새로운 Netrin{0}}유래 펩타이드는 신경 세포 사멸에 대한 보호를 강화하고 생쥐의 뇌내 출혈을 완화합니다 1부

추상적인:

Netrin{0}}은 중추신경계 손상 후 신경보호에 관여하는 것으로 보고되었습니다. 그러나 신경 보호를 유지하면서 Netrin의 주요 부작용을 피할 수 있는 Netrin-1의 최소 기능 영역은 아직 파악하기 어렵습니다.

중추신경계는 사람의 생각, 감정, 행동을 조절하는 인체의 가장 중요한 신경계 중 하나입니다. 중추신경계가 손상되면 사람들의 기억력도 영향을 받습니다. 하지만 걱정하지 마세요. 기억을 회복하는 데 도움이 되는 몇 가지 긍정적인 방법을 취할 수 있습니다.

먼저, 메모리 손상의 영향을 이해해야 합니다. 중추신경계 손상은 사람의 인지 능력, 사고 과정, 주의력에 영향을 미칠 수 있으며, 이 모두는 사람의 기억에 직접적인 영향을 미칩니다. 또한, 중추신경계의 손상은 정서적 불안정을 야기하여 공황, 불안, 우울증에 걸리기 쉽게 만들어 기억회복에 영향을 미칠 수 있습니다.

그러나 중추 신경계의 손상이 일부 부정적인 영향을 가져올 수 있지만 기억 회복을 촉진하기 위해 몇 가지 긍정적인 조치를 취할 수 있습니다. 먼저, 읽기, 쓰기, 퍼즐 풀기와 같은 인지 훈련을 시도해 볼 수 있습니다. 이러한 활동은 뇌를 자극하여 새로운 뉴런을 생성하고 뇌가 새로운 기억과 사고 방식을 구축하도록 돕습니다.

둘째, 신체 운동을 통해 기억력 회복을 촉진할 수도 있습니다. 연구에 따르면 적절한 운동은 뇌를 자극하여 새로운 뉴런과 뉴런 연결을 생성하고 뇌의 새로운 정보 처리를 촉진할 수 있는 것으로 나타났습니다. 그렇기 때문에 어떤 사람들은 달리거나 걷다가 갑자기 좋은 생각이 떠오르거나 어려운 문제를 해결하기도 합니다.

마지막으로 올바른 영양섭취가 기억에 미치는 역할에 주목할 필요가 있다. 뇌가 정상적으로 기능하려면 단백질, 비타민, 미량 원소와 같은 필수 영양소가 필요합니다. 음식에 이러한 영양소가 부족하면 기억력과 사고력에 영향을 미칩니다. 그러므로 우리는 생선, 살코기, 야채, 과일 등 식단에서 이러한 영양소가 풍부한 음식을 선택해야 합니다.

요컨대 중추신경계의 손상은 사람의 기억력에 어느 정도 영향을 미치게 되지만, 적절한 인지훈련, 신체운동, 식이조절을 통해 기억회복을 촉진할 수 있습니다. 모두가 인생의 도전에 긍정적으로 맞서고 낙관적인 태도를 유지하며 건강한 중추신경계와 좋은 기억력을 회복하기 위해 노력할 수 있기를 바랍니다. 기억력 향상이 필요하다고 볼 수 있는데, 시스탄체는 기억력 향상이라는 독특한 효능이 많은 전통 한약이기 때문에 시스탄체는 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 시스탄체의 효능은 탄닌산, 다당류, 플라보노이드 배당체 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯되며 여러 가지 방법으로 뇌 건강을 증진할 수 있습니다.

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여기에서는 Netrin{1}}의 EGF3 도메인(잔기 407-422)에서 파생된 펩타이드 E1의 신경 보호 효과를 조사했습니다. 우리는 이것이 삭제된 대장암종(DCC)과 상호작용하여 신경 보호를 나타내는 국소 접착 키나아제 인산화를 활성화한다는 것을 발견했습니다.

펩타이드 E1의 투여는 뇌내출혈(ICH) 실험 쥐 모델에서 감소된 세포사멸을 통해 기능적 회복을 향상시킬 수 있었습니다.

요약하면, ICH 후 회복 과정에 관여하는 Netrin-1의 기능적 서열을 밝히고 ICH 치료를 위한 후보 펩타이드를 식별합니다.

키워드: 뇌내출혈; 헤민; 신경보호; 네트린-1; 펩타이드.

1. 소개

뇌내출혈(ICH)은 뇌 내 뇌혈관의 비정상적 파열을 수반하는 사망률과 이병률이 높은 치명적인 뇌졸중 하위 유형입니다[1-3].

지혈을 달성하고 두개내압을 완화하기 위해서는 혈종의 수술적 제거가 선호됩니다[6]. 그러나 잔여 혈액 잔류물과 혈액 분해 생성물은 여전히 ​​ICH 후 이차 뇌 손상을 촉진하여 신경 손상을 유발하고 기능 회복을 지연시킬 수 있습니다[7-9].

따라서 이차 뇌 손상으로 인한 신경 손상을 표적으로 하는 효과적인 전략의 개발은 뇌졸중 치료에 도움이 될 것입니다. Netrin{1}}은 수용체와의 상호 작용을 통해 축삭 유도 및 시냅스 생성을 조절하는 가장 잘 연구된 단백질 중 하나입니다[10-12] 대장암(DCC) 및 UNC5H(비조정-5 상동체)에서 삭제되어 세포 생존, 분화 및 증식을 활성화합니다[13-15].

수용체는 Netrin{0}}이 없을 때 세포사멸을 중재하기 위해 사망 신호를 유도합니다[16]. DCC와 Netrin{2}}의 결합은 DCC의 이량체화를 초래하고 초점 접착 키나제(FAK)의 티로신 861 인산화를 시작하여 신경돌기 성장 및 축삭 유도를 유도하는 것으로 알려져 있습니다[17,18].

Netrin-1과 DCC의 결합은 Netrin-1 신호 전달 경로의 활성화에 Netrin-1의 EGF3 도메인과 DCC의 FN5 도메인을 포함합니다[19,20]. 최근 Netrin-1은 허혈성 부위에서 신경 보호 효과를 발휘하는 것으로 나타났습니다[21].

세포 사멸을 억제하고 신경 재생을 촉진하는 Netrin-1의 혈청 발현 수준은 허혈성 뇌졸중 환자의 회복과 양의 상관관계가 있습니다[22,23].

흥미롭게도 손상된 쥐의 좌골 신경에 Netrin-1을 분비하는 골수 중간엽 줄기 세포를 이식하면 축삭 재생이 시작되고[24] 운동 신경 세포 사멸이 감소합니다[25]. 심실에 Netrin{3}} 단백질을 정위 주입하면 DCC/APPL1/AKT 신호 전달의 활성화를 통해 지주막하 출혈 후 신경 세포 사멸이 감소합니다[26].

Netrin-1(아미노산 423-433)의 EGF3 도메인에서 유래된 폴리펩티드는 ERK 인산화를 현저하게 활성화하고 심장 보호 효과가 있는 NO 생성을 촉진합니다[27,28]. 그러나 Netrin-1은 종양 형성에 대한 잠재적인 바이오마커로 확인되었습니다[29-31]. 왜냐하면 Netrin-1 상태의 조절은 여러 조직 유래 암에서 발견되기 때문입니다[32].

Netrin{0}}이 수용체DCC 또는 Unc5H에 결합되면 수용체는 생존, 염증, 혈관 신생 및 항세포사멸을 유도하는 양성 신호를 전달하여 차례로 종양 형성을 조절합니다[31].

따라서 신경 보호를 유지하고 Netrin{1}}의 주요 부작용을 피할 수 있는 Netrin{0}}의 최소 기능 도메인을 식별하는 것이 매우 중요합니다. 여기서 우리는 펩타이드 E1(잔기 407-422), Netrin-1의 EGF3domain에서 파생된 이 제품은 DCC와 상호 작용하여 헤민 유발 독성으로부터 뉴런을 보호합니다.

ICH 마우스의 실험 모델에서, 행동 분석에 의해 결정된 바와 같이, 펩타이드 E1의 적용은 기능 회복을 향상시켰습니다. 또한, 펩타이드 E1은 ICH 후 뉴런의 퇴행을 예방할 수 있습니다.

이러한 결과를 바탕으로 ICH 후 회복에 관여하는 Netrin-1의 기능적 서열을 확인하고 이 펩타이드가 ICH 치료에 사용될 수 있다고 판단했습니다.

2. 결과

2.1. EGF3 도메인은 Netrin-DCC 상호 작용에 중요합니다.

Netrin{0}}은 VI 도메인, 3개의 EGF 반복 및 C-말단 도메인으로 구성됩니다[33]. 인간 Netrin-1/DCC 복합체의 결정 구조는 Netrin-1 EGF3 도메인이 Netrin-1/DCC 상호작용에 중요하지만 EGF1 및 EGF2 도메인에는 중요하지 않음을 보여줍니다[34].

EGF3 도메인의 주요 아미노산 잔기(His407, Gln442 또는 Gln443)의 돌연변이 유발은 Netrin{4}}/DCC 결합을 완전히 방해했습니다[19]. Unc5가 DCC와 공존할 때 매력적인 신호를 반발 신호로 전환하려면 EGF1/2 도메인이 필요합니다.

따라서 우리는 먼저 전체 길이 및 EGF3-삭제(Netrin-1 Δ407–443) Netrin-1 구문(그림 1A)을 생성하고 GST 풀다운을 위해 배양된 HEK293T 세포에서 이러한 구문을 일시적으로 표현했습니다. .

Netrin-1을 표현했지만 Netrin-1(Δ407–443)을 표현하지 않은 구성에 대해 바인딩이 관찰되었습니다(그림 1C). 이러한 결과는 아미노산 407-443을 포함하는 EGF3 도메인이 Netrin-1과 DCC의 상호작용을 담당한다는 것을 시사합니다. Netrin-DCC에서 EGF3 도메인의 역할을 조사하기 위해 먼저 myc-taggedNetrin{{12 }} 또는 잘린 Netrin-1 (Δ407–443)(그림 1B).

다음으로, HEK293T 세포를 DCC cDNA를 운반하는 플라스미드로 형질감염시키고 Netrin{1}} 단백질과 함께 배양한 후 면역염색을 통해 Netrin{2}} 결합을 평가했습니다.

우리는 전체 길이의 Netrin-1(절단되지 않은 Netrin-1)이 원형질막에서 DCC에 결합할 수 있음을 발견했습니다(그림 1D). EGF3 도메인이 DCC와 상호 작용할 수 있는지 확인하기 위해 DCC를 과발현하는 용해된 세포를 풀다운하는 GST-EGF3 구성을 생성했습니다. 우리는 GST-EGF3과 DCC의 특이적 결합을 관찰했습니다(그림 1E).

또한, 우리는 FITC 표지된 펩타이드EGF3를 합성하고 전장 Netrin-1처럼 혈장 막에서 DCC에 결합할 수 있음을 확인했습니다(그림 1F). 종합해보면, 우리의 데이터는 EGF3 도메인이 Netrin-1과 DCC의 상호 작용을 담당한다는 것을 나타냅니다.

2.2. EGF3 도메인은 Netrin의 하류 경로의 인산화를 유도합니다-1

Netrin{0}}과 DCC의 상호 작용은 FAK, SFK 및 ERK를 포함한 여러 신호 경로를 활성화합니다[16,35]. 국소 접착 키나제(FAK)는 Netrin{3}}/DCC 신호 전달과 관련된 주요 티로신 인산화 활성 중 하나입니다.

Netrin{0}}은 FAK인산화 및 Src 계열 단백질 티로신 키나제(SFK) 인산화를 활성화합니다[17]. FAK 및 SFK 신호 전달 경로는 모두 신경계 및 손상 복구의 발달 단계에서 중추적인 역할을 합니다[36,37]. 더욱이 Netrin{4}}은 MAPK(미토겐 활성화 단백질 키나제) 경로의 작용을 중재하는 세포외 신호 조절 키나제-1/2(ERK1/2)를 활성화할 수 있습니다[38-40].

EGF3 도메인이 Netrin-1과 DCC의 결합을 통한 하류 신호 전달 경로의 활성화에 중요한지 여부를 조사하기 위해 먼저 EGF3 도메인이 FAK의 티로신 861 인산화에 미치는 영향을 조사했습니다(그림 2A). . 우리는 EGF3의 결실이 배양된 피질 뉴런에서 FAK 인산화를 억제한다는 것을 발견했으며(그림 2B, C), 따라서 Netrin{8}} 신호 전달 경로에서 EGF3의 필수적인 역할을 확인했습니다.

다음으로, 배양된 피질 뉴런을 GST-EGF3 융합 단백질로 20분 동안 자극하고, 웨스턴 블롯팅을 통해 GST-EGF3 융합 단백질 처리가 FAK, ERK 및 SFK 인산화를 유도한다는 것을 추가로 확인했습니다(그림 2D-G).

이러한 결과는 Netrin-1의 EGF3 도메인이 하류 신호 전달 경로를 활성화하는 강력한 자극제로 기능함을 시사합니다.

그림 1. Netrin-1의 EGF3 도메인은 Netrin-1/DCC 상호작용에 중요한 영역입니다. (A) Netrin-1구조물의 예시. Netrin-1 구조는 Netrin-1 전체 길이, Netrin-1-(Δ407–443) 및 GST-EGF3입니다. (B) 정제된 Netrin-1-(Δ407–443)-Myc/His를 BSA 표준 곡선과 비교하여 정량화했습니다. (C) GST-DCC FN5 도메인 융합 단백질 및 GST 단독에 의한 풀다운 분획의 면역블로팅. (D) 각각 30분 동안 대조 배지인 Netrin-1-myc/his 및 Netrin{23}}(Δ407–443) -Myc/his와 함께 배양된 293T 세포를 발현하는 Flag-DCC의 면역형광 이미지 및 정량적 분석. 스케일 바, 10μm. (E) GST-EGF3 융합 단백질과 GST에 의한 풀다운 분획의 면역블로팅. (F) 대조군 배지와 함께 배양된 293T 세포를 발현하는 Flag-DCC 및 30분 동안 FITC 라벨링된 Pep EGF3의 면역형광 이미지 및 정량 분석. 스케일 바, 10μm.

그림 2. EGF3 도메인은 Netrin-1의 하류 경로를 활성화합니다. (A) 실험 절차. (B) 피질 뉴런(E17 및 DIV3)은 Netrin-1, Netrin-1-(Δ407-443) 또는 대조 매체로 20분 동안 자극되었습니다. 세포 용해물을 항-p-FAK-861 항체와 함께 배양하여 Netrin-1 활성을 확인했습니다. (C) 웨스턴 블롯 결과의 정량 분석은 (B)에 표시됩니다. n=3. (D) 피질 뉴런(DIV3)을 1.5 μM GST(+), 1.5 μM GST-EGF3 융합 단백질(+) 또는 1.5 μMNetrin-1(+) 배지로 20분 동안 처리했습니다. 세포 용해물을 항-p-FAK-861, 항-p-SFK-418 및 항-p-ERK-202/204와 함께 배양했습니다.(E–G) 서양 세포의 정량 분석 (D)에 표시된 블롯 결과. n=3. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 이 그림에 표시된 모든 통계 분석에는 일원 분산 분석이 사용되었습니다(* p < 0.05, ** p < 0.01; ns, 유의하지 않음). 데이터 분석의 세부 사항은 보충 표 S1에 나와 있습니다.

2.3펩타이드 E1 및 E2는 DCC와 상호작용하여 Netrin의 다운스트림 신호 전달 경로를 활성화합니다.-1

이전에 기술된 바와 같이, Netrin-1(아미노산 423-433)의 EGF3 도메인에서 파생된 작은 펩타이드는 ERK 인산화를 유도했습니다[27]. 우리는 Netrin-1의 EGF3 도메인에서 파생된 펩타이드 E1(잔기 407-422)과 E2(잔기 423-433)를 합성했습니다(그림 3A).

우리는 펩타이드 E1의 배양이 배양 세포에서 용량 의존적으로 인산화된 FAK 및 SFK(그림 3B, D, E)의 수준을 증가시켰지만 인산화된 ERK(그림 3B, F)의 수준은 변경하지 않았음을 발견했습니다.

펩타이드 E1과 달리 펩타이드 E2는 FAK의 티로신 인산화(그림 3C, G)와 SFK의 티로신 인산화(그림 3C, H)를 유도할 뿐만 아니라 배양된 피질 뉴런에서 ERK의 티로신 인산화(그림 3C, I)를 유도했습니다.

대조 펩타이드(Pep Ctrl)는 FAK, SFK 및 ERK의 티로신 인산화에 대해 감지할 수 있는 효과가 없었습니다(그림 S1). 또한, 펩타이드 E1에 의해 유도된 FAK 신호 전달 경로 구성 요소의 인산화는 시간 의존적이라는 것을 관찰했습니다(그림 S1). S2). 이러한 결과는 E1과 E2가 Netrin-1의 최소 기능성 펩타이드임을 나타냅니다.

그림 3. EGF3 도메인의 최소 서열은 Netrin-1의 하류 경로를 활성화합니다. (A) 펩티드의 예시. (B) 피질 뉴런(DIV3)은 펩타이드 E1의 농도 구배로 자극되었습니다. 세포 용해물을 항-p-FAK-861, 항-p-SFK-418 및 항-p-ERK-202/204와 함께 배양했습니다. (C) 배양된 피질 뉴런을 펩타이드 E2의 농도 구배로 처리하였다.

용해물을 수집하고 표시된 항체와 함께 배양하여 FAK, SFK 및 ERK의 인산화를 측정했습니다. (D-F) 뉴런에서 펩타이드 E1에 의해 유도된 FAK, SFK 및 ERK 인산화 정도의 정량화가 (B)에 표시되어 있습니다. n=3. (G-I) 펩타이드 E2에 의해 유도된 FAK, SFK 및 ERK 인산화 정도의 정량화는 (C)에 표시됩니다. n=3. (J) DCC 야생형 및 동형접합체 돌연변이 태아에서 유래된 피질 뉴런을 Netrin{5}} 또는 Netrin{6}} 유래 펩티드로 자극하여 용해시켰습니다.

생성된 용해물에 면역블롯팅을 실시했습니다. (K) FAK PY{{0}} 및 DCC 돌연변이 뉴런의 DCC 수준의 정량화는 (J)에 표시됩니다. n=3. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 이 그림에 표시된 모든 통계 분석에는 일원 분산 분석이 사용되었습니다(* p < 0.05;ns, 유의하지 않음). 데이터 분석의 세부 사항은 보충 표 S1에 나와 있습니다.

FAK 신호 전달 경로의 활성화가 DCC에 의존적인지 여부를 확인하기 위해 DCC+/+ 및 DCC-/- 뉴런에서 이러한 펩타이드에 의해 유도된 FAK의 티로신 인산화 정도를 측정했습니다. 우리는 펩타이드 E1과 E2 모두 DCC-/- 뉴런에서 FAK의 인산화를 유도하지 못했다는 것을 발견했습니다(그림 3J, K).

우리는 또한 합성된 N 말단에 Flag 태그가 붙은 펩타이드 E1과 E2(Flag-E1 및 Flag-E2)가 DCCFN5 도메인과 직접 결합한다는 것을 발견했습니다(그림 S3).

2.4. 펩타이드 E1은 체외에서 헤민에 의해 유발된 세포 사멸로부터 뉴런을 보호합니다

펩타이드 E1의 신경 손상에 대한 보호를 나타내기 위해 우리는 뇌내출혈 후 이차 뇌 손상을 모방하기 위해 aHemin 유도성 독성 반응을 사용했습니다[41,42].

배양된 GnRH 발현 신경 세포(NLT)[43-45]를 다양한 농도와 기간으로 헤민과 함께 배양했습니다. 내측 치사량(60μM)에서 NLT 세포와 헤민의 배양은 시간에 따른 세포 생존율의 감소를 가져왔고, 이는 헤민이 뉴런에 흡수되어 대사되었음을 시사합니다(그림 S4).

Netrin{0}} 및 DCC의 발현이 헤민 유발 신경 세포 사멸에 반응하는지 여부를 조사하기 위해 배양된 NLT 세포를 헤민과 함께 다양한 기간 동안 배양했습니다. 웨스턴 블롯 결과는 Netrin{2}} 및 DCC의 발현 수준이 헤민 인큐베이션 후 6시간에 크게 증가한 후 점차 감소함을 보여주었습니다(그림 4A, B).

펩타이드 E1과 E2가 헤민 유발 신경 세포 사멸을 약화시킬 수 있는지 조사하기 위해 Netrin-1, PepCtrl, 펩타이드 E1 및 펩타이드 E2를 사용하여 CCK{3}} 분석을 수행했습니다.

우리는 이러한 펩타이드가 세포 생존력에 감지 가능한 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 4C 및 그림 S5). Pep Ctrl 및 펩타이드E2를 사용한 인큐베이션과 비교하여 펩타이드 E1 및 Netrin{4}}은 헤민에 의해 유발된 신경 세포 사멸을 개선했습니다(그림 4D). 또한 calcein-AM 및 PI로 염색하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별했습니다.

결과는 Netrin-1과 펩타이드 E1 모두 시험관 내에서 헤민으로 인한 사망을 예방하는 것으로 나타났습니다(그림 4E-G). 또한, 1.5 μM 펩타이드 E1은 1차 배양 뉴런에서 헤민 유발 사망을 완화했습니다(그림4H, I). 종합적으로, 이들 결과는 펩타이드 E1이 헤민에 의해 유발된 세포 사멸로부터 뉴런을 보호한다는 것을 보여주었습니다.

2.5. Netrin-1-유래 펩타이드 E1은 ICH 후 기능 회복을 촉진합니다

Netrin-1에서 유래된 펩타이드 E1이 출혈 뇌졸중 후 기능 회복에 중요한 역할을 하는지 여부를 조사하기 위해 잉크와 혼합된 콜라게나아제를 선조체에 주입하여 실험적 ICH 모델을 확립했습니다(그림 S6A).

3일 후, 뇌 조각의 이미지가 잉크로 주입 위치와 콜라게나제 부피를 추적하는 것으로 나타났습니다(그림 S6B, C). 선조체 출혈이 있는 마우스는 뇌 손상으로 인해 동측에서 약점을 나타냈습니다(그림 S7A-C).

ICH에 따른 선조체의 혈종은 식염수 주입과 비교하여 볼 수 있었습니다(그림 S7D). 혈주위 피질의 Netrin{1}} 및 DCC의 상대적인 단백질 수준은 ICH 마우스에서 대조군 마우스와 비교하여 2일차에 증가했으며 Netrin{3}}은 3일차에 여전히 상당히 높았습니다. 이는 Netrin-1 뇌 손상 회복에 중요합니다(그림 S7E, F).

다음으로, 펩타이드 E1의 N-말단의 TAT 서열이 부가된 FITC-표지된 TAT-펩타이드 E1(FITC-Pep TE1)을 ICH 마우스에 주입하였고, FITC-Pep TE1이 혈액-뇌 장벽을 통과하는 것으로 나타났다( 그림 S8).

ICH 및 대조군 마우스에는 매일 펩타이드(12mg/kg) 또는 동일한 양의 식염수를 복강내 주사했습니다(그림 5A). 우리는 펩타이드 TE1을 투여하면 생존율이 향상되고 ICH 후 체중 결함이 구제된다는 사실을 발견했습니다(그림 5B, C).

우리는 또한 각 그룹에서 동일한 비율의 잉크로 추적된 콜라게나아제 볼륨이 유사하다는 것을 발견했으며, 콜라게나아제의 표준 ICH 모델이 재현 가능한 선조체 내 혈종을 초래했음을 확인했습니다(그림 5D). 펩타이드 TE1은 테이프 제거 테스트에서 ICH 마우스의 행동 점수를 개선했습니다(그림 5E). ) 및 실린더 테스트(그림 5F).

예상대로, 펩타이드 TE1은 ICH 후 경색량을 감소시켰습니다(그림 5G, H). 종합해 보면, 이들 결과는 펩타이드 E1이 ICH의 마우스 모델에서 혈종 부피를 감소시키고 기능 회복을 향상시킬 수 있음을 시사합니다.

그림 4. 펩타이드 E1은 체외에서 헤민에 의해 유발된 세포 사멸을 개선합니다. (A) Hemin(60 μM)에 노출된 배양된 NLT 세포에서 Netrin-1 및 DCC의 웨스턴 블롯. (B) 웨스턴 블롯 결과의 정량 분석은 (A)에 표시됩니다. n=3. (C) CCK-8 분석은 시리즈 펩타이드가 세포 생존 가능성을 변화시키지 않음을 보여주었습니다. n=4. (D) 1.5 μM Pep E1은 헤민(60 μM)에 노출된 후 잘 첨가될 때 NLT 세포 생존성을 보존했습니다. n=4. (E) 헤민(6{30}} μM,6h)에 노출된 NLT 세포의 라이브(녹색)/죽은(빨간색) 분석. 스케일 바, 50μm. (F, G)(E)에서 라이브/죽은 분석의 정량 분석. n=9. (H) CCK-8 분석은 Pep E1이 일차 배양 뉴런에서 헤민 유발 세포 사멸을 감소시킬 수 있음을 보여주었습니다. n=8.(I) 일차 배양 뉴런의 Live/Dead 분석 영상(50 μM, 6시간). 스케일 바, 50μm. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 이 그림에 표시된 모든 통계 분석에는 일원 분산 분석 또는 양방향 분산 분석이 사용되었습니다(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns, 유의하지 않음). 데이터 분석의 세부 사항은 보충 표 S1에 나와 있습니다.

그림 5. Netrin-1- 유래 펩타이드 E1은 ICH 후 회복 과정을 촉진합니다. (A) 마우스의 ICH 모델링에서 펩타이드 TE1의 복강내(IP) 주입 실험 패러다임의 개략도. (B) 각 그룹의 ICH 후 생존율을 기록하고 Kaplan-Meier 방법을 사용했습니다. n=10. (C) ICH 후 5일째 체중 변화. n=6.(D) C57 마우스의 선조체에 동일한 비율의 잉크(총 0.6 μL)를 주입한 콜라주/식염수 혼합물, 잉크 영역을 보여주는 대표적인 이미지는 다음으로 처리된 마우스에서 유사했습니다. ICH 후 펩타이드 TE1 5일 없음. (E, F) 펩타이드 TE1(12mg/kg)의 IP 주입(TAT(12mg/kg) 제어 제외)은 테이프 제거 작업(E) 또는 코너 작업(F)에 의해 모니터링된 동작을 개선했습니다.

식염수,n=10마리의 개별 동물; ICH, n=6마리의 개별 동물; ICH + TAT, n=6 마리의 개별 동물; ICH + TE1, n=8 마리의 개별 동물. (G) ICH 후 펩타이드 TE1 5 일 후에 펩타이드 TE1 5 처리 여부에 관계없이 처리된 마우스의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색 섹션. 스케일 바, 1mm. (H) (G)에 표시된 뇌 섹션의 출혈량 정량.

식염수, n {{0}}마리의 개별 동물; ICH, n=6마리의 개별 동물; ICH + TAT, n=6 마리의 개별 동물; ICH + TE1, n=8 마리의 개별 동물. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 이 그림에 표시된 모든 통계 분석에는 일원 분산 분석 또는 양방향 분산 분석이 사용되었습니다(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; ns, 중요하지 않음). 데이터 분석의 세부 사항은 보충 표 S1에 나와 있습니다.

2.6. Netrin-1-유래 펩타이드 E1은 ICH 후 신경세포 사멸을 감소시킵니다

ICH의 기능적 회복 과정에서 펩타이드 E1의 기본 메커니즘을 탐색합니다. 우리는 FJC(Fluoro-Jade C) 염색을 통해 혈주위 부위의 신경 변성을 발견했습니다.

우리는 펩타이드 TE1의 투여가 혈관 주위종 영역에서 FJC 양성 세포의 수를 크게 감소시키는 것을 발견했으며, 이는 pep TE1이 ICH 후 신경 변성을 억제한다는 것을 나타냅니다(그림 6A, B). 우리는 TUNEL 염색을 수행하여 펩타이드 TE1이 TUNEL 양성 뉴런의 수를 크게 감소시키는 것을 발견했습니다(그림 6C, D).

TUNEL 양성 성상교세포의 수는 펩타이드 TE1 처리 후 감지할 수 없는 변화였습니다(그림 6E, F). 또한, 혈액뇌장벽(BBB)의 투과성을 나타내기 위해 FITC 표지된 4 kDa 덱스트란을 추적자로 사용함으로써 펩타이드 TE1이 BBB 투과성 회복에 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 S9A, B).

혈청 원시 형광 단위(RFU) 수준은 유사하여 분석된 모든 동물에서 주입된 추적자의 존재를 확인했습니다(그림 S9C). 우리는 또한 플루오레세인 표지 렉틴을 사용하여 미세혈관에 라벨을 붙였으나 TE1 처리 후 개선을 관찰하지 못했습니다(그림 S9D, E). 무엇보다도, 이러한 발견은 펩타이드 E1이 신경 세포 사멸을 억제함으로써 ICH 후 신경 회복을 촉진한다는 것을 시사합니다.

그림 6. Netrin{1}} 유래 펩타이드 E1은 ICH 후 신경 세포 사멸 및 변성을 방지할 수 있지만 성상교세포는 보호할 수 없습니다.(A) ICH 후 5일에 TE1을 처리하거나 처리하지 않은 생쥐의 대표적인 Fluoro-jade C 염색 절편. 스케일 바, 각각 50μm 및 10μm. (B) 혈액 주위 영역(n{10}})에서 Fluoro-jade C 양성 세포의 정량. (C) ICH 발병 ​​후 5일째에 2차 뇌 손상(SBI)에 대한 TE1의 효과를 보여주는 TUNEL 염색. Saline, ICH, ICH + TAT 및 ICH + TE1 그룹의 대표 이미지.

식염수 그룹을 제외한 각 그룹은 ICH 대상이 되었습니다. 스케일 바, 각각 50μm 및 10μm. (D) TUNEL 양성 뉴런의 백분율에 대한 정량 분석은 (C)에 표시됩니다. n=4. (E) ICH 후 5일째에 TUNEL과 GFAP의 공동 국소화. Saline, ICH, ICH + TAT 및 ICH + TE1 그룹의 대표 이미지. 스케일 바, 각각 50μm 및 10μm. (F) TUNEL 양성 성상교세포의 백분율에 대한 정량 분석은 (E)에 표시되어 있습니다. n=4. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다.

이 그림에 표시된 모든 통계 분석에는 일원 분산 분석이 사용되었습니다(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, 중요하지 않음). 데이터 분석의 세부 사항은 보충 표 S1에 나와 있습니다.

3. 토론

우리 연구에서는 ICH 후 기능 회복에 중요한 Netrin-1의 핵심 펩타이드 서열을 확인했습니다. DCC와 상호작용함으로써 이 Netrin{1}} 유래 펩타이드는 ICH 후 2차 손상으로 인한 신경 세포 사멸을 방지하므로 ICH에 대한 유망한 치료법입니다.

고분자량 단백질인 Netrin-1의 치료 적용에는 하류 신호 전달을 촉진하는 Netrin{3}}의 최소 기능적 서열의 식별이 필요합니다. 본 연구에서는 각각 Netrin-1의 EGF3 도메인에서 파생된 펩타이드 E1(잔기 407~422)과 E2(잔기 423~433)가 생성되었습니다. 우리는 ICH 후 신경 세포 사멸로부터 보호되는 펩타이드 E1(잔기 407-422)을 발견했습니다.

우리는 헤민 처리 후 NLT 세포에서 Netrin{0}} 및 DCC 발현 수준이 증가하는 것을 발견했습니다. 헤민은 ICH 후 헤모글로빈에서 방출되어 교세포와 신경 세포 모두에 2차 손상을 유발합니다[46-48].

또한 실험적 ICH 이후 Netrin-1 및 DCC의 단백질 수준이 증가하는 것도 관찰되었습니다. 또한 실험적 ICH 이후 네트린-1 및 DCC의 단백질 수준이 증가하는 것을 관찰했습니다.

이러한 결과는 netrin{0}}이 ICH 후 회복에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 이전 결과와 일치합니다[49].

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