저울에 걸친 신장의 3D 현장 이미징을 위한 빠르고 간단한 제거 및 팽창 프로토콜
Mar 23, 2022
최근 몇 년 동안 나노 크기의 구조를 시각화하기 위해 많은 광학 현미경 프로토콜이 발표되었습니다.신장.이러한 프로토콜은 연구원들에게 족돌기 해부학 및 소실뿐만 아니라 족돌기, 슬릿 횡격막 및 사구체 기저막의 단백질 분포를 평가하는 새로운 도구를 제공합니다. 그러나 이러한 프로토콜에는 서로 다른 복잡한 초해상도 현미경 또는 긴 샘플 준비 프로토콜의 적용이 포함됩니다. 여기서는 3차원 시각화를 위한 빠르고 간단한 5시간 절차를 제시합니다.신장모든 길이 스케일의 형태. 이 프로토콜은 광학 청소 및 조직 확장 개념을 결합하여 기존 공초점 현미경을 사용하여 나노 규모 구조를 해결하기에 충분한 가벼운 팽창을 생성합니다. 우리는 프로토콜이 마우스와 인간 모두에서 다양한 병리학 적 특징을 시각화하는 데 적용될 수 있음을 보여줍니다신장. 따라서 우리의 빠르고 간단한 프로토콜은 기존의 현미경 평가에 도움이 될 수 있습니다.신장연구와 미래의 임상 루틴 모두에서 조직 무결성.
나노 스케일 구조의 이미징을 위한 수많은 광학 프로토콜신장I- 여과 장벽 해부학 및 병리학을 정량화하기 위한 도구로서 이러한 새로운 기술의 힘은 우리 그룹 및 기타 그룹의 최근 간행물에 예시되어 있습니다.5, 퍼센트,10이러한 모든 광학 프로토콜은 강력하지만 고급 회절 무제한 현미경을 사용하거나 샘플에 복잡한 고분자 화학 물질을 도입하여 샘플을 보호하거나 물리적으로 확장합니다. 많은 프로토콜은 또한 시간이 많이 걸리고 상당한 양의 실무 노동을 필요로 합니다. 이러한 추가적인 복잡성으로 인해 연구자와 임상 병리학자가 이러한 새로운 방법을 일상적으로 사용하지 못하게 될 수 있습니다. 또한 많은 프로토콜이 5-15음의 깊이를 넘어서는 발 프로세스(FP)의 3-깊은 차원(3D) 이미징에 액세스할 수 없습니다.{9}},7,8 따라서 우리는 다음을 목표로 했습니다. 깨끗하고 공간적으로 팽창하는 대폭 간소화되고 빠른 전광 프로토콜 개발신장현장 3D 고해상도 분석이 가능하도록 충분히 조직 샘플신장거의 모든 생명 과학 및 병리학 기관에서 사용할 수 있는 기존의 회절 제한 현미경을 사용한 해부학 및 병리학.이전 프로토콜 단순화는 아크릴아미드 중합체를 파라포름알데히드 고정 샘플에 도입하는 것이 완전히 생략될 수 있는 동시에 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 제거에 대한 조직 무결성을 유지하는 것으로 나타났습니다. 또 다른 연구에 따르면 다양한 수용액에 담그는 간단한 폴리머 프리 프로토콜을 사용하여 조직 샘플을 2배 이상 확장할 수 있습니다.2 따라서 우리는 더 지루하고 복잡한 공개 프로토콜²에서 아크릴아마이드 주입을 제거하고 변경했습니다. 경미한(1.{5}}배선형) 팽창을 허용하는 샘플 임베딩 매체신장조직 샘플. 또한 이미징 매개변수를 최적화함으로써 기존의 공초점 현미경을 사용하여 족세포 FP와 사구체 기저막(GBM)의 3D 시각화를 위해 충분히 높은 효과적인 해상도를 달성했습니다.
키워드:국소 분절 사구체 경화증; IgA 신병증; 족세포; 신장 생검; 신장 병리학; 신장
결과
신장 조직의 광학적 제거 및 경미한 부종간단한 디어링/팽창 프로토콜은 그림 1a에 도식적으로 묘사되어 있습니다. SDS 탈지 단계는 주로 광학 투명도를 위해 추가된 것이 아니라 샘플의 충분한 팽창을 보장하기 위해 추가되었습니다. 또한, 탈지질을 생략하면 염색 품질이 좋지 않습니다(보충 그림 S1A). 우리는 70도에서 1시간 동안 급속 탈지하는 것이 더 높은 온도에서 샘플 분해가 발생하지 않고 좋은 결과를 생성했음을 보여줍니다(보충 그림 S1B). Murakami et al.이 보고한 바와 같이 요소 및 요소 유사 분자는 조직 샘플을 효과적으로 팽창시켜 효과적인 공간 분해능을 높일 수 있습니다. 따라서 80%(wt/wt) 과당(FRUIT이라고 함)이 포함된 혼합물에 4M 요소를 추가하여 선형 팽창 계수가 -1.3이 되었습니다(그림 1b).
라벨링 시간을 단축하기 위해 염료 결합 1차 항체를 사용했습니다. 초기에 표준 염색 완충액(Tween 20이 포함된 인산염 완충 식염수)에서 염료 접합 네프린 항체를 사용할 때 신호 및 표지 효율은 개별 FP를 설명할 만큼 충분히 높지 않았습니다. 그러나 대체 염색 완충액인 HEPES-TSC를 사용하여 염색 품질이 만족스러운 정도로 향상되었습니다(보충 그림 S1C). 기존의 현미경을 사용하여 이전에 게시된 프로토콜과 비교할 때 빠르고 간단한 5-시간 프로토콜은 몇 가지 필수 매개변수에서 이를 능가했습니다(그림 1c-f). Pullman et al.'이 제시한 프로토콜 전반적으로 약간 더 빠르지만 초고해상도 구조 조명 현미경이 필요하고 얇은 cryosection을 사용하여 큰 이미징 깊이에 액세스할 수 없다는 단점이 있습니다. 참고로, 우리의 프로토콜은 모든 평가된 매개변수를 고려할 때 표준 파라핀 포함 또는 냉동절편보다 덜 복잡합니다.
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발 과정을 해결하기 위한 프로토콜의 최적화 및 검증우리의 프로토콜은 1.3의 적당한 팽창 계수만 제공하기 때문에 공초점 이미징 매개변수는 이미징 FP에 대한 충분한 분해능을 달성하기 위해 최적화되어야 했습니다. 생쥐신장샘플을 프로토콜에 따라 처리하고 다른 형광단을 사용하여 네프린에 대해 염색했습니다. 공초점 현미경의 해상도는 핀홀 크기와 여기/방출광의 파장에 따라 다릅니다.15 따라서 우리는 0의 더 작은 핀홀 직경을 사용했습니다. 염료, Alexa Fluor 488 및 이러한 방식으로 야생형(WT) 마우스에서 FP를 분해하기에 충분한 분해능을 달성했습니다.신장(그림 2a). 따라서 마우스 FP를 시각화할 때마다 최대 여기 파장이 488 nm인 형광단이 사용됩니다. 이러한 최적화된 이미징 조건에서 우리는 -115 nm의 효과적인 해상도에서 전체 마우스 사구체를 3D로 시각화할 수 있었으며, 이는 개별 FP를 해결하기에 충분했습니다(그림 2b-e). 또한 빠른 라벨링으로 최소 70μm의 항체 침투 깊이가 달성됨을 보여줍니다(보충 그림 S2A-C). 교정 칼라가 있는 글리세롤 대물렌즈를 사용하면 다음을 제외하고 이전에 개발된 프로토콜보다 더 큰 Z 깊이에 액세스할 수 있습니다.정화/자극 배출 고갈 프로토콜. 공초점 현미경의 축 분해능은 측면 분해능보다 약 3배 더 나쁘기 때문에 모세관은 최적의 FP 분해능을 위해 xy 평면에서 배향되어야 합니다. 우리는 프로토콜을 사용하여 각 사구체에서 이미징을 위한 많은(최대 25개) 영역을 찾을 수 있음을 보여줍니다(보충 그림 S2D). 이를 통해 많은 양의 데이터를 수집하여 침투 장벽 구조의 미묘한 변화도 감지할 수 있습니다. 이것은 사구체 건강에 대한 고처리량 정량 분석을 수행할 때 깊이 차원에 액세스하는 것이 중요함을 보여줍니다. 중요하게도, 우리는 인간 환자 재료(그림 2f 및 g)에서 FP를 해결하기 위한 프로토콜도 검증했는데, 이는 인간 FP의 더 큰 치수로 인해 마우스에 비해 덜 도전적입니다. 또한, FP의 글리코칼릭스에 친화력이 있는 밀 배아 응집소(WGA) 렉틴을 사용하여 마우스와 인간 샘플 모두에서 단면 방식으로 FP를 해결할 수 있었습니다(그림 2h 및 i). 또한, 우리는 슬릿 막에서 예상되는 위치와 함께 네프린에 대해 비용을 계산하여 형태학적 정보 외에 단백질 위치에 대한 데이터를 얻을 수 있음을 보여주었습니다.
마우스 샘플의 여과 장벽 병리학이전에 보고된 바와 같이 '-,5,6,9,10 en face FP 이미징은 슬릿 다이어프램의 FP 소실을 시각화하고 정량화하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다. 우리는 이 접근 방식이 최근에 발표된 국소 분절 사구체 경화증(FSGS)에 대한 마우스 모델을 사용하여 새로운 프로토콜에도 적용할 수 있음을 확인합니다(그림 3). 네프린에 대한 염색으로 슬릿 횡격막 패턴은 WT 및 돌연변이 마우스의 전체 사구체에서 3차원으로 시각화될 수 있었습니다(그림 3a 및 b). 이전에 보고된 바와 같이,5 영역당 슬릿 다이어프램 길이는 반자동으로 정량화될 수 있으며 이 분석은 이 마우스 라인에 대해 이전에 발표된 것과 일치하는 결과를 제공합니다'(그림 3c). 또한, 사구체 모세혈관은 FP의 소실과 GBM의 변경을 모두 보여주는 단면에서 이미지화되었습니다(그림 3d-f). GBM 측정에 대한 자세한 내용은 보충 방법 및 그림 S3을 참조하십시오.
인간 샘플의 여과 장벽 병리학가능한 임상 사용에 대한 프로토콜을 추가로 검증하기 위해 다양한 유형의 진단을 받은 환자의 인간 조직에 적용했습니다.신장병. NPHS1 유전자의 동형접합 돌연변이(네프린 인코딩) 또는 TRPC6 및 NPHS2 유전자의 트랜스 관련 돌연변이(TRPC6 채널 및 포도신 인코딩)가 있는 선천성 신증후군 환자 2명. 또한 FSGS 및 최소 변화 질환으로 진단된 2명의 환자를 분석했습니다. 의 전형적인 특징을 시각화하고 정량화할 수 있었습니다.신장병, FP 소실과 같은 GBM 변경(그림 4). 이미지는 얼굴(그림 4a-e)과 측면(그림 4g-k) 모두에서 획득할 수 있습니다. 또한, 우리는 NPHS1 돌연변이가 있는 환자의 슬릿 횡격막에서 예상되는 네프린의 부재를 관찰했습니다(그림 4b 및 h). 마우스 샘플의 경우
(그림 3), 이미징 데이터를 정량적으로 평가할 수 있습니다(그림 4f 및 l 및 보충 그림 S4A 및 B).
참고로, 대조군과 비교하여 진단된 환자에서 예기치 않게 가벼운 GBM 비후가 관찰되었습니다. 신장 절제된 대조군신장그림 4에서 다른 모든 샘플은 유아 또는 어린이에게서 얻은 반면, 나이든 환자에게서 채취한 것입니다. GBM 두께는 연령에 따라 증가하기 때문에(보충 그림 S5A-E), 연령이 일치하는 대조군 환자와 비교할 때 더 현저한 비후가 관찰될 것입니다. 우리는 또한 우리의 프로토콜(보충 그림 S5F-H)에 의해 연령 의존적 팽창 아티팩트가 도입되지 않았으며 다른 GBM 측정 전략이 유사한 결과를 산출했음을 검증했습니다(보충 그림 S5I 및 D).
마우스 및 인간 샘플의 대규모 병리학여과 장벽 규모뿐만 아니라 조직 학적 변화도 있기 때문에신장형태학은 연구원과 임상의 모두에게 높은 관심을 받고 있으며, 우리는 형광 기반 조직학 분석을 통해 대규모 형태학을 평가하기 위해 프로토콜을 사용할 가능성을 조사했습니다. 우리는 더 낮은 배율 목표를 사용하여 인간 샘플(보충 그림 S6)과 마우스 샘플(보충 그림 S7) 모두에서 대규모 병리와 단백질 발현의 차이를 감지할 수 있음을 보여줍니다.
FSGS 및 IgA 신병증으로 진단된 환자의 병리학적 변화 시각화환자 샘플에서 프로토콜의 가능한 사용을 추가로 예시하기 위해 우리는 세포 유형의 FSGS의 병리학적 특징을 감지할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 우리는 현재의 금 표준 방법과 비교하여 사구체 모세혈관의 국소 총/분절 협착, 세뇨관 위축 및 내피 과세포성을 포함하여 병리학자의 진술에 언급된 대부분의 병리학적 특징을 시각화할 수 있었습니다(그림 5a-j). 전자 현미경(EM)과의 정성적 및 정량적 나란히 비교는 두 방법을 모두 사용하여 유사한 결과를 보여주었습니다(그림 5k 및 l 및 보충 그림 S4, FP 폭 측정에 대한 논의는 보충 방법 참조).
CISTANCHE는 신장/신장 통증을 개선합니다
또한 IgA 신증(IgAN) 진단을 받은 환자의 생검 표본에 프로토콜을 적용하여(그림 6) 많은 진단 특징의 시각화를 확인할 수 있었습니다. 여과 장벽(그림 6a 및 b)에는 심각한 병리가 없었고, 비교 분석 결과 EM과 프로토콜 간에 명백한 차이가 없었습니다(그림 6c 및 d). 다음으로, 대출 신장의 조직학은 표준 조직학(그림 6e)과 "형광 조직학"(그림 6f)으로 평가되었습니다. 우리는 세포의 간질 침윤(그림 6g 및 h), 정상 사구체 모세혈관(그림 6i) 및 간질 확장/과세포성(그림 6j)과 같은 병리학자의 진술에 언급된 변경(또는 변경 부족)을 시각화할 수 있습니다. IgA 항체를 사용한 면역염색은 표준 면역형광(그림 6n 및 o)에서 볼 수 있는 패턴과 동일한 패턴으로 대규모(그림 6k 및 l) 및 세부사항(그림 6m) 모두에서 침전물을 명확하게 드러냈습니다. 마지막으로, FP 이미징은 부분적으로 약한 소실을 보여주었습니다(그림 6p 및 q). 프로토콜로 감지할 수 있는 병리학적 특징은 보충 표 S1에 요약되어 있습니다.
논의
여기에서 우리는 고처리량 시각화를 위한 프로토콜을 제시합니다.신장FP 분석 및 사구체 여과 장벽 이미징을 위해 이전에 발표된 프로토콜보다 빠르고 간단한 모든 길이 규모의 구조신장, 우리는 우리가 달성한 해상도가 대부분의 연구 시설 및 병리학 실험실에서 이미 사용 가능한 표준 도구인 간단한 공초점 현미경을 사용하여 여과 장벽의 병리에 대한 결론을 도출할 만큼 충분히 높다는 것을 보여줍니다. 프로토콜의 3D 기능은 FP의 이미징을 수행할 때 중요합니다. 큰 이미징 볼륨에 액세스할 수 있어 정량적 분석을 위해 샘플의 적절한 영역을 식별하고 스크리닝할 수 있기 때문입니다.
우리 연구의 중요한 발견은 우리의 프로토콜이 현재 표준 분석에 사용되는 표준 프로토콜과 비교하여 보완적이고 유익하게 수행할 뿐만 아니라신장조직. 또한 이러한 워크플로를 하나의 프로토콜로 병합하여 작업 시간과 필요한 재료/시약/장비 측면에서 명백한 절감 효과를 얻을 수 있습니다. 그러나 분석이 광범위하게 항체를 기반으로 하기 때문에 라벨링 시약의 비용은 상당히 높으며(샘플당 약 20e) 이는 이 문서에 제시된 다른 형광 기반 프로토콜(일반 면역형광 포함)에도 해당됩니다.
프로토콜의 가장 빠른 버전에서 우리는 FP를 해결하기 위해 충분한 염색 품질을 산출하는 염료 접합 1차 항체를 사용합니다. 그러나 결과 신호는 2-단계 1차/2차 접근 방식의 신호에 비해 항상 낮습니다. 또한, 연구에 사용된 1차 접합 항체는 상업적으로 이용 가능하지 않으며 사내에서 접합되어야 합니다. 따라서 일부 응용 프로그램의 경우 2-단계 1차/2차 염색 프로토콜이 여전히 선호될 수 있으며 프로토콜에 2시간을 추가합니다. 최근 연구에서는 Airyscan 현미경을 적용했습니다.신장디콘볼루션 및 신호 재할당 이미지 처리와 함께 소형 카메라 어레이 검출기의 가변 핀홀 설정을 사용하는 조직
닫힌 핀홀은 이미지의 수학적 후처리 없이도 충분한 해상도를 제공합니다. 이 작업에서 우리는 환자 샘플의 병리 평가를 위한 프로토콜 및 표준 방법에 대한 비교 데이터를 제시합니다. 그러나 분석은 소수의 환자를 대상으로 수행되었으며 프로토콜이 다른 유형의 환자에 존재하는 과다한 병리학적 매개변수를 감지하는 데 사용할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 추가 연구가 중요합니다.신장 질환또한. 이를 달성하려면 병리학자, 샘플 준비 전문가 및 영상 전문가가 모두 참여하는 집중적인 협력 노력이 시작되어야 합니다. 이 철저한 검증은 이 원리 증명 연구의 범위에 포함되지 않았습니다. 이 연구의 목표는 고해상도 이미징을 위한 빠른 광학 프로토콜을 개발하는 것이었습니다.신장.또한 우리 프로토콜의 분해능은 EM의 분해능과 거리가 멀고 예를 들어 원섬유 침착물을 분해할 수 없으므로 어떤 경우에는 정확한 진단을 위해 EM이 여전히 필요하다는 점을 강조해야 합니다.
이 연구에서는 측정된 구조(GBM 또는 FP)의 비직교 광학적 또는 물리적 단면에서 발생하는 단면 아티팩트를 수정하지 않고 원시 길이 측정을 사용했습니다. 이 형식으로 데이터를 표현하는 데에는 2가지 주요 이유가 있습니다. 첫째, 나노 스케일 변경(예: 불규칙한 "울퉁불퉁한" GBM)에 관한 정보를 유지하면서 아티팩트를 절단하는 것은 간단하지 않습니다. 둘째, 투명 샘플에서 항상 이미징 평면을 선택했습니다.
연구 중인 구조가 이미징 평면에 가능한 한 직각으로 정렬됩니다. 따라서 단면화는 무작위가 아니므로 단면화 아티팩트 분석이 더욱 복잡해집니다. 결과적으로, 이 연구에서 제시된 평균 값은 아마도 약간 과대평가되었으며 단면 아티팩트는 산점도의 데이터 확산에 기여합니다. 실제 데이터의 손실 없이 구조의 향후 단면 수정 측정을 위해 직교 절편 방법과 같은 기존 단면 인공물 수정 방법의 수정된 버전이 잠재적으로 적용될 수 있습니다.!920
제거된 파일에서 병리학적 매개변수를 추출하는 기능신장비표지(자가형광) 및 형광표지된 샘플을 모두 사용하는 조직이 최근에 입증되었습니다.-또한, 최근 연구에 따르면 "가상 조직학"은 자가형광 이미지에 대한 딥 러닝 al-for 항목과 신경망 기반 분할 및 신장 병리의 분류도 표시되었습니다. 새로운 이미지 분석 도구와 새로운 샘플 준비 방법(예: 여기에 보고됨)을 병합하면 미래에 많은 흥미로운 디지털 가능성이 제시되며 연구와 클리닉 모두에서 신장 샘플을 상상하고 분석하는 방식의 변화를 보게 될 것입니다.
재료 및 방법 마우스 및 인간 신장 조직모든 마우스 실험은 독일 노르트라인베스트팔렌주 자연환경소비자보호국의 승인을 받았으며 유럽, 국가 및 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 100% C57BL/6N 배경의 마우스를 사용했습니다. 케타민 및 자일라진으로 마취를 유도한 후, 행크 균형 염 용액으로 심장 관류에 의해 마우스를 안락사시키고 하기에 기재된 바와 같이 고정시켰다.
환자 자료는 NPHSI의 점 돌연변이 또는 TRPC6 및 NPHS2의 복합 이형 접합 점 돌연변이로 인해 스테로이드 내성 신증후군을 앓고 있는 2명의 어린이와 국소 분절 사구체 경화증, 최소 변화 질환 및 IgA 신병증으로 진단된 3명의 환자로부터 얻었습니다. , 각각. 대조 인간 조직은 다음으로 인해 신장 절제된 환자로부터 수집되었습니다.신장종양. 비종양성 극에서 해부된 조직 샘플신장일상적인 조직검사에서 정상적인 조직학적 소견을 보였다. 모든 절차는 쾰른 윤리 위원회와 스톡홀름 지역 윤리 위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 해당되는 경우 환자 또는 환자의 보호자가 사전 동의를 제공했습니다.
FSGS용 마우스 모델2개의 화합물-이형접합 점 돌연변이를 갖는 마우스, Pod8asicyAzv는 이전에 설명된 대로 생성되었습니다." 마우스는 위에 설명된 대로 ags 20주에 절단되었습니다.정착인간과 쥐신장실온에서 1-3시간 동안 1X 인산염 완충 식염수 중 4% 파라포름알데히드에 고정했습니다. 신장 절제된 인간신장Dubosaq-Brasil 용액에 3시간 동안 고정하였다.단면화샘플을 3% 아가로스에 포매하고 vibratome을 사용하여 300μm 두께로 절단했습니다.탈지샘플을 500pm에서 진탕하면서 70℃에서 1시간 동안 투명 용액(200mM 붕산 및 4% SDS, pH 8.5)에서 인큐베이션하였다.라벨링라벨링 프로토콜 및 항체/프로브 목록은 보충 자료에 제공됩니다.설치샘플을 500rpm에서 15분 동안 진탕시키면서 37도에서 4M 요소를 함유한 8%의 과당(1ml의 dH, 4g의 과당에 첨가됨)에서 배양한 다음 MatTek 접시(MatTek , Ashland, MA) 이미징 전에 상단에 커버슬립(증발을 방지하기 위해),이미징이미지는 Leica SP8 공초점 시스템(그림 범례에 명시된 목표)(Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL)을 사용하여 획득했습니다. 100× 대물렌즈를 사용한 이미징은 달리 명시되지 않은 경우 항상 03AU(594-nm 광에 대해 계산됨)의 핀홀 설정을 의미합니다. 표준 조직 영상은 Leica DM3000 시스템(그림 5) 또는 Olympus BX45 시스템(Olympus, Tokyo, Japan)(그림 6)을 사용하여 수행되었습니다. 표준 면역형광은 Nikon Microphot-FXA(Nikon, Tokyo, Japan)를 사용하여 수행되었고 EM은 Zeiss 912(그림 5) 또는 Hitachi 7700(Hitachi, Tokyo, Japan)(그림 6) 투과 전자 현미경으로 수행되었습니다.이미지 처리 및 분석달리 명시되지 않는 한 Fiji/ImageJ(National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 각 픽셀 값을 3x3 이웃의 평균으로 대체하여 이미지를 평활화했습니다. 형태 측정 분석은 보충 방법에 설명되어 있고 보충 그림 S4에 나와 있습니다.
