염증과 신장 질환을 치료하기 위한 Cistanche: Cystinopathy에서 신장 침범에서 염증의 병원성 역할의 원인은 무엇입니까?
Mar 13, 2022
연락하다:joanna.jia@wecistanche.com
갈렉틴{0}}과 시스티노신 간의 상호작용은 시스틴증의 신장 침범에서 염증의 병원성 역할을 밝혀냅니다.
타티아나 로비1,2 외
염증많은 장애의 발병기전에 관여합니다. 그러나 기본 메커니즘은 종종 알려져 있지 않습니다. 여기에서 우리는 여부를 테스트합니다.시스틴증, 관여하는 단백질시스틴증, 갈렉틴의 중요한 조절자-3, b-갈락토시다아제 결합 단백질 패밀리의 구성원, 동안염증. 시스틴증리소좀 축적 장애이며 시스틴증의 도처에 나타나는 발현에도 불구하고,신장질병의 영향을 받는 주요 기관입니다.시스틴증갈렉틴{0}}의 리소좀 국소화 및 분해를 향상시키는 것으로 밝혀졌습니다. Ctns에서–/–쥐, 쥐의 모델시스틴증, 갈렉틴-3은신장. 시스틴증 마우스에서 갈렉틴{0}}이 없으면 병적 신장 기능과 구조가 개선되고 Ctns의 신장에서 대식세포/단핵구 침윤이 감소합니다.–/–갈3–/–Ctns와 비교한 마우스–/– 쥐. 이 데이터는 갈렉틴{0}}이염증에 관여신장시스틴증의 질병 진행. 또한 갈렉틴{0}}은 단핵구/대식세포의 모집을 자극하는 염증 유발성 사이토카인인 단핵구화학적 유인 단백질-1과 상호작용하는 것으로 밝혀졌으며 Ctns–/– 마우스의 혈청에서 유의하게 증가하는 것으로 나타났습니다. 그리고 또한 환자시스틴증. 따라서 우리의 연구 결과는 염증에서 시스틴증과 갈렉틴{0}} 상호작용의 새로운 역할을 강조하고 이에 대한 추가적인 기계론적 설명을 제공합니다.신장시스틴증의 질병. 이로 인해 신약 표적의 식별이 지연될 수 있습니다.시스틴증진행.
키워드:만성 신장 질환; 시스틴증; 갈렉틴-3;염증; 단핵구 화학 유인 단백질–1
cistanche는 만성 신장 질환과 시스틴증을 치료할 수 있습니다.
염증의 근본 원인은 산화질소가 염증 세포의 생성을 유발할 수 있다는 것입니다.시스탄체귀중한 한약재입니다. 활성 성분은 산화질소의 분비를 억제할 수 있으며 염증 및 신장 질환을 예방 및 치료하는 역할을 합니다.
번역문
치료에도 불구하고 환자는 여전히 말기 신부전으로 진행됩니다. 이 연구에서 우리는시스틴증그 결과 갈렉틴-3(Gal{1}}) 리소좀 분해가 손상되어염증그리고 진행만성 신장 질환안에시스틴증. 이러한 발견은 다음과 같은 환자에서 신장 변성을 제한하거나 지연시킬 수 있는 잠재적인 치료 표적에 대한 새로운 시각을 열어줍니다.시스틴증. 따라서 비스테로이드성 항염증제 또는 인도메타신과 같은 항염증제 및 Gal{1}} 억제제는 시스틴증의 신장 병인을 개선할 수 있습니다.
염증부상이나 감염에 대한 유기체의 정상적인 급성 반응이며,1그러나 만성염증조직 손상과 관련이 있습니다. 당뇨병과 같은 만성질환의 경우 손상된 조직이 면역체계를 활성화시켜 지속적인 염증반응을 일으키고 결국에는 조직이 퇴화하게 된다.2 사이토카인은염증활성화하거나 해결할 수 있습니다.염증process.3 환자에서만성 신장 질환(CKD), 사이토카인의 혈장 농도 상승(인터류킨[IL]{0}} 및 종양 괴사 인자-a) 및염증마커(C-반응성 단백질, IL{1}}, 히알루로난 및 네오프테린)는 말기 신장 질환으로의 진행과 관련이 있습니다.4 염증 반응을 유발하는 특정 매개체를 이해하면 퇴행성 손상을 예방하기 위한 적절한 약물 표적의 발견이 용이해집니다. .
시스틴증리소좀 축적 장애 계열에 속하는 상염색체 열성 대사 질환으로 모든 장기에 시스틴이 축적되는 것이 특징입니다.5 에 결함이 있는 유전자시스틴증, CTNS는 리소좀 시스틴/양성자 공동 수송체인 시스틴증을 암호화합니다.6,7 CTNS는 유비쿼터스로 표현되지만,신장가 있는 사람에게 영향을 미치는 첫 번째 기관입니다.시스틴증. 환자는 일반적으로 생후 첫 해에 심각한 체액 및 전해질 장애, 불량한 성장 및 구루병을 특징으로 하는 판코니 증후군을 나타냅니다.8CKD는 이후에 진행되어 말기 신장 질환으로 진행하고신장이식. 모든 조직의 시스틴 축적은 결국 다기관 기능 장애로 이어집니다. 환자는 광 공포증 및 실명, 갑상선 기능 저하증, 성선 기능 저하증, 당뇨병, 근병증 및 중추 신경계 악화를 경험합니다.9 C57BL/6 배경에서 녹아웃 마우스 모델(Ctns–/–) 10은 시스틴증 환자의 신장 표현형을 복제하고,11 뿐만 아니라 각막에 시스틴 결정의 침착12및 갑상선 기능 장애.13
현재 연구에서 우리는 새로운 역할을 밝힙니다.시스틴증안에염증Gal{0}}과의 상호작용을 통해 Gal{1}}은 렉틴 및 b-갈락토사이드 결합 단백질 계열의 구성원입니다. 21 다음을 포함한 여러 생물학적 기능에 관여합니다.염증.22문맥 상에신장질병에서 Gal{0}} 억제는 고알도스테론증, 고혈압 또는 비만 모델에서 전염증성 마커 발현과 신장 섬유증을 감소시키고 사구체 여과율의 감소를 예방하는 것으로 나타났습니다.23–26여기서 우리는 다음과 같은 증거를 제공합니다.시스틴증, 의 부재시스틴증Gal{0}} 과발현으로 이어집니다.신장, 대식세포 침윤 및 CKD 진행을 향상시킵니다. 또한, 우리는 단핵구 화학 유인 단백질–1(MCP-1)을 잠재적 매개체로 식별하여 약물 요법을 위한 새로운 유전자 표적을 밝혀냈습니다. 결과 Gal-3은 탄수화물 인식 도메인을 통해 시스틴증과 상호 작용하여 특정 상호 작용을 식별합니다. 정량적 질량 분석기를 사용하는 파트너, Madin-Darby canine신장(MDCK) 세포는 시스틴증-녹색 FL 형광 단백질(GFP) 융합 단백질을 안정적으로 발현하기 위해 렌티바이러스 구조로 형질도입되었습니다. 이전에 발표된 액포형 Hþ 아데노신 트리포스파타제의 9개 소단위 외에도,19Gal{0}}은 다음과 상호작용하는 단백질 중 하나로 확인되었습니다.시스틴증(그림 1a). 이 상호 작용은 공동 면역 침전에 이어 웨스턴 블로팅에 의해 추가로 확인되었습니다(그림 1b 및 c). 또한 Gal-3과시스틴증단백질의 C-말단 꼬리에 국한된 Gal{0}} 탄수화물 인식 도메인(CRD)에 의해 매개됩니다. 상호 작용은 갈렉틴-탄수화물 상호 작용의 강력한 억제제인 티오디갈락토사이드에 의해 억제되었습니다(그림 1d). 모든 갈렉틴과 마찬가지로 Gal-3은 글리코실화된 단백질에 친화력이 있으므로21 Gal{6}}과의 상호작용은 단백질의 리소좀 내 N-말단 꼬리에 위치한 시스틴증 글리코실화된 부분을 통해 발생하는 것 같습니다.27
시스티노신은 Gal{0}} 리소좀 국소화 및 분해를 향상시킵니다.
와 상호작용할 때 Gal{0}}의 잠재적인 리소좀 위치를 확인하려면시스틴증, 우리는 카텝신 D(리소좀 내 프로테아제)와 같이 Gal{0}}이 프로테이나제 K에 의해 소화로부터 보호되는 반면, 리소좀이 Triton X{1}}로 투과될 때 두 단백질 모두 소화된다는 것을 보여주었습니다(그림 2a 및 보충 그림 S1). 유사한 데이터가 마우스 간에서 분리된 리소좀에서 얻어져 생체 내에서 Gal{4}}의 리소좀 국소화를 확인했습니다(그림 2b 및 c). 검출할 수 있는 신뢰할 수 있는 항체가 없기 때문에시스틴증, 면역 염색을 수행했습니다시스틴증-Gal{1}} 항체가 있는 GFP-발현 MDCK 세포주. 리소좀의 내강에서 Gal-3의 존재를 확인하는 반면 시스틴증-GFP 및 Lamp-2(리소좀 횡단 단백질)는 소포의 막에서만 발견되었습니다(그림 2d).
여부를 조사하기 위해시스티노신Gal{0}} 인신매매에 연루되어 두 사람의 역학을 분석했습니다.시스틴증및 Gal{0}}-야생형(WT) 및 Ctns의 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 이중 색상 살아있는 세포 내부 전반사 FL 형광 현미경을 사용한 양성 소포–/–CTNS-DsRed와 Gal{1}}-GFP를 모두 발현하는 마우스. 우리의 분석은 다음을 확인했습니다시스틴증Gal{0}}은 내부 전반사 FL 형광 현미경 영역(그림 2e)에서 이러한 분자의 유사한 시공간 분포에 의해 검증된 바와 같이 Ctns–/– MEF에서 진정한 colocalization을 거칩니다. WT MEF의 데이터는 유사했습니다(데이터는 표시되지 않음). 더욱이 Gal- 3-GFP로만 형질감염된 MEF를 분석한 결과, CTNS-DsRed( 데이터는 표시되지 않음).
이러한 데이터는 293T 세포에서 확인되었으며, 세포질에서 강력한 GFP 신호가 Gal-3-GFP만을 발현하는 세포에서 관찰된 반면, Gal-3-GFP와 Gal{2}}-GFP를 모두 발현하는 세포에서 관찰되었습니다.시스티노신-DsRed, Gal-3-GFP는 주로 시스틴증-DsRed 발현 리소좀 내에 국한되었습니다(그림 3a). 또한 Gal-3–GFP 단독 또는 Gal- 3–GFP 및 CTNS-DsRed, Gal-3–GFP 및 DsRed로 형질감염된 세포에서 Gal-3 단백질 발현의 정량화 대조군으로서 Gal-3-GFP 단독으로 형질감염되거나 DsRed로 공동 형질감염된 세포와 비교하여 CTNS-DsRed로 공동 형질감염된 세포에서 Gal-3-GFP 단백질이 훨씬 더 적은 것으로 나타났습니다(그림 3b). 종합적으로, 이러한 결과는시스티노신Gal{0}}의 리소좀 국소화 및 분해를 향상시킵니다. 시스티노신은 CMA에 관여하는 것으로 나타났습니다.28 열 충격 70kDa 단백질(Hsc70)은 LAMP2A 의존적 방식으로 막을 가로질러 리소좀 내강으로 기질 단백질의 전개 및 전위를 보조함으로써 CMA에 참여합니다.29,30 Gal{ {8}}은 CMA에 의해 분해되는 것으로 제안되었으며,31 우리는 시스틴증 MEF에서 Hsc70과 관련된 Gal{10}}의 위치를 조사했습니다. 공초점 현미경 분석은 WT(데이터는 표시되지 않음) 및 Ctns 모두에서 Hsc{13}} 양성 구조에서 Gal{12}}–GFP의 공동 국재화를 확인했습니다.–/–세포(그림 3c), Hsc70과 Gal{2}}의 공동 수송을 지원하고 샤페론에 의한 Gal{4}} 인식이 아닌 리소좀 내재화에 결함이 있음을 시사합니다.시스틴증.
Gal{0}}은 Ctns의 신장 염증에 관여합니다.–/–쥐
Gal{0}}의 역할을 연구하려면시스틴증생체 내에서 우리는 두 가지 모두가 부족한 이중 녹아웃 마우스 모델을 생성했습니다.시스티노신및 Gal{0}}(Ctns–/–갈{0}}–/–쥐). WT, Ctns–/–, 갈{0}}–/–마우스를 대조군으로 사용하였다. C57BL/6 Ctns에서–/–생쥐의 경우 생후 10개월 경에 신장 기형이 나타납니다.11 따라서 연구는 8~9개월에 수행되었습니다.신장기형이 감지되기 시작하고 12~15개월에 신장 기형이 진행됩니다. 남성과 여성의 Ctns에서 시스틴 함량이 다른 것으로 나타났기 때문에–/– 신장, 그들은 별도로 분석되었습니다. 두 유전자형 모두에서 시스틴 함량이 나이에 따라 증가하면 Ctns–/– Gal{0}}–/– 생쥐와 Ctns 간에 남성과 여성의 신장에서 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다.–/– 생후 8~9개월 및 12~15개월의 마우스(그림 4a).
혈청 및 소변에서 신장 기능을 평가했으며 WT와 Ctns 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다.–/–생쥐는 8~9개월(데이터는 표시되지 않음), 12~15개월에는 Ctns–/–생쥐는 WT 생쥐와 비교하여 유의하게 더 높은 혈청 크레아티닌과 요소 수준을 보였다. 흥미롭게도 Ctns–/–갈{0}}–/–마우스는 Ctns에 비해 개선된 신장 기능을 나타냄–/–생쥐는 12~15개월에 혈청 크레아티닌(P < 0.{4}}5)과 요소(P < 0.05, 표 1)가 더 낮습니다.
8-~{1}}개월 및 12-~15-개월 생쥐의 조직학적 연구신장섹션에서 Ctns에 심각한 이상이 있음이 밝혀졌습니다.–/– 신장, 세뇨관 위축, 수축된 사구체 및 단핵 침윤을 포함합니다. 신장 섹션의 블라인드 분석은 피질 손상 정도의 범위가 1(보존된 조직 구조)에서 6까지입니다. Ctns에 대한 평균 점수–/–생쥐는 9개월(n=7)에 2.{1}}.36이었고 12~15개월(n=16)에 4.12{7}}.37이었습니다. Ctns의 신장에서–/–갈{0}}–/–같은 연령의 쥐에서 이러한 이상 현상은 훨씬 덜 광범위했습니다. 1.{1}}.11 at 9 months (n=21, P < 0.{15}}5,="" mann-whitney="" t-="" test)="" 및="" 3.{10}}.22="" 12~15개월(n="33," p="">< 0.05,="" mann-whitney="" t-test)(그림="" 4b="" 및="" 보충="" 그림="" s2).="" 또한,="" 관상="" 위축의="" 백분율은="" 모든="" 조직에="" 할당되었으며="" ctns의="">–/–마우스 및 Ctns–/–갈{0}}–/–생쥐는 12~15개월에 각각 66%와 42%였습니다(P=0.01). 또한 Ctns의 현저한 차이–/–및 Ctns–/– 갈{0}}–/– 신장섹션은 Ctns에 단핵 침윤이 거의 없었습니다.–/–갈{0}}–/–반면, Ctns에서는 다량의 침윤물이 일관되게 관찰되었습니다.–/– 신장(그림 4b).
우리는 8-~{1}}개월 된 Ctns에서 조직학적 검사로 관찰된 단핵 침윤물을 특성화했습니다.–/– 신장32 ,33 CD 양성 세포의 정량화는 WT, Gal에서 훨씬 적은 수의 대식세포/단핵구를 나타냈습니다.{11}}–/–, 및 Ctns–/–갈{0}}–/– 신장Ctns에 비해–/– 신장(그림 4c), 조직학적 데이터를 확인합니다(그림 4b).
종합적으로, 이러한 발견은 Gal{0}}이 시스틴증에서 대식세포/단핵구의 모집에 관여한다는 것을 시사합니다.신장그리고 그것의 부재는 Ctns의 신장 질환을 개선합니다.–/–쥐. 따라서 다음과 같이 제안합니다.염증Ctns의 신장 악화에 적어도 부분적으로 책임이 있습니다.–/– 쥐.
Ctns 결핍 신장은 Gal{1}} 과발현을 나타냄
Western blot analysis를 사용하여 Gal{0}} 발현이신장12-개월 이전 Ctns–/–WT 마우스와 비교한 마우스(그림 5a 및 b). Gal{1}}의 이러한 증가된 표현이 Ctns에만 해당되는지 조사하기 위해–/– 신장, 우리는 전사체 및 단백질 수준에서 Gal-3 발현을 정량화했습니다.신장표준 소계 2-단계 신장 절제술로 유도된 CKD가 있는 마우스와 가짜 수술을 받은 동물에서. WT 및 Ctns–/–마우스를 대조군으로 사용하였다. Gal{0}} 전사체는 Ctns–/– 및 가짜 신장에서 유의하게 증가했지만 CKD에서는 크게 증가했습니다.신장WT 마우스와 비교했습니다(그림 5c). 대조적으로, 단백질 수준에서 Gal{1}}은 Ctns에서만 검출되었습니다.–/–신장, Ctns만이–/–신장은 Gal{0}} 단백질을 분해할 수 없습니다(그림 5d). 뮤린에서 Gal-3의 면역형광 염색신장8~9개월에 또한 Ctns에서 Gal-3의 과발현이 나타났습니다.–/– 신장WT와 비교신장(그림 5e). 또한 Gal{1}}은 CD68þ 대식세포와 Ctns의 신장 세포에 의해 발현되었습니다.–/– 신장8~9개월(보충 그림 S4). 전체적으로 이러한 데이터는시스틴증시험관 내에서 입증된 바와 같이(그림 3a 및 b), Ctns에 Gal{1}} 단백질 축적으로 이어짐–/– 신장.
시스티노신이 없으면 Gal{1}} 상향 조절을 통해 혈청 MCP{0}}가 증가합니다.
Gal{0}} 규제염증다른 메커니즘을 통해.34 따라서 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 얻으려면시스틴증, 우리는 12- ~ 15-개월 된 WT, Ctns의 혈청에서 다양한 전염증성 또는 항염증성 사이토카인의 발현을 조사했습니다.–/–, 갈{0}}–/–, 및 Ctns–/–갈{0}}–/–쥐. 6가지 사이토카인 수준은 마우스 세포측정 비드 어레이, MCP{0}}, 인터페론-g, 종양 괴사 인자 및 IL-10, IL{3}} 및 IL-12p70으로 측정되었습니다. MCP-1 발현만이 WT 및 Gal{7}}-/- 마우스 및 Ctns에 비해 Ctns-/- 마우스 혈청에서 유의하게 증가했습니다.–/–갈{0}}–/–MCP{0}} 혈청 수준이 WT 마우스와 비슷했습니다(그림 6a). MCP-1는 다양한 세포 유형에 의해 생성되며 MCP-1의 주요 공급원은 대식세포와 단핵구이며,35 단핵구 및 대식세포의 이동 및 침투를 조절하는 화학 유인 물질로 작용합니다. 대조적으로, 같은 나이에 Gal{5}} 발현은 Ctns–/– 마우스(44.33 9.81 ng/ml; n=5)와 WT 마우스(40.{12} }.41ng/ml, n=7).
Gal-3과 MCP{1}} 사이의 관계는 Gal-3–GFP와 MCP-1–DsRed– 또는 Gal{5}}–을 사용한 공동 면역 침전에 의해 추가로 조사되었습니다. GFP 및 CTNS-DsRed–(양성 대조군)는 293T 세포를 발현합니다. Gal-3과 MCP-1 사이의 상호작용이 관찰되었으며(그림 6b), Gal{12}}에 의한 MCP{11}}의 직접적인 유도를 시사합니다. Gal{16}} CRD의 억제제인 N-Acetyl-D-lactosamine(LacNAc)과의 배양은시스티노신상호작용에서 CRD는 Gal{0}}과 MCP{1}} 사이의 상호작용에 관여하지 않습니다(그림 6c).
이 발견이 인간과 관련이 있는지 평가하기 위해 우리는시스틴증면역억제제 치료를 받지 않았거나 항염증제를 복용하고 있지 않은 사람. Gal{1}} 수준은 건강한 기증자에 비해 시스틴증이 있는 환자의 혈청에서 약간 증가한 것으로 나타났지만 그 차이는 유의하지 않았으며(그림 6e) Ctns에서 얻은 결과를 확인했습니다.–/–쥐. 2명의 환자만이 높은 Gal{1}} 수준(25.34 및 39.54ng/ml)을 보였습니다. 그들은 이상값으로 간주되어 그림 6e에 포함되지 않았습니다. 대조적으로, 인간 MCP{8}}(그림 6d)에 대한 효소 결합 면역흡착 분석법을 사용하면 혈청 MCP{10}} 수치가시스틴증(252.1 - 18.4 pg/ml, n=19, 연령 범위 1-23세) 건강한 대조군과 비교하여 시스테아민 치료에도 불구하고(166.9 -13.5 pg/ml, n=1 0, 연령 범위 8~63세)(P < 0.001).="" 두="" 환자="" 모두에서="" 연령과="" mcp{14}}="" 수준="" 사이에는="" 상관관계가="" 발견되지="">시스틴증및 건강한 기증자(데이터는 표시되지 않음).
시스탄체가지다항염증속성
논의
이 병에 걸린 환자의 모든 조직에 시스틴이 축적된다는 사실에도 불구하고시스틴증, 신장은 손상에 가장 취약한 기관입니다. 따라서 우리는 시스틴 축적이 신장 퇴행의 유일한 원인이 아니라고 믿습니다. 여기서 우리는 새로운 역할에 대해 설명합니다.시스티노신의 규제에염증만성신장질환의 진행에 관여시스틴증. 이 연구는 환자가 시스테아민 치료를 받았음에도 불구하고 말기 신부전으로 발전하는 이유를 설명할 수 있습니다.
시스틴증 분자 파트너에 대한 연구에서 Gal{0}}과의 직접적인 상호작용이 밝혀졌으며 이는 Gal{1}} CRD의 억제제에 의해 억제될 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 Gal-3은 결정 축적과 같은 리소좀 손상 후 리소좀 내강에 위치한 글리칸과 상호작용할 수 있습니다.36 우리 연구에서 Gal{4}}과시스티노신를 발현하는 건강한 세포에서 연구되었습니다.시스티노신따라서 시스테인 또는 시스틴 결정이 축적되지 않습니다. 또한 건강한 세포에서 Gal{0}}과 시스티노신 모두의 과발현은 Gal-3의 세포하 국소화를 수정했으며, 이는 Gal-3만의 과발현과 비교하여 리소좀에 국소화되었습니다. 세포질에 위치했습니다. 이러한 결과는 Gal-3과 시스티노신 사이의 상호작용이 리소좀 손상과 독립적으로 발생하고 시스티노신이 Gal-3 리소좀 국소화에 적극적으로 책임이 있음을 강력하게 시사합니다. 이전에 Gal-3은 Abl 및 Arg, 2 티로신 키나제가 없을 때 리소좀 의존성 단백질 분해를 통해 분해되는 것으로 나타났습니다.31
또한, 우리는시스틴증및 Gal{0}}은 동적 소포 구조에서 공동 국소화되고 함께 시공간 방식으로 동원됩니다.시스티노신이전에는 리소좀 LAMP2A, 유일하게 알려진 CMA 수용체의 인신매매 메커니즘과 관련되어 있습니다.시스틴증.28Gal{0}} 분해는 이전에 CMA에 의해 조정되는 것으로 나타났습니다.31공초점 현미경 분석은 두 Ctns의 Hsc{1}}양성 구조에서 Gal{0}}의 공동 국재화를 확인했습니다.–/– 및 WT 세포는 Hsc70이 막을 가로질러 리소좀 내강으로 기질 단백질의 전위를 도우므로 리소좀에서의 제시 및 CMA에 의한 분해를 위한 Hsc70과 Gal{1}}의 공동 수송을 지원합니다.29,30우리 결과에 대한 가능한 해석은시스티노신분해를 위해 Gal{0}}을 CMA 활성 리소좀으로 운반하고 전달하는 것을 규제합니다.
이 새로운 길의시스티노신Ctns가 결핍된 마우스는신장. 또한 증가된 Gal{0}} mRNA는 Ctns에서 제한적이었습니다.–/–다른 CKD 모델에 비해 신장에서 많은 양의 Gal{0}} 단백질이 Ctns에서만 검출되었습니다.–/– 신장. 이 데이터는 다음과 같은 결론을 강력하게 뒷받침합니다.시스티노신CKD와 같은 스트레스 조건에서 Gal{1}} mRNA의 과발현을 제어할 수 있는 Gal{0}} 단백질의 분해에 관여합니다.
Gal{0}}은 급성 및 만성에서의 역할을 포함하여 여러 생물학적 역할을 합니다.염증단핵구와 대식세포를 유인함으로써.37,38Ctns에서–/– 마우스, 우리는 주로 다음에서 무거운 단핵 침윤물을 관찰했습니다신장앞서 설명한 것처럼,11,39단핵구/대식세포로 특성화되었습니다. 대조적으로, 이중 녹아웃 Ctns의 신장은–/–갈{0}}–/–쥐는 매우 적은 수의 단핵구/대식세포 침윤물을 나타내어 Gal{0}}이염증Ctns의 신장에서–/–쥐. 반복적인 조직 손상의 맥락에서 Gal{0}}은 만성으로의 전환을 유발할 수 있습니다.염증및 섬유증.34이러한 발견과 일치하게, 우리의 데이터는 Gal{0}}이 CKD의 진행에 관여함을 보여줍니다.시스틴증. 실제로 이중 녹아웃 Ctns–/– 갈{0}}–/–쥐가 더 잘 보였다신장Ctns와 비교한 기능 및 구조–/–쥐. 유사하게, Gal{0}} 결핍 마우스는 신장 섬유증이 덜 나타납니다.신장일방적인 요관 폐쇄 후 WT 마우스와 비교하여,40 허혈-재관류 손상을 받은 Gal{0}} 녹아웃 마우스는 허혈-재관류 손상을 받은 WT 마우스와 비교하여 더 나은 신장 기능을 보였습니다.41
혈장 내 Gal{0}} 수준과 CKD 발병 사이의 상관관계가 발견되었지만42 에 의해 영향을 받은 마우스와 인간의 혈청에서는 Gal{2}} 발현의 차이가 관찰되지 않았습니다.시스틴증및 건강한 대조군. 혈청에서 다양한 사이토카인 수준을 측정하여 Ctns에서 MCP{0}}가 크게 증가함을 발견했습니다.–/–마우스, 반면에 Ctns–/–갈{0}}–/–생쥐는 WT 생쥐와 비슷한 수준을 보였다. MCP-1는 혈청에서 방출될 수 있는 사이토카인이며 구배를 형성하여 단핵구와 대식세포를 손상 부위로 유인합니다.35 Ctns 혈청에서 MCP{2}} 증가–/–Ctns와 비교한 마우스–/–갈{0}}–/–생쥐는 시스틴 축적과 무관했습니다.신장시스틴 함량은 두 유전자형에서 유사했습니다. 또한 리소좀 밖으로 시스틴이 빠져나갈 수 있도록 하는 시스테아민 치료에도 불구하고 MCP{0}}가시스틴증건강한 기증자에 비해 이 데이터는시스티노신, 시스틴 축적보다는 혈청의 MCP{0}} 증가에 대한 책임이 있습니다. 또한 Gal{1}}과 MCP{2}} 사이의 직접적인 상호작용을 보여주었는데, 이는 최근 Gordon-Alonso et al.43이 제안했지만 더 이상 연구되지 않았습니다. Gal-3 매개 MCP{6}} 활성화의 메커니즘은 여기에서 연구되지 않았습니다. 인간 MCP{7}}에 신호 펩타이드가 존재한다는 가설이 있습니다. 이 신호 펩타이드는 절단되어 분비를 향상시킬 수 있습니다.44 또한 플라스민은 MCP{10}}의 C-말단을 절단하여 화학유인 물질을 증가시킬 수 있습니다. potency.45 또한, 우리의 데이터와 관련하여 당뇨병성 신증의 마우스 모델에서 MCP{12}}를 억제하면 신장 대식세포 침윤이 방지되고 신장 기능이 개선되었습니다.46,47 In시스틴증, 우리의 데이터는시스티노신Gal{0}}을 증가시켜 MCP{1}} 혈액 동원을 활성화하여 신장 기능을 향상시킵니다.염증그리고 진행만성 신장 질환.
이러한 발견은 다음과 같은 환자에서 신장 변성을 제한하거나 지연시킬 수 있는 잠재적인 치료 표적에 대한 새로운 시각을 열어줍니다.시스틴증. 실제로, 아스피린과 인도메타신과 같은 비스테로이드성 항염증제는 전사를 억제하여 Gal{1}} 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌습니다.48 인도메타신은 실제로시스틴증,49 및 307명의 유럽 시스틴증 환자를 대상으로 한 최근 연구에서는 인도메타신으로 치료한 환자에서 개선된 신장 예후를 보였습니다.50 우리 연구에 비추어 볼 때, 인도메타신 또는 비스테로이드성 항염증제의 사용은시스틴증환자를 재검토할 수 있습니다.
행동 양식
동물 실험
C57BL/6 Ctns–/–마우스는 Antignac 박사(Inserm U1163, Paris, France)가 제공했습니다. C57BL/6 갈렉틴-3 널(Gal-3–/–) 마우스는 Dr. Fu-Tong Liu(University of California, Davis)와 Dr. Jerrold M. Olefsky(University of California, San Diego)에 의해 제공되었습니다. WT, Ctns 생성을 위한 육종 전략–/–, 갈{0}}–/–, Ctns–/– 및 Gal{0}}–/–마우스는 보충 방법에 설명되어 있습니다.
세포주
엉망은 WT 및 Ctns의 신생아 피부 생검에서 생성되었습니다.–/–쥐. MEF, 293T 및 MDCK 유형 II 세포주(ATCC, Manassas, VA)는 10% 소태아혈청 또는 소태아혈청, 100단위/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 성장되었습니다. 및 2mM L-글루타민.
공동 면역 침전 및 질량 분석 분석
단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위해 렌티바이러스 pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE 벡터 백본을 사용하여 MDCK 세포를 형질도입하여 안정적으로 발현시켰다.시스티노신-GFP.51보충 방법에 설명된 대로 공동 면역 침전을 수행했습니다. 공동 면역침전된 단백질은 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분해되었고 이미 기술된 바와 같이 질량 분석법, LTQ Orbitrap에 의해 분석되었습니다.19
Gal-3-GFP 및 MCP-1-DsRed 또는 Gal-3- GFP 및 CTNS-DsRed를 발현하는 293T 세포는 보충 방법에 설명된 대로 공동 면역 침전에 사용되었습니다. 공동 면역 침전된 단백질은 SDS-PAGE로 분석되었으며 Gal-3 결합 MCP-1는 항 DsRed 항체(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)를 사용하여 검출되었습니다.
세포하 분획
C57BL/6 마우스에서 8개의 간을 얻었고 이전에 설명한 대로 준비했습니다. 구배 조건은 기본적으로 원래 간행물에 설명된 것과 동일했습니다.
Gal{0}}–억제제 및 단백질분해효소 K 치료
용해물시스티노신-GFP MDCK 세포 및 Gal-3–GFP 및 CTNS-DsRed 또는 Gal-3–GFP 및 MCP-1–DsRed를 발현하는 293T는 5mM 티오디갈락토사이드 또는 5mM의 N과 함께 또는 없이 배양되었습니다. -아세틸-D-락토사민, 각각 Gal{12}} CRD의 2가지 억제제. 일정한 진탕과 함께 4 - C에서 30분 동안 배양한 후, 용해물을 50ml 항-GFP 마이크로비드와 함께 배양하고 앞서 언급한 대로 면역침전을 수행했습니다. 침전된 단백질은 10% 겔에서 SDS-PAGE로 분해되었습니다.
용해물시스티노신-GFP MDCK 세포 및 마우스 간 리소좀이 풍부한 분획을 2% Triton X-100의 유무에 관계없이 4 - C에서 10분 동안 배양한 다음 2.5mg/ml 및 25mg의 유무에 관계없이 30분 동안 배양했습니다. /ml 단백질분해효소 K. 4 - C에서 5분 동안 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드로 효소 불활성화 후, 단백질은 10% 겔에서 SDS-PAGE에 의해 분해되었습니다.
면역형광 분석
고정 MDCK 세포를 실온에서 2시간 동안 항-Lamp{0}}(OriGeneTechnologies, Rockville, MD) 및 항-Gal{1}} 항체(CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Canada)와 함께 인큐베이션한 후 Alexa Fluor 실온에서 1시간 동안 555 이차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA). 공초점 이미지는 Zeiss LSM 700 현미경(Carl ZeissMicroscopy, Jena, Germany)을 사용하여 촬영했습니다.
Gal-3–GFP 단독, Gal-3–GFP 및 DsRed 또는 Gal{3}}–GFP를 일시적으로 발현하는 293T 세포 및시스티노신-DsRed를 슬라이드에 장착하기 전에 커버슬립에서 배양했습니다. 세포는 Keyence BZ-X700 기기(Keyence Corp., Osaka, Japan)를 사용하여 이미지화되었습니다.
결정된신장섹션을 4 -C에서 항-CD68(BioLegend, San Diego, CA) 또는 항-Gal{3}} 항체(BioLegend)와 함께 밤새 배양한 다음 Alexa Fluor 488 이차 항체(Invitrogen), 1시간 실온에서. Keyence BZ-X700 기기를 사용하여 이미지를 획득했습니다. CD68 발현의 정량화는 보충 방법에 설명되어 있습니다.
Gal{0}}-GFP를 발현하는 MEF를 항-Hsc70 항체(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY)를 사용하여 염색하고 앞서 설명한 대로 영상화했습니다.53
내부 전반사 FL 형광 현미경
WT 및 Ctns–/–Gal-3-GFP를 발현하는 MEF 및 CTNS-DsRed를 4-챔버35- mm 붕규산 바닥 접시(Cellvis, Mountain View, CA)에 시딩했습니다. 배양 2일 후, MEF를 이전에 설명한 대로 내부 전반사 FL 형광 현미경으로 분석했습니다.54및 보충 방법에서. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석했습니다.
Gal{0}} 표현 분석
Gal-3–GFP, Gal-3–GFP 및 DsRed, 또는 Gal-3–GFP 및 CTNS-DsRed를 발현하고 이식된 293T 세포신장단백질분해효소 억제제 칵테일을 포함하는 방사성면역침전 분석 완충액에서 용해되었습니다. 단백질은 4~15% 젤에서 분리되었으며 항-Gal-3(Abcam, Cambridge, UK) 또는 항-글리세르알데히드{3}}인산 탈수소효소(Cell Signaling Technology, Danvers, MA) 항체를 사용하여 밝혀졌습니다. .
신장Precellys 24(Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France)를 사용하여 b-mercaptoethanol을 포함하는 RLT 버퍼에서 균질화되었습니다. RNA를 분리하고 Gal-3-특정 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응을 보충 방법에 설명된 대로 수행했습니다. Gal-3 전사체 발현은 내인성 대조군 18S와 비교하여 비율로 표현하였다. 효소 결합 면역흡착 분석법(Abcam)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 마우스와 인간 혈청에서 Gal{8}} 수준을 감지했습니다.
신장 기능
QuantiChrom Phosphate Assay Kit, Quanti Chrom Creatinine Kit 및 QuantiChrom Urea Assay Kit(BioassaySystems, Hayward, CA)를 사용하여 혈청 및 소변 인산염, 혈청 크레아티닌 및 요소 수준을 추정했습니다. 소변의 단백질 수준은 Pierce BCA 단백질 분석 키트(일리노이주 록포드)를 사용하여 측정되었습니다.
조직학
쥐가 죽임을 당했을 때,신장채취하여 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매하였다. 헤마톡실린과 에오신으로 염색된 섹션은 보충 방법에 설명된 대로 Marie Claire Gubler 박사가 맹검 방식으로 검토했습니다.
시스틴 함량 측정
조직 시스틴 측정은 이전에 설명한 대로 질량 분석법(LC-ESI-MS/MS)에 의해 수행되었습니다.39
표준 신장 절제술 및 가짜 수술
마우스 CKD는 이전에 설명된 표준 소계 2-단계 신장 절제술에 의해 유발되었습니다.55,56가짜 쥐 그룹은 동일한 절차를 거쳤지만 어떤 절단도 하지 않았습니다.신장조직.
혈청 내 사이토카인 수치
마우스 혈청에서 사이토카인 수치를 측정하기 위해, 마우스염증키트 세포측정 비드 어레이(BD Biosciences, San Jose, CA)를 제조업체의 지침에 따라 수행했습니다. 인간 혈청의 MCP{0}} 농도는 MCP{2}}(Abcam, Cambridge, UK)에 대한 효소 결합 면역흡착 분석법을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정했습니다.
통계 분석
값은 평균 - SEM으로 표시됩니다. 결과의 유의성은 Welch의 보정을 사용하여 쌍을 이루지 않은 2-꼬리 t-검정 또는 쌍을 이루지 않은 2-꼬리 t-검정으로 평가했습니다. 3개 이상의 조건에 대한 그룹 비교는 변수의 매개변수 분석으로 수행한 후 쌍대 비교를 위한 Tukey 다중 비교 테스트를 수행했습니다. Mann-Whitney 테스트를 사용하여 조직학적 점수를 비교했습니다. Prism 6 소프트웨어(GraphPad, San Diego, CA)를 사용하여 분석을 수행했습니다. 0.05 미만의 P-값은 유의미한 것으로 간주되었습니다.
연구 승인
마우스 실험은 InstitutionalAnimal Use Committee 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서 인간 조직의 사용은 캘리포니아 대학교 샌디에이고 HumanResearch Protections Program의 승인을 받았습니다.
폭로
SC는 과학 위원회 위원이자 이사회의 위원입니다.시스틴증연구재단. SC는 공동 창립자이자 주주이며 GenStem TherapeuticsInc의 과학 이사회 및 이사회 구성원입니다. 이 계약의 조건은 이해 상충 정책에 따라 캘리포니아 대학교-샌디에고 대학교에서 검토 및 승인했습니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.
Gal 제공{0}}–/–쥐. 기술적인 도움을 준 Lou Devanneaux와 NicholeFlerchinger와 원고를 검토한 Elizabeth Souter에게 감사드립니다. 마우스를 제공한 BDBioscience의 Christopher Alfonso를 인정합니다.염증cytometric bead array와 결과 해석에 도움을 주셨습니다. 이 작업은 국립 보건원에서 RO{0}}DK090058및 R{2}}DK110162,시스틴증연구 재단 및 캘리포니아 재생 의학 연구소(CIRM, CLIN{0}}). TL은 Vaincre Les MaladiesLysosomales의 대학원 펠로우십에 의해 지원됩니다. AB와 JZ는 펠로우십의 지원을 받습니다.시스틴증연구재단. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility는 NINDS(National Institute of Neurological Disorders and Stroke) 보조금 P{0}}NS047101의 지원을 받았습니다.
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