Zingiber Officinale Roscoe의 열대 생강 Sesquiterpene인 Zerumbone은 B16F10 세포에서 -MSH로 유도된 멜라닌 생성을 약화시킵니다. 파트 1
Apr 25, 2023
추상적인:Zingiberaceae 계통의 활성 성분인 ZER(Zerumbone)은 항염증, 항알레르기, 항균 및 항암과 같은 여러 생물학적 활성을 나타내는 것으로 나타났습니다. 그러나 항멜라닌 생성 특성에 대해서는 연구되지 않았습니다. 현재 연구에서 우리는 ZER과 Zingiber가 멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH) 자극 마우스 멜라닌 생성 B16F10 세포에서 멜라닌 축적을 유의하게 약화시키는 공식(ZO) 추출물임을 입증합니다. 또한 ZER이 멜라닌 축적을 억제하는 분자 메커니즘을 규명하기 위해 멜라닌 생성 관련 전사 인자인 MITF(소안구증 관련 전사 인자)의 발현과 tyrosinase, tyrosinase-related protein 1과 같은 표적 유전자를 분석했습니다. TYRP1) 및 TYRP2(tyrosinase-related protein 2)는 -MSH에 의해 자극되는 B16F10 세포에서 발견됩니다. 여기에서 우리는 ZER이 -MSH 자극 시 멜라닌 생성 유전자의 MITF 매개 발현을 억제한다는 것을 발견했습니다. 또한, 다른 농도의 제룸본과 ZO로 처리된 세포는 MITF의 분해 메커니즘에 관여하는 세포외 신호 조절 키나아제 1 및 2(ERK1/2) 인산화가 증가한 것으로 나타났습니다. U0126을 사용한 ERK1/2의 약리학적 억제는 ZER의 항멜라닌 생성 효과를 충분히 역전시켰으며, 이는 ERK1/2의 증가된 인산화가 항멜라닌 생성 활성에 필요함을 시사합니다. 이러한 결과는 ZER 및 ZO 추출물이 항멜라닌 생성 효과 때문에 피부 미백 화장품의 활성 성분으로 사용될 수 있음을 시사합니다.
관련 연구에 따르면, Cistanche는 "생명을 연장하는 기적의 허브"로 알려진 일반적인 허브입니다. 주요 구성 요소는시스타노사이드등의 다양한 효과가 있습니다.산화 방지제,항염증, 면역 기능 촉진. 사이의 메커니즘담배그리고피부 미백cistanche의 항산화 효과에 있습니다배당체. 인간 피부의 멜라닌은 티로신의 산화에 의해 생성됩니다.티로시나제, 산화 반응에는 산소의 참여가 필요하므로 체내의 산소가 없는 라디칼은 멜라닌 생성에 영향을 미치는 중요한 요인이 됩니다. Cistanche는 산화 방지제인 cistanoside를 함유하고 있으며 신체의 자유 라디칼 생성을 감소시킬 수 있습니다.멜라닌 생성 억제.
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키워드:제럼본; Zingiber 공식 Roscoe; 멜라닌 생성; MITF; ERK1/2
1. 소개
표피 멜라닌 세포에 의한 멜라닌 생성인 멜라닌 생성은 자외선(UV) 방사선에 노출되면 각질 세포에서 분비되는 -멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH)에 의해 자극됩니다[1,2]. 줄기 세포 인자(SCF)는 출생 후 피부 멜라닌 생성을 유지하기 위해 멜라닌 세포 이동, 증식 및 분화를 엄격하게 제어하는 또 다른 멜라닌 생성 인자입니다[3]. 멜라노코르틴 1 수용체를 통한 -MSH 자극 시 멜라닌 생성 전사 인자인 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)는 cAMP-PKA-CREB(cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A-cAMP response element binding protein) 신호 전달 경로를 통해 활성화됩니다. (MC1R) 표피 멜라닌 세포의 세포질 막에서 [4]. forskolin 및 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)와 같은 여러 화학 물질은 cAMP-PKA-CREB 신호 경로를 활성화하여 멜라닌 생성을 유도하는 것으로 알려져 있습니다[5]. 여러 연구에서 종양 형성의 분자 메커니즘에 관여하는 세포외 조절 키나아제 1 및 2(ERK1/2)의 지속적인 활성화가 Ser73에서 MITF 인산화를 촉진하고 유비퀴틴 의존성 단백질 분해를 통해 후속 분해를 촉진한다는 사실이 밝혀졌습니다[6,7 ]. 실제로 선택적 ERK1/2 경로 억제제인 U0126은 MITF 발현과 티로시나제 활성을 증가시켜 멜라닌 생성을 유도하는 것으로 보고되었습니다[6]. 안정화되고 활성화된 MITF는 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 1(TYRP1) 및 티로시나제 관련 단백질 2(TYRP2)와 같은 멜라닌 생성 유전자의 발현을 증가시킵니다. 티로신이 멜라닌 생성의 초기 단계인 3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)으로의 변환은 티로시나아제에 의해 촉매됩니다. 티로시나제 관련 단백질(TRPs)은 추가 산화 및 호변이성화 반응을 촉매합니다[8]. 멜라닌 합성 후 성숙한 멜라닌은 표피 멜라닌 세포에서 기저 각질 세포의 세포질로 이동하여 자외선으로부터 세포를 보호합니다[2].
비정상적으로 증가된 멜라닌 생성은 피부암, 기미, 주근깨와 같은 여러 유형의 피부 질환을 유발합니다[4]. 따라서 티로시나아제의 촉매 활성 또는 ERK1/2를 포함한 멜라닌 생성의 신호 전달 경로 조절제 또는 멜라닌 생성 유전자의 MITF 매개 전사를 표적으로 하는 소분자 또는 천연 제품이 화장품에 활용될 활성 성분으로 확인되었습니다. 산업. 코지산, 알부틴, 나이아신아마이드와 같은 여러 소분자는 항멜라닌 생성 활성으로 인해 화장품 성분으로 널리 사용됩니다. 그러나 코지산은 유전독성 때문에 세포독성, 피부염, 피부암, 간세포암종 등 여러 가지 부작용을 일으킨다는 보고가 있다[9]. 월귤나무에서 분리한 알부틴은 과색소침착 장애를 치료하는 데 사용되어 왔지만, 최근 여러 가지 부작용으로 인해 화장품 원료로 사용이 제한되고 있다[9]. 나이아신아마이드는 항멜라닌 생성 활성을 가지고 있으며 이 활성은 멜라노사이트에서 주변 케라티노사이트로의 멜라닌소체 이동을 억제함으로써 수행됩니다[10]. 따라서 화장품 산업에서 일반적으로 피부 미백 화합물로 사용되어 왔습니다. 여러 가지 부작용이 있는 기성 미백제의 한계를 극복하기 위해서는 천연 유래의 안전한 미백 성분 개발이 중요하다. 예를 들어, -thujaplicin, linderanolide B, 4-butyl resorcinol 및 plumbagin은 티로시나제 억제 효과로 인해 항멜라닌 생성 화합물로 확인되었습니다[4,11]. Nobiletin, withaferin A, sesamol 및 chaetocin은 멜라닌 생성 경로에서 신호 중간체를 조절함으로써 항멜라닌 생성 특성을 나타냅니다[11].
ZER(Zerumbone)은 Zingiber zerumbet Smith 및 Zingiber officinal Roscoe와 같은 Zingiberaceae과에 속하는 식물의 휘발성 에센셜 오일에서 분리된 천연 제품입니다[12]. 여러 연구에서 ZER이 항균, 항산화, 항당뇨병, 항암, 항염증, 항알레르기 및 항혈관신생 활성을 포함한 광범위한 생물학적 활성을 가지고 있음을 보여주었습니다[12]. 흥미롭게도, ZER은 핵인자-E{{8}의 활성화를 통해 활성산소종(ROS)을 제거하는 능력으로 인해 자외선 A(UVA)로 인한 피부 각질세포의 산화적 손상에 대한 보호 효과를 발휘하는 것으로 나타났습니다. }관련 인자-2 (Nrf2) [1,13]. 이는 ZER이 스킨케어 화장품의 기능성 첨가제로 사용될 수 있음을 시사한다. 그러나 ZER 작용의 항멜라닌 생성 특성에 대한 자세한 메커니즘은 아직 연구되지 않았습니다.
본 연구에서는 -MSH로 자극된 멜라닌 생성에 대한 ZER 및 ZO(Zingiber officinal) 추출물의 억제 효과 및 그 기저 메커니즘을 연구하였다. 여기에서 우리는 ZER이 ERK1/2의 인산화를 상향 조절하고 멜라닌 생성 유전자의 MITF 매개 발현을 억제함으로써 -MSH로 유도된 멜라닌 생성을 상당히 억제한다는 것을 보여줍니다.
2. 결과
2.1. Zerumbone(ZER)은 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 -MSH 유도 멜라닌 생성을 억제합니다.
제럼본(ZER)의 항멜라닌 생성 효과를 연구하기 위해 처음에 B16F10 및 HaCaT 세포 모두에서 세포 독성을 평가했습니다. ZER의 화학 구조는 그림 1A에 나와 있습니다. 20 μM 이상의 농도에서 ZER은 강한 세포 독성 효과를 나타내는 반면, 20 μM 미만에서는 ZER이 두 세포주 모두에서 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 관찰되었습니다(그림 1B). 다음으로 B16F10 세포에서 -MSH(-melanocytes stimulating hormone)-유도 멜라닌 축적 및 분비에 대한 ZER의 억제 효과를 조사하였다. ZER은 -MSH에 의해 유발된 멜라닌의 세포내 축적과 배양 배지로의 분비를 강력하게 억제하는 것으로 나타났습니다(그림 1C, D). 또한, 우리는 ZER이 피부 미백 화장품의 잘 알려진 활성 성분인 1mM 알부틴 또는 0.2mM 코직산보다 더 효과적으로 멜라닌 생성을 약화시킨다는 것을 발견했습니다(그림 1D). ZER이 인간 세포에서 멜라닌 생성을 억제하기에 충분한지 여부를 밝히기 위해 멜라닌 생성 G361 인간 흑색종 세포를 사용했습니다. 그림 1E에서 볼 수 있듯이 ZER은 줄기 세포 인자(SCF)로 유도된 세포 외 및 세포 내 멜라닌 함량을 유의하게 감소시킵니다. 이러한 결과는 멜라닌 생성 마우스 B16F10 및 인간 G361 세포에서 ZER의 항-멜라닌 생성 활성을 확인시켜줍니다.
2.2. 제럼본은 G361 인간 흑색종 세포에서 멜라닌 생성 전사 인자, MITF 및 그 표적 유전자의 유전자 발현을 억제합니다
Endothelin-1 및 SCF 신호는 인간 멜라닌 세포 및 여러 유형의 흑색종에서 멜라닌 생성에 필수적인 역할을 하는 것으로 보고되었습니다[3,14-16]. 이 연구에서 우리는 ZER이 마우스 B16F10 및 인간 G361 흑색종 세포에서 멜라닌 생성 자극, -MSH 및 SCF에 따라 멜라닌 생성을 억제한다는 것을 발견했습니다(그림 1).
따라서 우리는 G361 인간 흑색 종 세포에서 SCF 자극시 멜라닌 생성 관련 유전자 및 단백질의 발현 수준의 변화를 측정했습니다. 우리는 ZER이 SCF 자극 후 각각 2-4시간 및 24-48시간에 SCF-유도 MITF 및 티로시나아제 단백질 발현을 약화시키는 것을 발견했습니다(그림 2A). 또한, ZER 처리된 G361 세포에서 MITF, tyrosinase 및 TYRP1(tyrosinase-related protein 1)과 같은 멜라닌 생성 관련 유전자의 유전자 발현이 억제되었습니다(그림 2B, C). 이러한 결과는 SCF 자극시 멜라닌 생성 관련 유전자의 발현 피크 시간을 밝혔습니다. 최대 MITF mRNA 유도는 1-2시간 이내에 관찰되었고, 티로시나제 및 TYRP1의 mRNA 수준은 SCF 자극 후 최대 24-48시간에 도달하는 것으로 관찰되었습니다.
2.3. Zerumbone은 마우스 B16F10 세포에서 멜라닌 생성 유전자 및 효소 발현을 억제합니다
ZER이 멜라닌 생성을 억제하는 분자적 기작을 조사하기 위해 멜라닌 생성 전사 인자인 MITF와 TYRP1(tyrosinase-related protein 1), tyrosinase, tyrosinase-related protein 2(TYRP2)와 같은 표적 유전자의 유전자 발현을 측정했습니다. ZER의 부재 또는 존재. 인간 G361(그림 2) 및 마우스 B16F10 흑색종 세포[4]에서 SCF 및 -MSH 자극 시 멜라닌 생성 관련 유전자 발현의 피크 시간이 각각 알려져 있기 때문에 MITF, 티로시나제, TYRP1 및 TYRP2의 발현을 추가로 측정했습니다. ZER 처리된 마우스 B16F10 흑색종 세포에서 -MSH로 2시간 또는 48시간 배양 후. 그림 3A는 ZER이 B16F10 세포에서 -MSH로 유도된 MITF, TYRP1, TYRP2 및 티로시나아제 발현을 약화시키기에 충분하다는 것을 보여줍니다. 유사하게, MITF, 티로시나제 및 TYRP2 단백질 발현 수준은 ZER 처리 시 감소하였다. CREB의 PKA(Protein kinase A) 매개 인산화는 -MSH 자극 시 전사 수준에서 MITF를 증가시키는 주요 신호 전달 경로입니다[4]. 따라서 여기서는 ZER에 의한 CREB의 인산화 감소가 MITF 억제를 매개할 수 있는지 분석하였다. 우리는 -MSH로 유도된 CREB 인산화가 ZER 처리에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 발견했으며, 이는 ZER이 PKA-CREB 신호 전달 경로 축과 독립적으로 -MSH로 유도된 MITF 발현을 억제함을 시사합니다(그림 3B). 티로시나아제는 멜라닌 합성을 조절하는 속도 제한 효소이기 때문에[2,4,11], 세포 내 티로시나아제 단백질 수준과 알부틴, 코직산 및 ZER 처리 시 효소 활성을 추가로 분석했습니다. 도 3C는 ZER이 B16F10 세포에서 -MSH-유도 티로시나아제 단백질 수준을 충분히 감소시킨다는 것을 보여준다. 또한, Figure 3D는 10 μM ZER이 티로시나아제 억제제, 알부틴, 코직산보다 L-DOPA 산화를 더 효과적으로 억제함을 보여주며, 이는 ZER 처리된 세포에서 티로시나아제의 효소 활성을 통해 L-DOPA의 도파퀴논으로의 산화가 억제됨을 시사합니다. . 이러한 결과는 ZER이 멜라닌 생성 관련 전사 인자인 MITF 및 이의 표적 유전자의 유전자 발현을 억제함으로써 -MSH-매개 멜라닌 생성을 약화시킨다는 것을 입증한다.
2.4. Zerumbone의 항멜라닌 생성 효과는 ERK1/2의 인산화를 통한 것입니다.
성장 인자 또는 멜라닌 생성 자극에 의한 단백질 키나아제 B(AKT) 및 세포외 신호 조절 키나아제(ERK1/2)의 활성화는 MITF 및 그 표적 유전자의 발현 감소를 통해 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려져 있습니다[11]. ERK1/2 신호 경로에 대한 반응으로 Ser73 및 Ser409에서 MITF의 인산화는 프로테아좀 의존적 분해를 촉진합니다[17,18]. 따라서 ZER이 B16F10 마우스와 G361 인간 흑색종 세포에서 ERK1/2 인산화를 조절하는지 조사하였다. ERK1/2(p-ERK1/2)의 증가된 인산화가 시간 및 용량 의존적 방식으로 ZER 처리 시 관찰되었지만 전체 ERK1/2(T-ERK1/2)는 관찰되지 않았습니다(그림 4A, B). 흥미롭게도, ERK1/2의 인산화는 마우스 B16F10 및 인간 G361 흑색종 세포에서 ZER 처리 후 10-30분 및 1-2시간 이내에 급격히 증가하는 것으로 관찰되었습니다(그림 4A). 그러나 ZER 처리 시 AKT와 MEK의 인산화는 관찰되지 않았으며, 이는 ZER에 의해 유도된 ERK1/2 인산화가 MITF를 억제할 수 있음을 시사합니다(그림 4B). ERK1/2 인산화가 MITF의 인산화 및 프로테아좀 분해를 촉진하기 때문에[17,18], 우리는 프로테아좀 억제제가 ZER에 의한 MITF의 감소를 방지하는지 여부를 조사했습니다. ZER에 의한 MITF의 억제는 MG132의 존재 하에서는 관찰되지 않았으며, 이는 ZER이 프로테아좀 분해를 통해 MITF 발현을 감소시킨다는 것을 확인시켜줍니다(그림 4C). 다음으로 ZER이 ERK1/2의 표적 잔기인 Ser73에서 MITF를 인산화하는지 조사하였다. 인산화된 MITF를 검출하기 위해 세포를 -MSH 및 MG132에 노출시켰다. 여기에서 우리는 인산화된 MITF(Ser73)가 -MSH 및 MG132의 존재 하에서 ZER에 의해 크게 증가한다는 것을 발견했습니다(그림 4D). 선택적 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 억제제인 U0126은 ZER에 의해 유도된 MITF 인산화를 없앴습니다(그림 4D). 또한, 전체 세포 용해물(WCL)의 총 MITF 단백질 수준은 MG132의 존재 하에서 ZER 및 U0126에 의해 변경되지 않았습니다(그림 4D). 이러한 결과는 ERK1/2- 매개 MITF(Ser73) 인산화 및 프로테아좀 분해가 ZER 매개 MITF 억제에 중요한 메커니즘임을 나타냅니다. 또한, 그림 4E는 U0126이 ZER 처리된 세포에서 감소된 MITF 단백질 수준을 유의하게 회복했음을 보여줍니다. 일관되게, ZER에 의한 감소된 세포내 멜라닌 함량은 U0126에 의해 약 40%로 복원되었으며(그림 4F), 이는 ERK1/2의 활성화가 ZER의 항멜라닌 생성 효과에 필요함을 시사합니다.
2.5. 징기버 오피시날레(ZO) 추출물의 항멜라닌 생성 효과
ZER은 Zingiber zerumbet 및 Zingiber officinal과 같은 Zingiberaceae과의 여러 식물 종에서 추출한 식물 화학 물질입니다 [12]. 따라서 우리는 처음에 B16F10 및 HaCaT 세포에서 ZO 추출물의 부재 또는 존재에서 세포 생존력을 측정했습니다. 그림 5A는 세포 생존력이 ZO 추출물 처리에 의해 변경되지 않았음을 보여줍니다. ZO(Zingiber officinal) 추출물의 항멜라닌 생성 효과를 추가로 분석했습니다. ZER은 활성화된 ERK1/2 신호 전달 경로를 통해 MITF와 그 표적 멜라닌 생성 유전자의 발현을 감소시켰기 때문에(그림 2 및 3), ZO 추출물이 B16F10 세포에서 -MSH로 유도된 MITF와 그 표적 멜라닌 생성 단백질 발현을 억제하는지 확인했습니다. ZER의 항멜라닌 생성 효과와 유사하게 -MSH로 유도된 MITF, 티로시나제 및 TYRP2는 ZO 추출물에 의해 용량 의존적으로 유의하게 감소했습니다(그림 5B). 흥미롭게도 ERK1/2 인산화는 ZO 추출물 처리 세포에서도 증가했습니다(그림 5B). MITF 및 tyrosinase, TYRP1 및 TYRP2와 같은 표적 유전자의 발현은 5 μg/μL ZO 추출물 처리 시 크게 감소했습니다(그림 5C). 또한, 세포외 및 세포내 멜라닌 함량은 5 μg/μL ZO 추출물 처리 시 약 40%로 크게 감소했습니다(그림 5D). 또한, ZO 추출물을 처리한 세포에서 감소된 티로시나아제 활성이 관찰되었습니다(그림 5E). 이러한 결과는 ZO(Zingiber officinal) 추출물이 MITF 매개 멜라닌 생성 유전자 발현을 약화시켜 멜라닌 생성을 억제함을 시사합니다.
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