면역 강화 활동에 대한 야생 재배 Cistanche와 인공 재배 Cistanche의 차이점은 무엇입니까?

연락처: 오드리 후audrey.hu@wecistanche.com

자오빙; 양시우메이; 우다오청; 바쉐리; 리 콴샤오; 탄야차오; 장 에일리안

추상적인:

목적:야생 시스탄체와 인공재배 시스탄체의 시스탄체 다당류(이하 각각 WCDPS & CCDPS)의 면역 강화 효과를 비교합니다.

행동 양식:WCDPS 및 CCDPS 및 오브알부민(OVA)의 상이한 용량(저, 중 및 고)을 ICR 마우스, OVA-특이적 항체 IgG로 피하 면역화시키고, 항체 서브타입 IgG1 및 IgG2a를 ELISA 및 MTT 방법에 의해 검출하였다. OVA 특이적 림프구 증식 활성, CD4 플러스 T 세포 및 CD8 플러스 T 세포의 발현 수준을 검출하기 위한 유세포 분석.

결과:WCDPS와 CCDPS는 모두 OVA 특이적 항체 IgG와 항체 유형화 IgG1 및 IgG2a의 발현 수준을 상당히 증가시킬 수 있습니다(P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS 및 CCDPS는 또한 CD4 + T 및 CD8 + T 세포의 비율을 상당히 증가시킬 수 있습니다.<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS 및 CCDPS는 면역된 마우스의 체중에 영향을 미치지 않았습니다.

결론:WCDSP와 CCDPS는 모두 OVA 특이적 체액성 및 세포성 면역 반응을 크게 향상시킬 수 있으며 둘 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없으며 안전성이 좋습니다.

키워드: cistanche; 시스탄체의 다당류; 오브알부민; 보조제

Cistanche (C. Deserticola. YC Ma),Cunyun 및 Dayun으로도 알려져 있으며 수년 동안 Lydanaceae의 기생 초본 식물입니다. 귀하고 귀한 한약재입니다. 주성분은 시스탄체에서 추출한 다당류, 시스탄체 페닐에타노이드 배당체 화합물, 유기산, 알칼로이드 등⑷이 있으며, 에센스와 혈액에 영양을 공급하고 양을 보하고 신장을 튼튼하게 하며 노화방지⑸ 등의 복합적인 기능을 한다. 시스탄치는 매우 높은 약용가치로 인해 야생종의 남획이 멸종 위기에 처해 있으며 인공재배에 성공하였다. 국내외 연구자들은 야생 시스탄치와 인공재배 시스탄치의 화학성분 및 유효성분에 대해 많은 연구를 해왔지만, 야생 및 재배 시스탄치 다당류(WCDPS/CCDPS) 보조제 활성의 비교에 대한 보고는 거의 없다. . 많은 연구에서 보조제인 시스탄치의 식물 다당류가 신체의 면역 반응을 조절할 수 있음이 밝혀졌습니다. 많은 연구자들이 한약재를 백신 보조제로 사용했고 좋은 진전을 보였다"고 말했다.

본 연구는 선행연구(6)를 바탕으로면역 강화Xinjiang WCDPS 및 CCDPS의 활동. 주로 마우스 면역 실험을 통해 ICR 마우스에서 다양한 용량의 WCDPS와 CCDPS를 OVA로 피하 면역시켰고 체액 수준에 미치는 영향면역및 면역화 후 OVA에 의해 유도된 세포 면역을 시험하였다. 비교하다무럭무럭 자라다그리고인공 재배 시스탄체다당류 감귤류에 함유된 다당류의 면역 강화 활성은 신장에서 인공적으로 재배된 씨스탄체의 더 나은 개발 및 활용을 위한 참고 자료가 될 수 있습니다.

재료 및 방법

실험 재료:

cistanche 및 재배 cistanche(시판 가능)를 격렬하게 재배합니다. RPMI 1640 배양 배지는 GIBCO에서 구입했습니다. 소태아 혈청은 Israel Bioind에서 구입했습니다. 유세포 분석 항체: PE 래트-항 마우스 CD3, APC 래트-항 마우스 CD4, FITC 래트-항 마우스 CD8a는 American BD company에서 구입했습니다. 계란 흰자 단백질(Ovalbumin, OVA) Sigma 제품, 양고추냉이 과산화물 표지 염소 항마우스 IgG, IgG1 및 IgG2a는 미국 Southbiotech에서 구입했습니다. 다른 실험용 화학 시약은 모두 국내 분석 시약입니다.

실험 동물:

깨끗한 등급의 암컷 ICR 마우스(6-8주, 18-22g)는 Xinjiang Medical University의 Experimental Animal Center에서 구입했습니다. 동물은 우리 연구실의 동물실에 보관되었으며 동물이 적응된 지 7일 후에 실험을 시작하였다.

WCDPS 및 CCDPS의 준비:

참고 문헌 [17]은 물 추출 및 알코올 침전 방법을 사용합니다. 간단한 단계는 다음과 같습니다. 건조한 신장 재배 및 야생 시스탄체 분말을 가지고 1시간 동안 초음파에 석유 젤리 및 무수 에탄올 부피의 10배를 추가합니다. 흡인여과 후 약의 잔류물을 그대로 두고 건조시킨 후 증류수 37T 초음파의 10배를 가하고 10분 동안 4 000 r/min으로 원심분리하고 상층액을 합하고 회전증발 농축하고 다음과 같이 밤새 침전시킨다. 술; 진공 여과 및 건조 후 조 추출물 분말을 얻습니다. Savage method ⑻는 WCDPS와 CCDPS에서 단백질을 제거합니다. 양파-황산법으로 측정한 WCDPS와 CCDPS의 cistanche 다당류 함량은 각각 76.82%와 59.58%였다.

마우스 면역화 및 혈청 수집:

{{0}}주령 ICR 암컷 마우스를 실험 동물 모델로 사용했습니다. 실험은 0.9% NaCl, OVA 10jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 순, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 순. 예방접종 전에 0.9% NaCl로 녹이고 2주 간격으로 마우스를 피하로 2회 면역합니다. 예방접종 전에 혈액을 채취하고 혈청-80Y는 나중에 사용하기 위해 준비하고 보관합니다.

WCDPS와 CCDPS가 쥐의 성장에 미치는 영향:

WCDPS와 CCDPS가 마우스의 성장에 미치는 영향을 관찰하기 위해 초기 면역 전 0일, 면역 후 14일 및 21일에 각 그룹의 마우스 무게를 측정했습니다.

WCDPS 및 CCDPS 면역화 후 마우스 혈청 항체 IgG의 검출 및 타이핑:

간접 ELISA 방법을 사용하여 혈청 항체를 결정했습니다. ELISA 플레이트를 2.5 jig/ml OVA로 코팅, 4Y 밤새; PBST로 3회 세척한 다음 5% 무지방 분유 37L를 첨가하여 1시간 동안 차단; PBST로 3회 세척하고 각 군에서 면역 후 마우스에 1차 항체를 첨가한 혈청, 1차 항체 희석 비율은 1:100, 웰당 100 환, 37Tl h; PBST로 3회 세척한 후 이차 항체를 추가합니다: HRP 37로 표지된 염소 항-마우스 IgG, IgG1, IgG2a(1:{16}}) 드래곤을 1시간 동안 인큐베이션합니다. PBST로 4회 세척한 후 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액을 추가하여 15분 동안 빛을 피하십시오. 각 well에 50을 넣어 2 mol/L H2SO4로 반응을 멈추게 하고 A45O/655 값을 측정한다. 각 그룹의 항체 수준을 비교합니다.

WCDPS 및 CCDPS 면역화 후 마우스 비장 림프구 증식의 검출:

MTT 방법을 사용하여 CCDPS 및 WCDPS로 면역화된 마우스의 비장에서 림프구의 증식을 검출하였다. 초기 면역 21일 후에 마우스의 비장을 무균 조건에서 분리하고 비장 세포를 1% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지로 희석하여 단일 세포를 만듭니다. 현탁액, 계수 및 세포 조정(r cells/ml를 96-웰 세포 배양 플레이트에 펼친 후 OVA(최종 농도 10 |xg/ml) 및 ConA(최종 농도 5 pig/ml)를 각각 추가합니다. 빈 세포 대조군과 빈 혈청을 설정하고 자극합니다. 37Y cell incubator에 48시간 동안 넣고 각 well에 20 MTT를 넣고 37^ 4시간 동안 계속 incubate 하고 각 well에 100|±1 DMSO를 넣어 녹여 심장을 시험한다. /63.값, 각 마우스 그룹의 자극 지수(SI)를 계산합니다.

WCDPS 및 CCDPS 면역화 후 CD3 플러스 T 세포에서 CD4 및 CD8의 발현:

CD3 + T 세포의 표면에서 CD4 + T 및 CD8*T 세포의 발현을 검출하기 위해 유세포 분석을 사용했습니다. 1차 면역 21일 후에 마우스 비장을 무균 조건에서 분리하고, 비장을 10% FBS를 포함하는 RPMI 164{14}} 배지로 처리했습니다. 단일 세포 현탁액을 준비하고 세포 수를 계산하고 1x106 cells/sample로 조정하고 CD3 plus T 세포의 표면에 CD4 및 CD8 염색을 수행하고 실온에서 25분 동안 빛으로부터 보호하고 10 ml의 시료를 사용합니다. 0.5% FBS를 포함하는 인산염 완충 용액(인산염 완충 용액). 식염수, PBS) 1 200 r/min 7분 1회 세척, 250jil PBS 추가, 200 메쉬 구리 메쉬 통과, CD3*T 세포 표면에서 CD4 및 CD8의 발현을 검출하기 위한 유세포 분석.

통계적 방법:

Flowjo 7.6 소프트웨어는 유세포 분석 테스트 결과를 처리합니다. GraphPad Prism 5.0는 데이터 분석에 사용되며, 데이터는 모두 평균 ± 표준편차를 기준으로 합니다. Student 및 test를 사용하여 실험 그룹 간의 데이터를 비교합니다. 피<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

결과

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. OVA-특이적 항체 IgG에 대한 WCDPS 및 CCDPS의 효과: 면역화 14일 및 21일 후 혈청에서 OVA-특이적 항체 IgG의 발현을 검출하기 위해 WCDPS 및 CCDPS를 OVA로 피하 면역화시켰다. 결과는 도 1에 나타나 있으며, WCDPS 및 CCDPS는 용량 의존적 방식으로 혈청에서 항체 IgG의 발현을 촉진하였고; OVA + CCDPS 50 |xg와 비교하여 OVA + WCDPS 50 p,g는 OVA + CCDPS 50 |xg에 비해 OVA 특이적 항체를 유의하게 촉진할 수 있습니다. IgG의 발현(F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. OVA 특이적 항체형에 대한 WCDPS 및 CCDPS의 효과: 면역화 21일 후 혈청에서 OVA 특이적 항체형 IgG1 및 IgG2a의 발현이 검출되었다. 그 결과를 그림 2에 나타내었다. OVA-WCDPS 50 jig 및 OVA-WCDPS 100 |xg Mumu는 OVA 단독 투여군보다 혈청 내 항체 IgG2a의 발현을 유의하게 촉진시켰다(P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. WCDPS와 CCDPS가 마우스 OVA 특이적 림프구 증식에 미치는 영향: WCDPS와 CCDPS가 비장 림프구에 미치는 영향을 알아보기 위해 cistanche의 다당류를 OVA로 피하 면역시키고 면역 21일 후 비장 세포를 분리하였다. , 그리고 MTT 방법을 사용하여 OVA-특이적 림프구 증식을 촉진합니다. 결과는 그림 3에 나와 있습니다. WCDPS 및 CCDPS는 용량 의존적 방식으로 OVA 특이적 림프구 증식을 향상시켰습니다. WCDPS 및 CCDPS와 OVA 그룹의 조합은 OVA 그룹 단독에 비해 OVA 특이적 림프구 증식을 유의하게 촉진할 수 있습니다. 림프구 증식(P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. CD3 + CD4 + T 및 CD3 + CD8 + T 세포에 대한 WCDPS 및 CCDPS의 효과: WCDPS 및 CCDPS가 OVA로 피하 면역화되고 21일 후, CD3 + T 세포에서 CD4 및 CD8의 발현이 유세포 분석에 의해 검출되었습니다. , 도 4A에 도시된 바와 같이, OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 jig 및 OVA-WCDPS 100이 CD3 + CD4 + T 세포의 증식을 유의하게 촉진할 수 있음을 나타낸다(P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

논의

많은 연구에서 한약재가 면역조절 기능을 갖고 있음이 밝혀졌으며 "Da], 한약재인 cistanche의 다당류를 면역보강제로 사용할 수 있다는 많은 보고가 있다"3], 본 연구에서 선별한 신강 사막고기는 신강 고유의 약재이며 야생종은 멸종 위기에 처해 있으며 약용 가치가 더 높기 때문에 약용 식물 자원의 개발 및 활용을 위해 재배 종을 재배하는 것이 특히 중요합니다. . 현재 시장에 나와 있는 새로운 백신은 항원 특이성은 좋지만 면역원성은 좋지 않습니다. cistanche의 식물성 다당류가 이러한 결핍을 보충할 수 있습니다. 우리 나라는 한약 연구에 큰 이점이 있습니다. 우리는 천연 한약재에서 백신 보조제를 선별합니다. 높은 실현 가능성. 연구에 따르면 cistanche의 한방 다당류는 cistanche의 Ganoderma polysaccharides, cistanche의 Radixisatidis polysaccharides, cistanche koji의 Poria cocos polysaccharides, cistanche의 이눌린 다당류 등과 같이 특이적 면역 및 비특이적 면역에 대해 다양한 조절 수준을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 백신의 면역 효과를 향상시킬 수 있습니다.

시스탄체에 대한 수요가 급격히 증가함에 따라 그 야생종들이 멸종되고 현재 우리나라에서 멸종위기 및 보호식물로 지정되어 있습니다. 사막의 Caulis Carlsbad 인공조림 성공을 바탕으로 야생종을 재배종으로 대체할 전망이다. 본 실험에서는 야생에서 재배된 시스탄치와 인공적으로 재배된 시스탄치 다당류를 OVA 보조제로 사용하여 생체 내 마우스 면역 실험을 수행하였다. 다양한 지표를 테스트하여 야생 및 재배 cistanche의 면역 효과를 초기에 평가하여 Xinjiang에서 재배 cistanche의 효과적인 사용에 대한 참조를 제공했습니다.

자연재배 시스탠치와 인공재배의 안전성을 이해하기 위해시탕슈 당류cistanche에서 생체 내 동물 면역 실험에서 생쥐의 외관 특성을 관찰한 결과, 생쥐는 면역 후 설사, 발모 또는 눈물이 없으며 활동과 호흡이 정상이며 근육 경련이 없음을 발견했습니다. 장애 현상으로 인해 각 군에서 마우스의 체중에는 유의한 차이가 없었으며, 이는 WCDPS 및 CCDPS 면역이 마우스의 성장에 영향을 미치지 않고 어느 정도의 안전성을 가짐을 나타낸다. 항체 IgG 및 유형 검사 결과는 다음을 보여줍니다. WCDPS 및 CCDPS는 OVA와 공동 면역화한 후 OVA 특이적 항체 IgG의 발현을 유의하게 증가시킬 수 있으며 효과는 알루미늄 보조제와 동등합니다. 그것은 OVA 특이적 항체 유형 IgG2a 및 IgG1의 발현을 유의하게 향상시킬 수 있으며, 시스탄치로부터의 다당류가 Th1 및 Th2 면역 반응을 동시에 향상시키는 것을 보여주며, WCDPS와 CCDPS 사이에는 유의한 차이가 없습니다. 항체형 IgG2a의 결과 WCDPS 및 CCDPS 및 OVA 동시 면역 그룹이 알루미늄 보조제 그룹과 비교하여 IgG2a의 발현을 유의하게 향상시킬 수 있음을 발견했습니다. 알루미늄 보조제는 T 세포 발현 촉진에 약하여 WCDPS 및 CCDPS가 사용됨을 증명합니다 보조제로서 세포 면역을 촉진하는 능력은 알루미늄 보조제보다 훨씬 높습니다.

MTT법으로 림프구 증식을 검출한 결과, 각 군 마우스의 비장세포가 OVA에 의해 자극을 받는 것으로 나타났다. WCDPS 및 OVA와 결합된 CCDPS에서 림프구 증식의 자극 지수(SI)는 OVA 단독 면역 그룹에서보다 유의하게 더 높았다. OVA- WCDPS 50 Ah 및 OVA-CCDPS 50 jig 그룹의 자극 지수는 알루미늄 보조제 그룹의 자극 지수보다 유의하게 높았습니다. 이는 OVA 그룹과 결합된 WCDPS 및 CCDPS가 OVA 그룹 및 알루미늄 보조제 그룹과 비교하여 OVA 특이적 림프구의 증식을 유의하게 증가시킬 수 있음을 나타냅니다.

T 림프구의 다른 하위 그룹이 있습니다. CD3는 모든 T 림프구의 표면 분자입니다. 다른 표현형에 따라 CD8 플러스 T 세포와 CD4 T 세포로 나눌 수 있습니다. CD4 플러스 분자는 활성화 후 헬퍼(Th) 세포로 주로 사용되는 MHC fl 분자의 작용하에 형성될 수 있습니다. CD8 플러스 분자는 MHC I 분자의 작용하에 형성되어야 합니다. 활성화 후에는 바이러스 감염 및 종양 면역에 대한 면역에 중요한 역할을 하는 킬러(TC 또는 CTL) 세포가 됩니다. 3". 유세포 분석은 CD3PD4 + T 및 CD3 + CD8 + T 세포 발현을 검출하며, 결과는 WCDPS 및 CCDPS가 특정 용량 범위 내에서 CD4 + T 및 CD8 + T 세포의 증식을 유의하게 촉진할 수 있음을 보여줍니다. 동일한 용량에서 WCDPS와 CCDPS의 차이 CCDPS와 OVA의 조합은 CD3 + CD4 + T 및 CD3 + CD8 + T 세포의 발현을 자극할 수 있으며 두 효과는 동일합니다.

요약하면, WCDPS와 CCDPS는 보조제로 안전합니다. OVA로 면역된 후 특정 체액성 면역과 세포성 면역을 동시에 향상시킬 수 있습니다. 알루미늄 보조제에 비해 WCDPS와 CCDPS가 세포면역증강에 더 좋은 효과를 보였고 두 다당류의 cistanche의 강화효과에는 차이가 없었다. 이러한 연구 결과는 신장에서 인공적으로 재배된 시스탄치 다당류에 대한 재료 참조를 제공하고 신장 사막에서 안전하고 효율적인 면역 보조제를 스크리닝하기 위한 재료 기반을 제공합니다.시스탄체.

참고문헌

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, et al. 뉴캐슬병 백신을 접종한 닭에서 Atractylodis macrocephalus Koidz의 다당류의 면역 보조제 반응(ND) [J]. 탄수화물 고분자, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. 탄수화물 팝. 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W, et al. Pleurotus ferulate water 추출물은 TLR4 신호 전달 경로를 통해 쥐 골수 유래 수지상 세포의 성숙과 기능을 향상시킵니다[J]. 백신, 2015, 33(16) : 1923-1933. DOI: 10.1016/j. 백신.2015.02. 063.

[3]Zhao H, Luo Y, Lu C, et al. 장 점막 면역 반응은 생쥐에서 Ganoderma polysaccharide의 면역 조절 활성을 유발할 수 있습니다[ J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.