영국의 신경학적 반복 확장 장애 진단을 위한 전체 게놈 시퀀싱: 후향적 진단 정확도 및 전향적 임상 검증 연구

자세한 내용은:ali.ma@wecistanche.com

요약

배경

반복 확장 장애는 약 3000명 중 1명에게 영향을 미치며 짧은 탠덤 DNA 반복의 확장으로 인한 임상적으로 이질적인 질병입니다. 유전자 검사는 종종 유전자좌에 특이적이어서, 특히 이전에 긍정적인 가족력이 없는 소아 환자에서 비정형 임상 증상이 있는 사람들의 진단이 저조합니다. 전체 게놈 시퀀싱은 다른 희귀 유전 질환에 대한 1차 검사로 점점 더 많이 사용되고 있으며, 우리는 다음과 같은 환자 진단에서 그 성능을 평가하는 것을 목표로 했습니다.신경학적반복 확장 장애.

행동 양식

우리는 전체 게놈 시퀀싱의 진단 정확도를 후향적으로 평가하여 다음과 관련된 가장 일반적인 반복 확장 유전자좌를 감지했습니다.신경학적결과(AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT 및 TBP)는신경학적장애; 이전 PCR 테스트 결과를 참조 표준으로 사용했습니다. 반복 확장을 감지하기 위한 전체 게놈 시퀀싱의 임상 정확도는 2013-17년에 영국의 100 000 게놈 프로젝트에 모집된 이전에 유전자 검사를 받았고 진단되지 않은 환자를 대상으로 전향적으로 조사되었습니다.신경학적장애(가족성 또는 초기 발병 형태의 운동실조, 신경병증, 경직성 하반신마비, 치매, 운동 신경 질환,파킨슨병움직임장애, 지적 장애 또는 신경근 장애). 전체 게놈 시퀀싱을 사용하여 반복 확장 호출이 이루어진 경우 PCR을 사용하여 결과를 확인했습니다.

결과

반복 확장을 감지하기 위한 전체 게놈 시퀀싱의 진단 정확도는 이전에 NHS 내에서 4{15}}4명의 환자를 대상으로 수행된 793개의 PCR 테스트에 대해 평가되었습니다. 전체 게놈 시퀀싱은 97·3%의 민감도(95% CI 94·2-99·0) 및 99·6%의 특이성(99·1-99)을 나타내는 221개의 확장 대립형질 중 215개 및 1321개의 비확장 대립형질 중 1316개를 올바르게 분류했습니다. ·9) PCR 검사 결과와 비교했을 때 13개의 질병 관련 유전자좌에 걸쳐. 100 000 게놈 프로젝트의 11 631 환자 샘플에서 전체 게놈 시퀀싱은 81개의 반복 확장을 확인했으며 PCR로도 테스트했습니다. 68은 전체 병원성 범위에서 반복 확장으로 확인되었으며 11개는 비 -병원성 중간 확장 또는 순열, 그리고 2개는 확장되지 않은 반복이었습니다(16% 잘못된 발견 비율).

해석

우리 연구에서 반복 확장의 탐지를 위한 전체 게놈 시퀀싱은 높은 민감도와 특이성을 보였고신경학적이전에 진단되지 않은 환자에서 반복 확장 장애. 이러한 발견은 다음과 같은 환자의 진단을 위해 임상 실험실에서 전체 게놈 시퀀싱의 구현을 지원합니다.신경학적반복 확장 장애와 일치하는 표현.

자금 조달

의료 연구 위원회, 보건 및 사회 복지부, 영국 국립 보건 서비스, 국립 보건 연구소 및 Illumina.

소개

희귀종의 유전적 기초에 대한 이해의 최근 발전에도 불구하고신경학적장애가 있는 환자의 최대 70%가 유전적으로 진단되지 않은 채로 남아 있습니다. 이러한 확장은 약 3000명 중 1명에게 영향을 미치는 것으로 추정되며(부록 1페이지) 헌팅턴병 및 취약 X 증후군을 비롯한 40개 이상의 신경 유전적 장애4의 주요 원인입니다. 반복 확장 장애는 임상 및 유전적으로 이질적이며 반복 확장은 다양한 질병과 연관될 수 있습니다. 예를 들어, C9orf72의 확장은 근위축성 측삭 경화증 또는 전두측두엽 치매로 나타날 수 있습니다.5 다른 유전자좌에서의 반복적인 확장은 또한 유사한 표현형 특징을 생성하여 임상적으로 구별하기 어렵게 만들 수 있습니다. -발현 운동실조,6 및 C9orf72 및 AR에 있는 것들은 모두 운동 뉴런 질환을 유발할 수 있습니다.7,8

반복 확장 장애는 반복적인 짧은 직렬 DNA 염기서열의 증가로 인해 발생하며, 각 장애에 대한 병원성 역치는 유전자좌 특이적입니다. 확장 크기는 30개 미만의 반복(예: CACNA1A)에서 수천 개의 반복 단위(예: FMR1, DMPK, C9orf72 및 FXN, 최대 5kb 크기 확장 가능)까지 다양합니다. 반복 확장은 분자 불안정성을 나타내며, 이는 세대와 조직에 걸쳐 반복 크기의 변화(일반적으로 길이 증가)로 이어질 수 있습니다. 세대.4 반복 확장 장애의 소아 발병은 특정 표현형 징후가 없는 다계통 증후군으로 나타날 수 있으며,9 따라서 이러한 장애를 가진 어린이는 반복 확장 장애의 가족력이 있을 때보다 없을 때 과소 진단될 가능성이 더 높습니다.10– 12

반복 확장에 대한 실험실 평가는 일반적으로 비용과 시간이 많이 소요될 수 있는 PCR 기반 또는 서던 블롯 방법을 사용하여 의심되는 임상 진단에 의해 안내되는 개별 유전자좌의 표적 분자 평가로 제한됩니다. 또한, 이러한 장애의 다양하고 중복되는 표현형 특징으로 인해 질병 관련 반복 확장 유전자좌는 테스트되지 않은 상태로 남을 수 있습니다.14

전체 게놈 시퀀싱은 희귀 질환 환자의 1차 진단 도구로 부상하고 있지만15 최근까지 반복 확장을 포함하는 유전자좌를 평가하는 능력이 제한적인 것으로 생각되었습니다. 그러나 생물정보학의 발전으로 질병 감지가 가능해졌습니다. -차세대 시퀀싱 데이터에서 반복 확장을 유발합니다.17–22 여기에서는 회고적 PCR 데이터를 사용하여 반복 확장을 감지하기 위한 전체 게놈 시퀀싱 접근 방식의 진단 평가와 100000 Genomes Project의 환자에 대한 임상 검증에 대해 보고합니다. 이전의 유전자 검사로 진단되지 않은 의심되는 신경 장애를 가지고 있었습니다.

행동 양식

연구 설계 및 참가자

반복 확장의 검출을 위한 전체 게놈 시퀀싱의 이 평가에는 진단 정확도와 임상 정확도 평가가 모두 포함되었습니다. 진단 정확도는 이전에 신경계 질환을 유발하는 것으로 알려진 반복 확장에 대해 PCR로 테스트한 환자의 데이터를 사용하여 평가되었습니다.4 환자는 100 000 Genomes Project와 Cambridge University Hospitals에 기반을 둔 Genomic Laboratory( 케임브리지, 영국). 두 환자 세트 모두에 대해 일상적인 임상 평가의 일환으로 NHS(National Health Service)의 실험실에서 환자 샘플에 대해 PCR 테스트를 수행했습니다. 100000 게놈 프로젝트의 샘플에 대해 PCR 테스트는 유니버시티 칼리지 런던 병원 신경유전학 연구소(영국 런던); PCR로 확인된 반복 확장이 있는 샘플은 Cambridge에 있는 Genomic Laboratory에서 테스트한 환자로부터 얻었습니다. 반복 확장 장애에 대한 PCR 양성 및 PCR 음성 검사 결과가 있는 환자는 실험실 기록 시스템을 통해 본 연구에 포함되도록 확인되었습니다. 모든 환자는 임상 서비스 최적화 및 검증의 일환으로 품질 보증, 연구 및 교육 목적으로 샘플을 사용하는 것에 대해 서면 동의서를 제공했습니다.

각 샘플의 전체 게놈 시퀀싱은 100000 Genomes Project 샘플(n{2}})에 대한 Genomics England(Hinxton, UK) 및 Illumina Clinical Services Laboratory(ICSL, San Diego, CA, 미국) Cambridge에 소재한 Genomic Laboratory에서 얻은 샘플(n{3}}). 전반적으로, 이 데이터 세트는 연구의 진단 정확도 부분에 사용되었으며 가장 흔한 신경학적 반복 확장 장애를 나타내는 13개 유전자좌를 포함하는 404명의 환자의 PCR 및 전체 게놈 시퀀싱 데이터로 구성되었습니다. 발병 신경퇴행성 장애(HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 및 FXN), 지적 장애와 관련된 하나의 유전자좌(FMR1) 및 근긴장성 이영양증과 관련된 하나의 유전자좌(DMPK). 각 유전자좌에 대해 PCR 테스트 데이터는 적어도 하나의 확장된 대립유전자에 대해 이용 가능했습니다(부록 p 24).

유전적 신경 장애(가족성 또는 조기 발병 형태의 운동실조, 신경병증, 경직성 하반신 마비, 치매)가 의심되는 환자에서 PCR 확인 후 의심되는 임상 진단과 전체 게놈 시퀀싱으로 검출된 반복 확장의 일치성을 조사하여 임상 정확도를 평가했습니다. , 운동 신경 질환,파킨슨병운동 장애, 지적 장애 또는 신경근 장애)가 2013-17년에 100000 게놈 프로젝트에 모집되었습니다. 100000 게놈 프로젝트는 희귀 질환 및 암에 대한 진단 요구 사항이 충족되지 않은 환자에서 전체 게놈 시퀀싱의 가치를 평가하기 위한 영국 프로그램입니다. 데이터 분석 및 진단 결과를 환자에게 반환하는 것을 포함하여 영국 동부 캠브리지 남부 연구 윤리 위원회(참조 14/EE/1112)의 100000 게놈 프로젝트에 대한 윤리적 승인에 따라 이 환자들은 의료 전문가와 연구원에 의해 모집되었습니다. 13 영국의 Genomic Medicine Centers 및 그들의 보호자가 이 연구를 포함한 연구에 사용할 샘플과 데이터에 대해 서면 동의를 제공한 경우 프로젝트에 등록되었습니다. Probands 및 가능한 경우 다른 가족 구성원은 특정 희귀 질환 상태에 대해 설정된 자격 기준에 따라 등록되었습니다(부록 pp 5-11). 환자들은 적격 기준에 명시된 바와 같이 NHS의 표준 치료 유전자 검사 후 100000 게놈 프로젝트에 모집되었습니다. 표준화된 기준 임상 데이터는 질병 특이적 데이터 모델에 대해 인간 표현형 온톨로지(HPO)23를 사용하여 기록되었습니다.24 테스트를 위한 프로밴드의 임상 적응증과 관련된 가족 구성원의 질병 상태도 수집되었습니다.

유전적으로 진단되지 않은 질병이 있는 환자에서 원인이 되는 반복 확장을 식별하기 위해 반복 확장 질병과 일치하는 유전 질환이 의심되는 환자를 테스트했습니다. 환자는 반복 확장 관련 장애와 함께 질병 및 HPO 용어의 일치를 기반으로 선택되었습니다. 환자의 전체 게놈 시퀀싱 데이터를 조사하여 임상 특성에 따라 4개의 다른 반복 확장 패널을 사용하여 특정 반복 세트에서 확장을 검색했습니다(부록 p 5). 이 패널에 포함하기 위해 선택된 반복 확장은 가장 흔한 신경 질환 유발 반복 확장 유전자좌입니다. 하나 이상의 반복 확장 장애와 잠재적으로 양립할 수 있는 임상 특징을 가진 환자를 여러 패널에서 테스트했습니다. 전체 게놈 시퀀싱을 사용하여 반복 확장 호출이 이루어진 경우 PCR에 의한 확인 테스트를 수행했습니다.

반복 확장이 확인된 각 환자에 대해 지역 임상의에게 잠재적 진단 결과를 알리고 반복 확장이 환자의 임상 특징에 미치는 영향을 평가했습니다. 환자의 임상적 특징을 완전히 또는 부분적으로 설명하는 반복 확장의 경우 지역 표준 절차에 따라 진단 보고서가 발행되었습니다.

절차

우리 연구의 진단 정확도 부분에 사용된 NHS 과거 샘플의 경우 반복 확장은 이전에 PCR 증폭 및 단편 분석을 사용하여 테스트되었습니다. 큰 C9orf72 확장에 대해 서던 블로팅을 수행했습니다. 우리 연구의 임상 정확도 부분에서 100 000 게놈 프로젝트의 환자에서 전체 게놈 시퀀싱에 의해 감지된 반복 확장은 NHS 유전 실험실에 저장된 샘플에서 PCR에 의해 테스트되었습니다. 프라이머 서열을 포함한 추가 세부사항은 부록에 제공됩니다(pp 2–3, 25–26).

DNA는 TruSeq DNA PCR-Free 라이브러리 준비를 사용하여 전체 게놈 시퀀싱을 위해 준비되었으며, Genomics England의 고처리량 게놈 시설과 ICSL에서 HiSeq 2000 또는 HiSeq X 플랫폼에서 150bp 또는 125bp paired-end 시퀀싱을 수행했습니다. . 게놈은 평균 깊이 35x(31x ~ 37x, 부록 p 27)로 시퀀싱되었습니다. 짧은 탠덤 반복 유전자형은 ExpansionHunter 소프트웨어 패키지 버전 3.1.2.25,26을 사용하여 수행되었습니다. 간단히 말해서, ExpansionHunter는 미리 정의된 짧은 탠덤 반복 세트에 걸쳐 시퀀싱 읽기를 재정렬하여 개인의 두 대립 유전자 크기를 추정합니다(부록 p 3).

ExpansionHunter 출력에는 평가된 각 궤적에 대한 반복 요소 수, 전체 크기 및 신뢰 한계의 추정이 포함됩니다. 의학 병리학 협회 및 미국 병리학자 협회의 지침에서는 처리량이 많은 시퀀싱 변이체를 일상적으로 평가하는 동안 변이체 호출을 육안으로 검사할 것을 권장합니다.27

그러나 짧은 직렬 반복 변이체는 Integrative Genomics Viewer와 같은 일반적인 시각화 도구로 적절하게 시각화할 수 없습니다.28 각 유전자형 호출의 기초가 되는 전체 게놈 시퀀싱 데이터를 조사하기 위해 그래프 시각화 도구를 사용하여 일배체형과 해당 읽기 더미를 직접 시각화할 수 있었습니다. ExpansionHunter 유전자형(부록 pp 3, 15). 모든 전체 게놈 시퀀싱 짧은 직렬 반복 호출에 대해 파일업 그래프의 육안 검사를 수행하여 대립 유전자에 대한 ExpansionHunter 예측이 각 리드에 완전히 포함되었음을 확인했습니다(즉, 반복 시퀀스가 ​​시퀀싱 리드 길이보다 작음). monoallelic 또는 biallelic 확장의 존재를 확인하기 위해; 추정되는 오탐지 호출을 감지하기 위해; FXN과 같은 이대립유전자 반복 확장에서 위음성 대립유전자를 검출하기 위해(부록 pp 4, 16).

ExpansionHunter는 전체 또는 부분적으로 짧은 직렬 반복을 포함하는 시퀀싱 읽기를 분석하여 전체 게놈 시퀀싱 데이터에서 반복 크기를 추정합니다. 짧은 직렬 반복 대립 유전자가 읽기 길이보다 짧은 경우 ExpansionHunter는 정확한 크기를 예측합니다. 짧은 직렬 반복 대립 유전자가 판독 길이보다 긴 경우 ExpansionHunter는 유전자좌 서열 구성, 시퀀싱 깊이 및 시퀀싱 품질에 따라 CI 내의 반복 크기를 추정합니다.

통계 분석

ExpansionHunter에 의해 예측된 크기가 premutation 컷오프보다 크면 전체 게놈 시퀀싱에 의해 확장된 반복으로, 예측된 크기가 컷오프 미만인 경우 확장되지 않은 것으로 반복을 분류했습니다(부록 p 28).

전체 게놈 시퀀싱 반복 확장 검출에 대한 민감도 및 CI는 확장 반복이 있는 이전에 PCR로 확인된 대립 유전자 중 확장 반복이 있는 대립 유전자의 비율로 계산되었습니다. 특이성은 PCR에 의해 이전에 테스트된 비확장 반복체 중 비확장 대립유전자의 비율로 추정되었습니다. 통계 공식에 대한 전체 설명은 부록(p 1)에 나와 있습니다.

전체 게놈 시퀀싱에 의한 반복 크기 추정치와 PCR에 의한 반복 크기를 비교하기 위해 PCR 정량화 대립유전자를 13개의 짧은 직렬 반복 유전자좌 전체에서 판독 길이보다 짧은 대립유전자에 대해 ExpansionHunter에서 예측한 반복 크기와 비교했습니다. 일치도는 플러스 또는 마이너스 1 반복의 PCR 오류를 고려하여 PCR 정량화 크기와 일치하는 ExpansionHunter에 의해 예측된 반복 크기의 백분율로 계산되었습니다. R 통계 소프트웨어 버전 3.6.3을 사용하여 통계 분석을 수행했습니다.

자금 출처의 역할

연구 설계, 환자 등록, 데이터 수집 및 시퀀싱은 Genomics England 직원과 학술 연구원이 주도했습니다. Illumina 직원들은 전체 게놈 시퀀싱 진단 정확도 연구의 계획된 구성 요소로 150명의 환자 샘플에 대한 시퀀싱을 수행하고 ExpansionHunter를 개발했습니다. Genomics England의 직원, 학술 연구원 및 공동 저자인 RTH, ED 및 MAE는 100 000 게놈 프로젝트에 모집된 환자의 반복 확장에 대한 분석 및 해석을 수행했습니다. 자금 출처는 데이터 해석이나 보고서 작성에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

결과

반복 확장을 감지하기 위한 전체 게놈 시퀀싱의 진단 정확도는 이전에 NHS 내에서 4{27}}4명의 환자로부터 수행된 793개의 PCR 테스트에 대해 평가되었습니다(64명의 환자는 하나 이상의 반복에 대해 테스트를 받았습니다. 그림 1). 이 테스트 중 183개는 반복 확장이 있는 것으로 분류되었고 610은 반복 확장이 없는 것으로 PCR에 의해 분류되어 총 221개의 확장된 개별 대립 유전자와 1321개의 확장되지 않은 개별 대립 유전자가 13개 질병 유전자좌에 걸쳐 생성되었습니다(부록 pp 24, 28). 전체 게놈 시퀀싱은 PCR 테스트 결과(부록 pp 27, 29)와 비교하여 확장 대립형질 221개 중 215개 및 비확장형 대립형질 1321개 중 1316개를 올바르게 분류하여 초기 민감도 97·3%(95% CI 94·2–99 ·0) 및 99·6%의 특이도(99·1-99·9, 표 1). 판독 품질에 따라 모든 호출을 시각적으로 수정한 후 감도는 99·1%(96·8-99·9)로, 특이성은 100%(99·7-100, 그림 2A, 표 1)로 증가했습니다. 확장된 대립유전자의 시각화는 위양성 결과의 검출 및 FXN의 모든 위음성 대립유전자의 재분류를 가능하게 했으며, 이중 대립유전자 확장이 있는 샘플에서 단 하나의 대립유전자만이 확장된 것으로 올바르게 분류되었습니다(부록 pp 17, 18).

반복 길이는 13개의 반복 확장 유전자좌에 걸쳐 945개의 대립 유전자를 조사하는 509개의 PCR 테스트에서 PCR에 의해 정량화되었습니다. 시퀀싱 읽기 길이(즉, 150bp)보다 짧거나 큰 반복 크기에 대한 ExpansionHunter와 PCR 간의 상관 관계는 부록(부록 p 19)에 나와 있습니다. PCR과 ExpansionHunter 간에 92·7%(902개 중 836개) 일치로 판독 길이보다 짧은 반복에 대해 높은 일치도가 관찰되었습니다. ATXN2, ATXN7, CACNA1A 및 HTT에 대해서는 ExpansionHunter와 PCR 사이에 높은 일치성과 DMPK 또는 TBP에 대한 낮은 일치성과 함께 유전자좌 변동성이 관찰되었습니다(부록 p 30). 읽기 길이보다 큰 대립유전자의 길이는 ExpansionHunter에 의해 과소평가되었으며, 이는 DMPK, FMR1 및 FXN에서 호출의 정확도에 영향을 미쳤습니다(그림 2B, 부록 pp 19, 31).

ExpansionHunter가 FMR1, DMPK, C9orf72 및 FXN에서 큰 확장 대립유전자를 정확하게 식별할 수 있었지만(부록 p 29), 반복 크기가 병원성 범위 내에서 증가함에 따라 예측된 크기 추정치는 PCR에 의해 얻은 것보다 더 낮은 경향이 있어 영향을 미쳤습니다. DMPK, C9orf72 및 FXN에서 크고 작은 확장을 구별하거나 FMR1에서 전체 확장과 순열을 구별하는 능력(부록 p 31). 예를 들어, PCR 평가 반복 길이가 FMR1에서 200개보다 크고 완전 돌연변이로 분류된 유전자좌는 ExpansionHunter에 의해 추정된 평균 반복 크기가 92·6(SD 17·8, 부록 p 31)이었습니다.

이전에 검사를 받았고 유전적으로 진단되지 않은 환자의 진단을 해결하기 위해 전체 게놈 시퀀싱에 의한 반복 확장 감지 기능을 테스트하기 위해 100000 Genomes Project(그림 1)에 모집된 유전 신경 장애 의심 환자를 테스트했습니다(그림 1). 전체 게놈 시퀀싱 데이터는 환자의 임상 특징에 따라 4가지 다른 반복 확장 패널을 사용하여 평가되었습니다. 4개의 패널 각각으로 테스트한 환자의 수는 표 2에 나와 있습니다.

전반적으로 우리는 환자 1{6}}5명의 샘플에서 반복적인 확장을 감지하고 시각적으로 확인했습니다(표 2, 부록 pp 20, 33). 이 중 81개의 샘플이 PCR에 의한 확인 테스트가 가능했으며 68개가 반복 확장(0·6% 수율)이 있는 것으로 확인되었습니다. 패널 A의 3692개 중 45개(1·2%), 8개({ {18}}·3%) 패널 B에서 2743개, 패널 C에서 860 5개(0·6%), 패널 D에서 6731개 중 10개(0·1%). 확장 호출 81개 중 13개 병원성 반복 확장으로 확인되지 않았습니다(16% 잘못된 발견 비율). 이 중 2개는 ATXN1 및 ATXN2에서 확장되지 않은 대립유전자이고 4개는 FMR1 중간 크기 호출(부록 p 21)이고 7개는 FMR1 순열입니다.

PCR에 의해 확인된 반복 확장이 있는 68명의 환자의 임상 양상, 확인된 반복 확장 및 환자의 임상 특징에 대한 반복 확장의 기여도를 포함하여 임상 세부사항은 표 3에 제공됩니다. HPO 용어, ExpansionHunter에서 추정한 반복 크기 및 진단 보고서 발행 여부가 부록(33페이지)에 나열되어 있습니다.

레보도파 반응성 조기 발병 파킨슨병 및 진행성 소뇌 운동실조의 병력이 있는 환자에서 ATXN2 반복 확장을 포함하여 패널 A(표 3, 부록 p 22)에서 테스트한 다양한 중복 임상 증상을 나타내는 환자에서 확장이 관찰되었습니다. , 및 유전적으로 확인된 탈수초성 신경병증(즉, Charcot-Marie-Tooth 질병 유형 1, 환자 42, 부록 p 33)이 있는 환자를 포함하여 Charcot-Marie-Tooth 질병으로 임상적으로 진단된 4명의 환자에서 AR 확장. 병원성 반복 확장이 있는 환자에서 광범위한 이전 임상 진단이 관찰되었습니다.

예를 들어, 근위축성 측삭 경화증 또는 기타 운동 뉴런 질환이 있는 7명의 환자에서 AR(n{0}}) 및 C9orf72(n=3)에서 확장이 확인되었습니다. 유전성 운동실조가 의심되는 환자에서 우리는 모집 당시 NHS 내에서 일상적인 진단 정밀검사의 일부로 평가되지 않은 ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP 및 HTT를 포함한 유전자좌의 확장을 확인했습니다( 표 3). 우리는 또한 조기 발병 및 가족성 파킨슨병에서 C9orf72 확장(환자 24, 표 3) 및 HTT(38 반복)의 감소된 침투 범위에서 반복 확장을 포함하여 대체 반복 확장 장애와 일치하는 임상 특징을 가진 환자에서 반복 확장을 감지했습니다. 운동 장애, 치매, 우울증 및 언어 장애(환자 44 및 45)가 있는 두 자매에서 이러한 반복 확장 장애로 인한 진단상의 어려움을 강조합니다.

패널 B로 테스트한 8명의 어린이는 CAG 반복 확장이 큰 것으로 나타났으며(그림 3), 그 중 7명은 환자의 임상 특징을 완전히 설명했습니다. 6명의 환자는 유익한 가족력이 없었고 모집 당시 임상 평가의 일부로 반복 확장 테스트를 제공받지 않았습니다(환자 48-53, 표 3, 부록 p 33). 이 아이들 중 2명은 대규모 HTT 확장(90-100 CAG 반복)을 수행했습니다. 참고로 한 아이는 헌팅턴병의 가족력이 없는 영향을 받지 않은 부모로부터 반복 유전을 받았습니다. 가족 테스트가 진행 중이지만 확장된 가족에서 감소된 침투 대립 유전자가 확인되어 단일 세대(환자 52)에서 반복이 60개 이상의 반복 단위로 확장되었음을 나타냅니다. 글을 쓰는 시점에서 가족 중 헌팅턴병의 징후를 보이는 사람은 없었고, 부모를 위한 유전 상담과 검사가 진행 중이다. 5세 미만의 2명의 어린이가 ATXN7에서 대규모 반복 확장을 수행하고 복합 다계통 질환을 나타냈습니다. 이 어린이 중 한 명(환자 50)의 경우 부모는 100000 게놈 프로젝트에 등록한 지 2년 후에 보행 문제를 보였습니다. 유사하게, 지적 장애가 있는 10세 소녀는 ATXN2에서 99-부모 모두가 영향을 받지 않는 것으로 지정되었음에도 불구하고 반복 확장이 있는 것으로 나타났고, 18세 치매 소녀는 {{16} {19}}ATN1에서 확장을 반복합니다(부록 33페이지).

근이영양증의 임상 진단을 받은 어린이와 어머니, 원위부 근병증이 의심되는 형제 2명, 선천성 근병증이 있는 청소년(환자 54-58)을 포함하여 DMPK(패널 C)에서 5개의 확장이 감지되었습니다. FMR1 확장(패널 D)은 9명의 소년과 1명의 소녀에서 발견되었으며 취약 X 증후군의 진단은 제시된 임상 특징을 완전히 또는 부분적으로 설명했습니다(환자 59-68).

논의

반복 확장 장애의 진단은 이질적이고 중복되는 임상 특징과 비특이적 임상 소견으로 인해 의료 분야에서 어려운 일이며, 이는 연령 및 각 후속 세대에서 중증도가 증가할 수 있습니다. 반복 확장 장애는 유전성 신경 질환의 가장 흔한 원인 중 하나입니다.4 그럼에도 불구하고, 불충분한 유전자 검사가 수행되었거나 원인 유전자 변이가 아직 발견되지 않았기 때문에 환자가 과소 진단될 수 있습니다. 테스트 접근 방식은 현재 단편화되어 있으며, 환자는 다른 신경 유전 질환과 임상적 특징이 겹치기 때문에 잘못된 반복 확장 유전자좌를 테스트29하거나 다른 종류의 변이에 대한 분자 테스트를 받을 수 있습니다.30

전체 게놈 시퀀싱은 희귀 신경 장애에 대한 1차 진단 테스트로 여러 환경에서 사용되었지만 이전에는 반복 확장을 감지하는 능력이 낮은 것으로 생각되었습니다.16 전체 게놈에서 반복 확장을 식별하기 위해 여러 도구가 개발되었습니다. 연구 환경에서 시퀀싱,31 그러나 이러한 접근 방식 중 어느 것도 단일 의료 서비스에서 많은 환자로부터 수집된 전체 게놈 시퀀싱 데이터에 적용되지 않았습니다. 우리는 전체 게놈 시퀀싱에서 반복 확장을 감지하도록 설계된 알고리즘이 가장 흔한 질병 유발 반복 확장을 안정적으로 평가하고 신경 장애 환자의 대규모 집단에서 이전에 유전적으로 진단되지 않은 사례를 해결할 수 있다는 증거를 제시합니다. 우리의 결과는 전체 게놈 시퀀싱이 13개의 반복 확장 유전자좌(육안 검사에 의해 더욱 개선될 수 있음)에 걸쳐 높은 감도와 특이성을 가진 확장되지 않은 대립유전자와 확장 대립유전자를 구별할 수 있고 판독 길이보다 작은 대립유전자의 크기를 정확하게 계산할 수 있음을 나타냅니다. , FMR1, DMPK, FXN 및 C9orf72에서 대규모 확장의 크기를 과소평가할 수 있습니다.

전체 게놈 시퀀싱에 의한 반복 확장의 검출이 이전에 임상 진단 게놈 실험실에서 골드 표준 방법을 사용하여 얻은 양성 및 음성 결과에 대해 평가되었을 때, 우리는 최소 97·3%의 민감도와 99·6%의 특이성을 발견했습니다. 또한, 우리는 읽기 더미의 수동 큐레이션으로 특이성과 감도가 모두 향상될 수 있음을 보여주므로 이중 대립 유전자 확장이 있는 샘플에서 위양성 결과를 감지하고 위음성 대립 유전자를 재분류할 수 있습니다. FMR1 검사를 받은 6731명의 환자(패널 D) 중 124건이 확대될 것으로 예상됐다. 육안 검사를 통해 97개를 위양성 가능성이 있는 것으로 제외할 수 있었습니다. 이는 전체 게놈 시퀀싱 테스트 54개 중 1개가 잠재적인 위양성 호출을 버리기 위해 시각적으로 검사해야 하는 FMR1 호출이 있음을 나타냅니다. FMR1에 대한 위양성 호출 수를 줄이기 위해 ExpansionHunter 유전자형 분석 방법을 개선하기 위한 작업이 진행 중입니다.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 반복)은 더 심각한 질병을 유발하고 650 반복보다 큰 확장은 병원성으로 간주되고 15-650 반복 크기는 불확실한 중요성의 중간 및 변이로 간주되는 척수 소뇌 운동 실조증 유형 36(NOP56)을 유발합니다.

40개 이상의 반복 확장 유전자좌가 확인되었습니다. 이들 유전자좌 중 다수는 최근에야 확인되었으며 현재 신경병증을 동반한 소뇌 운동실조 및 전정 반사신경 반사 증후군(RFC1)32 및 근간대성 간질(SAMD12)을 포함하여 이전에 설명되지 않은 상태와 연관되어 있습니다.33 가장 흔한 신경 질환 유발 반복 확장 유전자좌는 다음과 같습니다. 양성 및 음성 대조군 샘플의 가용성을 기반으로 연구를 위해 선택되었습니다.

여기에 제시된 결과는 확장되지 않은 대립 유전자가 읽기 길이(즉, 150bp)보다 작은 경우 ExpansionHunter가 모든 반복 확장 궤적에서 확장되지 않은 대립 유전자와 확장된 대립 유전자를 정확하게 분류할 수 있어야 함을 시사합니다. 대부분의 반복 확장 유전자좌는 비확장일 때 150bp보다 작은 대립 유전자를 갖지만, 비확장 대립 유전자의 크기가 150bp에 가까운 일부 유전자좌(예: NOTCH2NLC)34는 이 접근 방식을 사용하여 유전자형을 지정하기가 더 어려울 수 있습니다. 확장된 반복이 판독 길이보다 훨씬 큰 유전자좌의 경우 전체 게놈 시퀀싱은 병원성 확장을 감지할 수 있습니다(예: NOP56,35 RFC120,32). 새로운 긴 읽기 시퀀싱 기술은 대규모 확장의 유전형을 분석할 때 보완적인 접근 방식을 제공할 수 있습니다.36

100 000 게놈 프로젝트에 모집된 진단되지 않은 11 631 환자에서 전체 게놈 시퀀싱을 사용하여 반복 확장을 평가한 결과 68명의 환자가 설명 결과를 얻었습니다. 표준 치료 유전자 검사 후 환자를 100 000 게놈 프로젝트에 모집했습니다. 따라서 이 코호트에서 확인된 반복 확장의 비율은 FXN 또는 DMPK와 같은 반복 확장 장애에 대한 유전자좌 특이적 테스트를 포함하는 표준 NHS 테스트에서 진단 수율의 상승을 나타냅니다. 참고로, 반복 확장 장애의 가족력이 없는 6명의 소아 환자를 포함하여 일부 진단은 환자의 임상 양상을 기반으로 의심되지 않았습니다. 이 연구에서 설명된 소아 환자의 전체 게놈 시퀀싱에 의해 예측된 평균 반복 확장 크기는 성인의 평균보다 훨씬 더 크며, 이는 더 큰 확장이 어린이에서도 더 빠르고 더 심각한 발병과 관련이 있다는 기대와 일치합니다. 더 많은 연구가 필요하지만 이 발견은 병원성에 대한 연령 의존적 및 반복적 크기 의존적 평가가 성인 발병 위험 대립 유전자를 식별할 수 있는 잠재적 위험을 줄여 소아 진단을 뒷받침할 수 있음을 시사하며, 이는 아동에서 원치 않는 예측 테스트로 이어집니다.

우리의 발견을 통해 전체 게놈 시퀀싱을 위한 임상 진단 워크플로를 설정할 수 있습니다(부록 p 23). 우리는 위양성을 감지하기 위해 확장된 것으로 분류된 모든 호출과 하나의 확장된 대립 유전자(예: FXN)만 감지된 이중 대립 유전자 확장에 대해 육안 검사를 수행할 것을 제안합니다. 실험실에서 크기 추정을 준수하지 않고 확장의 존재를 평가하고 테스트 워크플로의 표준 구성 요소로 확인 PCR 테스트를 수행하기 위해 ExpansionHunter를 사용하는 것이 좋습니다.

희귀 유전 질환에는 광범위한 임상 특징이 포함되어 있어 유전자좌 특이적 게놈 검사가 비효율적이고 힘들고 비용이 많이 듭니다. 우리는 일반적으로 단일 염기, 삽입결실 또는 복제 수 변이를 나타내는 다양한 희귀 신경 질환을 진단할 가능성이 있는 임상 등급 전체 게놈 시퀀싱이 이제 반복 확장으로 확장될 수 있다는 증거를 제시합니다. 전체 게놈 시퀀싱은 가장 일반적인 반복 확장을 식별할 수 있는 단일 테스트를 제공할 뿐만 아니라 이러한 조건과 관련된 유전자의 점 돌연변이 및 복제 수 변이를 동시에 테스트할 수 있기 때문에 이러한 이질적 장애를 가진 대부분의 환자를 식별할 수 있는 기회를 제공합니다. 유전자좌 특이적 검사를 사용하여 진단되지 않은 사람. 이러한 장애에 대한 새로운 치료법의 시대에는 조기 발견이 중요할 수 있습니다.37 이러한 결과는 NHS England National Genomic에 이미 포함된 접근 방식인 임상 진단 실험실에서 반복 확장의 검출을 위한 전체 게놈 시퀀싱의 구현을 지원합니다. 진단되지 않은 희귀 신경 질환의 조사를 위한 테스트 디렉토리,38.

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