니다. Salvianolic acid b dimethyl 에스테르 -CETP 그룹의 복합체의 SASA는 전체 과정에서 감소하고 약 40ns 후에 안정적인 상태로 들어갔다.

 

2.5.4 2 차 구조 형태 분석

도 7에 도시 된 바와 같이, 3 개의 복합체 그룹에서 단백질의 -헬릭스 함량 비율이 가장 안정적이며, 명백한 증가 또는 감소는 관찰되지 않는다. Cistancheside A -CETP에서, 시트 함량이 감소하고 코일이 0-25 ns의 단계에서 코일이 증가하고 25ns 후에 증가 및 감소 변화가 회복된다는 것을 명확하게 관찰 할 수 있습니다. Theaflavin -CETP에서, 더 명백한 변화는 주로 -Turn과 Coil의 상호 변환에 나타납니다. 탄닌 산 B 디메틸 에스테르 -CETP에서, 주요 변화는 -시트의 감소와 코일의 증가이다. 단백질 2 차 구조 함량의 변화는 주로 결합 부위 근처의 아미노산의 유형에 의해 영향을 받는다. 상이한 복합체에서 리간드 분자의 상이한 특정 위치와 상호 작용력의 상이한 유형 및 강도로 인해, 각 그룹의 단백질 형태도 다르다. 일반적으로, 각 그룹에서 단백질 2 차 구조의 함량은 명백한 변화를 가지고 있으며, 이는 리간드의 단단한 결합과 밀접한 관련이있다.

 

3 토론

혈액 지질은 혈장의 중성 지방과 지질의 일반적인 용어입니다. 의 균형혈액 지질 대사세포와 유기체의 생명 활동을 유지하는 데 중요합니다. 비정상적인 혈액 지질 대사는 심혈관 및 뇌 혈관 질환, 신경 퇴행성 질환 및 종양의 발생과 밀접한 관련이 있습니다 [12-13]. 한약에서 이상 지질 혈증의 인식 및 치료는 오랫동안 기록되어 왔습니다. 한약은 풍부한 자원, 다양한 구조, 부작용이 거의없고 저렴한 가격의 장점을 가지고 있습니다. 지질 이상을 조절하는 데 좋은 영향을 미치며 국내외의 기본 연구 및 임상 응용 분야에서 널리 인식되어 왔습니다 [14-16].
규제에 사용할 수있는 중국 약초 구성 요소의 소분자 선별이상 지질 혈증 치료고 처리량 중 한약 단량체 데이터베이스에서 실용적으로 중요합니다. 가상 스크리닝 기술 및 분자 역학 시뮬레이션 기술은 현재 한약 연구에서 가장 중요한 기술 중 하나이며 대규모로 약물 분자를 스크리닝 할 수 있습니다 [17]. CETP는 혈액 순환에서 지질 대사 및 RCT 과정에 관여하는 중요한 조절 효소이다. 이 연구는 CETP 단백질의 기능과 역할에 중점을 둡니다. 가상 스크리닝 연구를 통해, CETP 단백질에 대한 친화력을 갖는 19 개의 후보 리간드가 얻어졌다. 후보 리간드의 골격 다양성은 클러스터 분석에 의해 검증되었고, 결합 모드 분석을 위해 상위 3 리간드 소분자를 선택 하였다. 리간드와 수용체 사이의 소수성 상호 작용, π-π 적층 및 소금 교량은 단백질 리간드의 강한 친화력을 유지하는 데 중요한 역할을한다. 이 연구는 또한 MD 시뮬레이션을 통해 3 개의 후보 단백질-리간드 복합체의 안정성을 탐구했다. 결과는 상위 3 개의 단백질-리간드 복합체의 RMSD, RMSF 및 SASA 그래프가 변동 후 안정적 인 경향이 있었고, 변동 진폭은 작다는 것을 보여 주었다. 단백질의 2 차 구조 함량의 명백한 변화는 또한 단백질 리간드의 밀접한 결합을 나타냈다. 따라서, 이들은 CETP 단백질에 대한 친화력이 높은 소분자 억제제의 잠재적 후보로 간주된다.

 

 

Cistanche A는 페닐 에탄올 글리코 시드 화합물로, 주로 Cistanche 및 Rehmannia와 같은 전통적인 중국 의약품에서 발견됩니다. Cistanche의 질량 분율은 {{{0}}. 02%-0. 44%이며, 이는 주요 화합물이며 Rehmannia의 질량 분율은 0.02%-0. 07%입니다.

Shimoda et al. [19] Cistanche 추출물은식이 유발 고 콜레스테롤 혈증 마우스에서 콜레스테롤 수송 및 대사 관련 분자의 mRNA 발현에 영향을 줄 수 있으며 콜레스테롤 저하 활성을 보여줍니다. Theaflavins는 홍차의 발효 과정에서 형성된 독특한 성분이며 홍차의 함량은 0. 3% -1. 고형물의 5%입니다 [20]. 무작위 대조 연구에 따르면 Teaflavins가 풍부한 차 추출물은 저숙 한 지방식이 요법의 효과적인 보조제이며 내성이 우수한 고 콜레스테롤 혈증이있는 성인의 LDLC 수준을 감소시킬 수 있습니다 [21]. Salvianolic acid b dimethyl ester는 Salvia miltiorrhiza에서 추출한 지방 가용성 성분이며 Salvianolic acid B의 디메틸 에스테르 유도체입니다. Salvia miltiorrhiza에서 두 가지의 함량은 약 20 : 1이므로 Salvianolic acid b dimethyl 에스테르는 Salvia milvia milvia miltiorrhiza의 미량 화학 성분입니다. 이전의 연구에 따르면 살비아놀 산 B 디메틸 에스테르는 유사한 산화 방지제, 자유 라디칼 소거 및 항-부정맥 적 약리학 적 활성이 Salvianololic acid b [22-23]을 보여 주었다. 따라서, 천연 소분자 화합물 Cistanche Deserticola A, Theaflavins 및 Salvianolic Acid B dimethyl ester는이 연구에서 스크리닝 된 가상 스크리닝 및 분자 역학 시뮬레이션에 의해 스크리닝 된 Salvianolic Acid B Dimethyl Ester가 CETP 단백질 억제제 리드 화합물의 발견 및 최적화에 사용될 수있을뿐만 아니라, 전통적인 중국의 중국어 치료의 작용 과정을 더 잘 이해할 수있을뿐만 아니라, 분자-규정의 역할을 더 잘 이해할 수있다. 주요 화합물, 이러한 전통적인 중국약 의약품을 요약하고 분석하고 전통 중국 의약의 전체적 관점 및 증후군 차별화 이론과 결합하여 전통 중국 의약 처방을 공식화합니다. 또한,이 연구에서 이소 스파 파스타 사이드, 디오스 민 및 베시 닌 -2과 같은 다른 CETP 단백질 억제제는이 연구에서 가상 스크리닝을 통해 얻은 -2뿐만 아니라 Forsythia, Wild Chrysanthemum 및 Rutaecarpa와 같은 천연 화합물이 도출되는 전통적인 중국 의약품을 추가로 연구하고 검증 할 수 있습니다.