잘린 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S1 하위 단위를 포함하는 아데노바이러스 백신은 생쥐에서 특정 면역 반응을 유발합니다
Dec 12, 2023
압스트라CT:효율적이고 안전한 코로나바이러스 2019(COVID-19) 백신 개발은 현재 상황을 고려할 때 중증 급성 호흡기 질환 코로나바이러스 2(SARS-CoV{4}}) 대유행을 관리하기 위한 중요한 접근 방식입니다. 이 연구에서 우리는 잘린 S1 단백질을 인코딩할 수 있는 최적화된 SARS-CoV{6}} 스파이크 유전자(2043 bp, S1이라고 함)의 단축된 세그먼트를 생성했습니다. 이 단백질은 생쥐에서 SARS-CoV-2에 대해 효율적인 면역화를 유도할 수 있는지 확인하기 위해 테스트되었습니다. S1 단백질의 존재는 면역형광법과 웨스턴 블롯팅으로 확인했습니다. S1 유전자 단편(Ad-S1)을 함유한 아데노바이러스 백신을 4주에 걸쳐 4회 마우스에게 근육내 투여했습니다. SARS-CoV-2 S1 단백질 체액성 면역은 모든 면역화된 마우스에서 입증되었습니다. 면역화된 생쥐의 혈청은 시험관 내에서 탁월한 항감염 활성을 나타냈습니다. Ad-S1 백신 접종 후 생쥐에서 SARS-CoV-2에 대한 강력한 체액성 면역 반응이 관찰되었는데, 이는 아데노바이러스 백신이 SARS-CoV-2 및 기타 유전적으로 구별되는 백신 개발에 도움이 될 수 있음을 시사합니다. 바이러스.
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키워드: SARS-CoV-2; 백신; 아데노바이러스 벡터; S1 유전자; 면역
1. 소개
코로나바이러스감염증 2019(COVID{1}})는 다발성 장기 부전 및 높은 사망률과 관련이 있는 경우가 많으며[1] 전 세계적으로 공공 안전에 큰 위협이 됩니다. 2022년 7월 15일 현재 코로나{5}} 대유행은 전 세계적으로 지속되고 있으며, 세계보건기구(WHO)에 보고된 사망자 수는 6,358,899명을 포함해 확인된 사례는 557,917,904명입니다. 또한, 2022년 7월 11일 현재 총 12,130,881,147개의 백신 용량이 투여되었습니다. 따라서 새로운 코로나바이러스(nCoV) 백신을 설계하고 개발하는 것은 매우 중요하며 세계 보건의 최우선 과제 중 하나입니다. S 단백질은 SARS-CoV-2 중증 급성 호흡기 질환 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)가 숙주 세포로 유입되는 핵심 요소입니다[2,3]. 이 단백질은 숙주 수용체에 결합하여 바이러스가 숙주 세포에 원활하게 들어갈 수 있도록 해줍니다[4]. N-연결된 글리칸은 삼량체 표면에서 돌출되어 S 단백질을 광범위하게 장식하여 S 단백질 접힘, 체액성 면역 및 숙주 세포 프로테아제 처리에 영향을 미칩니다[5]. SARS-CoV-2 S 단백질은 다른 인간 병원성 코로나바이러스 유발 S 단백질보다 N-연결 글리칸 밀도가 낮습니다[6]. 따라서 S 단백질은 면역원성이 높을 수 있으며 중화 항체의 주요 표적입니다. S 단백질은 3개의 구조적 도메인을 갖고 있으며, 그 중 S1 도메인이 가장 중요한 S 단백질 표면 항원이다[4]. 대규모 재조합 단백질(단백질 S의 세포외 도메인은 약 1300개 아미노산)을 생산하기 어렵고 감염의 항체 의존성 강화(ADE) 위험으로 인해 S1(약 700개 아미노산) 및 수용체 결합 도메인 (RBD, 약 200개 아미노산)은 코로나바이러스 백신의 가장 매력적인 잠재적 표적으로 널리 간주됩니다[7,8]. 인간 아데노바이러스 혈청형 5(HAdV-C5)는 유전자 치료 및 백신 전달 벡터로서 기본 바이러스학에서 널리 사용됩니다[9]. HAdV-C5는 자연적으로 다양성을 갖고 있으며 대부분의 숙주에 기생할 수 있어 동물 실험 개발의 기초가 됩니다. HAdV-C5로부터 구축된 복제성 및 복제 결함을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터는 백신 전달 및 유전자 치료에 널리 사용되어 왔다[9,10]. 현재 아데노바이러스는 급성 호흡기 감염에 대한 백신으로 승인되었으며 말라리아 및 HIV와 같은 백신에 대한 많은 시험이 있었습니다-1 [9]. 본 논문에서는 SARS-CoV-2 인간 복제 불능 아데노바이러스 벡터 백신과 그 제조 및 적용에 대해 설명합니다. 본 연구에서 아데노바이러스 백신은 다음과 같이 구성되었습니다: 벡터는 E1 및 E3 결실이 있는 인간 복제 결함 아데노바이러스 HAdV-C5이고, 골격 플라스미드는 pBHGloxΔE1,3Cre를 갖는 재조합 아데노바이러스였으며, 패키징 세포주는 HEK293 세포였습니다. 표적 유전자는 SARS-CoV-2의 절단된 S1 단백질 유전자였습니다. 백신에서의 S1 단백질 발현은 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석에 의해 확인되었습니다. 스파이크 기반 백신 후보물질에 의해 유도되는 면역반응의 질을 확인하기 위해, 백신접종 후 항체반응을 자세히 조사하였다. 백신의 면역효과는 결합항체 시험(효소결합면역흡착시험법[ELISA])과 중화항체 시험을 통해 평가됐다. 우리의 연구 결과는 S1 단백질을 기반으로 한 코로나19 백신과 치료법의 개발과 평가를 위한 기초를 제공합니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 세포와 동물
HEK293 및 Vero E6 원숭이 신장 세포주가 이 연구에 사용되었습니다. 두 세포주 모두 2% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 37℃, 5% CO2 및 포화 습도에서 배양되었습니다. 20마리의 암컷 C57BL/6 마우스(6~8주)를 절강성 절강동물실험센터에서 구입했습니다. 마우스는 각 그룹에 10마리의 마우스를 포함하여 무작위로 두 그룹으로 나뉘었습니다. 한 그룹은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(Ad{16}}S)을 발현하는 Ad5 벡터로 면역화되었고(100μL 복강 내 주사), 다른 그룹은 대조군으로 PBS(100μL 복강 내 주사)로 면역화되었습니다. 바이러스의 총량은 5×109 VP였다. 모든 마우스는 D0/D14 근육 주사로 면역화되었다[11,12]. D14에 말초혈액 100μL를 채취하여 혈청을 분리한 후 채혈 2시간 후 2차 주사를 실시하였다. D28에 안와후천자에 의해 혈액을 수집하고 혈청을 분리하였다. 결합 항체는 각 혈액 수집 후 3일에 검출되었고, 중화 항체는 각 혈액 수집 후 7일에 검출되었으며, 사이토카인은 두 번째 혈액 수집 후 7일에 검출되었습니다. 모든 생쥐는 안락사되었습니다. 모든 테스트는 "중화인민공화국 실험동물 관리 및 사용 지침"에 따라 엄격하게 수행되었으며 절강수인대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
2.2. 백신
본 연구에 사용된 모든 SARS-CoV-2 변종은 동의를 얻어 코로나-19 환자로부터 수집되었습니다. 전염병 진단 및 치료를 위한 국가 핵심 연구소는 SARS-CoV-2에 대한 아데노바이러스 백신(Vero 세포, WuHan 균주, GISAID 번호: EPI_ISL_415711)을 개발했으며 이후 백신은 생물안전성 수준(BSL)을 준수하는 환경에서 제조되었습니다. 백신 사양은 0.5 mL/용량이며 Tris, NaCl, 사탕수수 설탕, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, 무수 에탄올 및 SARS-CoV-2 S1 단백질을 포함합니다.
2.3. 재조합 아데노바이러스 구축
SARS-CoV-2 S1 단백질 서열(번호 QRU91950.1)은 PubMed에서 입수했습니다. 유전자 축퇴성에 따라 SARS-CoV-2 S1 단백질이 코딩하는 산물 단백질의 아미노산 서열이 변하지 않는다는 전제를 바탕으로 포유류 세포 발현에 적합한 최적화된 코돈 뉴클레오티드 서열을 설계했습니다. 총 길이는 2043bp였습니다. 50개의 전구체 서열은 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)로 합성되었으며 SARS-CoV-2 S1 아미노산 2-688을 코딩하는 서열과 tPA 전구체 서열이 결찰되었습니다. Kozak 서열과 SpeI 제한 부위를 시작 코돈 앞에 추가하고 XbaI 제한 부위를 종료 코돈 뒤에 추가했습니다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열을 합성하고 Sangon Biotech에서 pUC18에 클로닝하여 합성 유전자의 클로닝된 플라스미드를 얻었다. 합성된 S1 유전자 서열 및 벡터 pDC316을 제한 엔도뉴클레아제 SpeI 및 XbaI로 분해하였다. 표적 단편 및 벡터를 겔로부터 회수하고 연결하여 셔틀 플라스미드를 형성하였다. SARS-CoV-2 셔틀 플라스미드는 HEK293 세포의 공동 형질감염을 통해 AdMax 아데노바이러스 시스템 골격 플라스미드 pBHGloxdΔE1 및 3Cre와 함께 포장되었습니다. 동결-해동과 원심분리를 반복하여 1차 바이러스 용액을 얻었으며, 플라크 정제 후 바이러스를 증폭 및 배양하였다.
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2.4. 아데노바이러스 역가의 결정
건강이 양호한 HEK293 세포를 선택하고 재현탁하여 5.0 × 105 세포/mL 세포 현탁액을 제조하고 이를 24-웰 플레이트(1 mL/well)에 파종했습니다. ) 5% CO2 환경에서 37oC에서 배양되었습니다. 샘플을 10배 연속 희석하고 10-5 ~ 10-8 세포의 희석 샘플(0.1 mL)을 24-웰 플레이트에 접종했습니다. . 그런 다음 플레이트를 48시간 동안 5% CO2, 37oC에서 감염에 노출시켰습니다. 이어서, 배양 배지를 제거하고 미리 냉각된 메탄올(0.5 mL)을 첨가한 후 시료를 -20℃에서 20분간 고정시켰다. 고정 후 샘플을 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고 1% 소 혈청 알부민(BSA, 0.2mL)으로 37℃에서 1시간 동안 차단했습니다. 다음으로, 1차(Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) 및 2차(Goat pAb to MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) 항체를 첨가하고 1시간 동안 PBS를 배양했습니다. 세탁에 사용되었습니다. 인큐베이션 후 새로 준비된 작업 용액(0.2 mL)을 추가하고 실온에서 5~10분 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 작업 용액을 버리고 샘플을 PBS로 세척한 후 PBS(1 mL)를 다시 첨가했습니다. 현미경 필드(cat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope)의 평균 양성 세포 수를 계산했습니다. 여기서 시야에서 5~50개의 양성 세포가 있는 구배를 선택하고 최소 5개 영역을 무작위로 선택하여 계산했습니다. . 24-웰 플레이트의 각 웰의 시야 수를 계산했습니다. 그 후, 하기 수학식 1에 따라 바이러스 역가를 계산하였다:
2.5. 실시간 PCR
바이러스 감염 후 HEK293 세포 mRNA 발현을 검출하기 위해 TRIzol 작동 지침(Invitrogen, Waltham, MA, USA)에 따라 중간 RNA를 추출했습니다. TRIzol을 사용하여 총 RNA를 추출하고 RQ1 RNase-free DNase I (Promega, Madison, WI, USA)로 처리하여 잔류 DNA를 제거했습니다. gDNA Eraser Kit(Takara, Kusatsu, Japan)가 포함된 PrimerScript™ RT Reagent Kit를 사용하여 추출된 RNA를 역전사하여 상보성 DNA(cDNA)를 얻었습니다. 표적 유전자(S1)의 특정 프라이머 P1(50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) 및 P2(50 -GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30)를 사용하여 DNA 단편을 생성했습니다. 유전자는 내부 대조(GAPHD)로서 프라이머 P3(50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) 및 P4(50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30 )를 사용하여 증폭되었습니다.
2.6. 웨스턴 블롯
세포 용해물과 상등액을 SDS-PAGE(나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)로 분리한 후 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드) 막으로 옮겼습니다. 블롯은 웨스턴 블롯 이미징 장비(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 시각화되었습니다. 간략하게, 막을 TBST(50mL Tris-HCl, pH 7.5, 8g NaCl [0.5mL], 0.2g KCl, 0.5mL Tween으로 옮겼습니다. -20) 5% 무지방 분유를 첨가하고 탈색 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 흔듭니다. 실험군과 대조군의 막을 밀봉액에서 꺼내어 1차 항체인 [SARS-CoV-2(2019-nCoV) 스파이크 항체(1:5000, cat. #40591- T62, Sino Biological, Beijing, China)] 실온에서. 1차 항체를 흔들어서 4°C의 탈색 진탕기에서 밤새 배양했습니다. 블롯을 TBST 용액으로 헹구고 2차 항체[염소 항토끼 면역글로불린 G(IgG) H&L(HRP)(1:10,000, 카탈로그 #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]와 함께 2시간 동안 배양했습니다. 헹군 후 블롯을 LumiBest ECL Substrate 솔루션 키트(cat. #4AW011-100, 4A Biotech)로 1분 동안 배양한 다음 이미저에서 관찰했습니다.
2.7. 면역형광 분석
HEK293 세포(3 × 106/웰)를 12-웰 플레이트에 접종했습니다. 48시간 후, S1 유전자(Ad-S1)를 함유한 아데노바이러스로 세포를 감염시켰다. 48시간 후, 배지를 흡인하고, 세포를 2% BSA가 함유된 PBS로 1회 세척한 후, -20℃에서 15분간 미리 냉각해 둔 메탄올로 15분간 고정시켰다. PBS에 용해된 2% BSA로 3회 세척한 후, 세포를 0.5% Triton X-100로 10분간 투과화시켰습니다. 그 후, 세포를 2% BSA 2 mL로 1시간 동안 차단하고, 차단 용액을 버리고, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 2 mL 1차 항체 [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 스파이크 항체(1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)]를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 또는 4℃에서 밤새 배양합니다. 그런 다음, 샘플을 헹굼당 5분 동안 2% BSA로 3회 헹구었습니다. 다음으로, 2 mL 2차 항체[염소 항토끼 IgG H&L(Alexa Fluor 488)(1:1000, 카탈로그 번호 550037, ZenBio)]를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 이어서, 샘플을 헹굼당 5분 동안 2% BSA로 3회 헹구었습니다. 40,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액(2mL, 1mg/mL)(1:400, 카탈로그 #S0001, Bioss, Woburn, MA, USA)을 각 웰에 첨가했습니다. 어둠 속에서 10분 동안 반응시켰다. 분석은 EVOS™ M7000 이미징 시스템(카탈로그 #AMF7000, Invitrogen)을 사용하여 관찰되었습니다.
2.8. 엘리사
SARS-CoV-2 S 단백질(1 µg/mL)을 96-웰 플레이트(100 µL/well)에서 0로 밤새 코팅했습니다. 05M 중탄산염 완충액. PBST(0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4·12H2O, 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.5 mL Tween-20, 물을 1000 mL에 첨가)으로 세척한 후 5 그런 다음 차단 용액을 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 혈청 샘플을 희석하여 각 웰에 첨가했습니다(100μL/웰). 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 샘플을 PBST로 5회 세척했습니다. 1차 항체 [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)]를 첨가하고 1시간 동안 배양한 후 샘플을 PBST로 5회 세척한 후 양 고추 냉이 퍼옥시다제 결합 2차 항체[염소 항토끼 IgG H&L(HRP)(1:10,000, 카탈로그 #ab6721, abcam)]와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하고 5회 배양했습니다. PBST로 세척합니다. 3, 30, 5 및 50-테트라메틸비페닐무수물을 5분간 첨가한 후 2M 황산으로 반응을 정지시켰다. 광학 밀도는 효소 표지 기기(Molecular Devices, SpectraMax 190)를 사용하여 450 nm 및 630 nm에서 측정한 후 표준 곡선에 맞춰졌습니다.
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2.9. 사이토카인 결정
플레이트(cat. #T-k15048D-1, MSD)를 150 µL/well 세척 완충액으로 3회 세척하고 준비된 샘플 50 µL를 각 웰에 첨가했습니다. 그런 다음 플레이트를 접착 플레이트 씰로 밀봉하고 실온에서 2시간 동안 진탕하면서 배양했습니다. 다음으로, 플레이트를 150μL/웰 세척 완충액으로 3회 세척하고, 25μL의 검출 항체 용액을 각 웰에 첨가했습니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 실온에서 진탕하면서 2시간 동안 배양하였다. 다음으로, 플레이트를 최소 150μL/웰 세척 완충액으로 3회 세척했습니다. 150 µL 2× Read Buffer T (MSD)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 MSD 기기에서 분석했습니다.
2.10. 중화항체
2.10.1. 슈도바이러스 중화 분석
마우스 혈청 중화 활성은 수포성 구내염 바이러스 슈도바이러스 시스템(VSV)을 사용하여 테스트되었습니다. 혈청을 수조에서 56°C의 {{0}.5시간 동안 비활성화한 후 필요한 범위로 연속 희석했습니다. HEK293 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅했습니다. 희석된 혈청을 200 CCID50(세포 배양액의 50%를 감염시킬 수 있는 바이러스 용량)/100 µL의 바이러스 현탁액을 1:1 비율로 혼합하여 CO2 인큐베이터(37±1℃)에 넣어 두었습니다. 2시간 다음으로, 0.5% 페니실린-스트렙토마이신 이중 항체가 함유된 바이러스 유지 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 중화된 혼합물을 세포가 들어 있는 96-웰 플레이트에 웰당 100 μL씩 접종하였고, 2개의 반복 웰을 사용하였다. 각 희석. 동시에, 정상 세포 대조군을 설정하고 세포를 CO2 인큐베이터(37±1℃)에서 96시간 동안 배양하였다. 그런 다음 200 CCID50/100 µL의 바이러스 용액을 10-1~10-3로 희석했습니다. 96-웰 플레이트의 세포 배양 배지를 버리고 각 웰에 바이러스 유지 용액 150μL를 첨가한 후 바이러스 용액 희석액을 10-1~{{33} 농도로 접종했습니다. }를 96-웰 플레이트(웰당 50μL)의 웰에 넣습니다. 각 희석은 8개 웰에서 반복되었습니다. 정상 세포 대조군을 동시에 설정한 후 96시간 동안 배양했습니다. 세포 CPE의 변화를 도립현미경으로 관찰했습니다. 정상 세포 대조군에는 세포변성 변화가 없어야 하며, 양성 대조군에는 CPE 변화가 있어야 합니다. 중화 종점(로그로 변환된 혈청 희석)은 CPE를 관찰하여 계산되었습니다. 혈청음성/양성 기준은 양성/음성 기준으로 1:12이었으며,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive.
2.10.2. 실시간 중화 분석
생쥐 혈청 중화활성은 생중화시험으로 평가하였다. 희석된 혈청을 SARS-CoV-2와 혼합하고 37oC에서 1시간 동안 배양했습니다. 혼합물을 96-웰 플레이트에 첨가하여 Vero E6 세포를 감염시켰습니다. 37°C에서 72-시간 동안 배양한 후 바이러스 세포변성 효과(CPE)를 40배율로 관찰하고 중화 역가(바이러스 감염을 중화하는 데 필요한 50% 혈청 희석의 역수)를 계산했습니다. 위의 절차는 모두 생물안전성 3등급 환경에서 수행되었습니다.
2.11. 통계 분석
통계 분석은 SPSS 26을 사용하여 2-표본 t-검정으로 수행되었습니다. p-값이 0.05 이하인 경우 유의미한 것으로 간주되었습니다. 중심 경향은 기하 평균 역가(GMT)로 측정되었습니다.
3. 결과
3.1. 재조합 아데노바이러스 구축
올바르게 삽입된 재조합 아데노바이러스 셔틀 플라스미드 pAdeno-CMV-S1이 얻어졌습니다. 그 구조 다이어그램은 그림 1에 나와 있습니다. 재조합 아데노바이러스에는 E1/E3 영역이 없는 HAdV-C5 게놈이 포함되어 있습니다. HEK293 세포에서 셔틀 플라스미드와 세포골격 플라스미드 형질감염을 통해 얻은 재조합 아데노바이러스 벡터의 모식도를 도 1에 나타내었다.
3.2. 재조합 아데노바이러스의 특성화
표적 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드는 PCR에 의해 확인되었습니다(겔 전기영동 결과는 그림 2A 참조). 이것은 반복된 실험이었습니다. 프라이머 서열은 MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag 및 S1-R acaataagtagggactgggtc였으며, 서열분석을 통해 설계와 일치하는 서열을 확인하였다. 세포에서의 SARS-CoV-2 S1 발현은 웨스턴 블롯팅(그림 2B) 및 간접 면역형광법(그림 2C)을 통해 검출되었습니다. 밴드 착색(~75 kDa)은 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었으며 예상된 밴드 위치와 일치했습니다. 전사 수준에서 S1의 시험관 내 발현은 PT-PCR에 의해 검출되었습니다. 그 결과, HEK-293 세포에서 S1 mRNA의 발현이 대조군에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났다.
그림 1. 재조합 아데노바이러스 백신의 구축 및 실험 전략. (A) pAdeno-CMV-S1은 표적 유전자 S1을 포함하는 재조합 아데노바이러스 셔틀 플라스미드입니다. pBHGloxΔE1,3Cre는 아데노바이러스 골격 플라스미드입니다. pBHGloxΔE1,3Cre 및 pAdeno-CMV-S1은 QIAGEN 플라스미드 추출 키트(Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Beijing, China)를 사용하여 추출되었습니다. 형질감염 하루 전, HEK293 세포를 25 cm2 세포 배양 플라스크에 계대배양했습니다. 배양배지는 항생제가 포함되지 않은 5% FBS를 함유한 DMEM을 사용하였다. 둘째 날에는 세포의 60~80%를 선택하고 형질감염 용액을 세포에 첨가했습니다. 형질감염 7일 후, 세포를 긁어내고 원심분리한 후 상층액을 버리고 PBS로 세포를 소생시켰다. 세포는 -80°C와 37°C에서 반복적으로 동결-해동되었습니다. 원심분리 후 상청액에는 1차 바이러스 용액이 포함되어 있습니다. 재조합 아데노바이러스 균주를 정제, 증폭하고 추가 처리 후 얻어 Ad-S1로 지정했습니다. 후속 연구를 위해 백신을 마우스에 근육 주사했습니다. (B) 묘사된 예방접종 및 혈액 철수의 시간 척도.
3.3. 아데노바이러스 역가
본 실험에서는 5개의 현미경 시야에서 평균 6개의 양성 세포를 계산하였고, 웰 내 바이러스를 108배로 희석하였다. 재료 및 방법 섹션에 설명된 공식에 따라 아데노바이러스 역가는 4.74 × 1011 플라크 형성 단위(pfu)/mL였습니다(그림 2D).
3.4. 백신 접종 후 세포 면역
테스트 기간 동안 혈청 사이토카인(p 0.05 이하)에서 통계적으로 유의미한 변화가 있었는데, 이는 주로 각질세포 화학유인물질/인간 성장 조절 종양유전자(KC/GRO)의 농도가 감소하고 IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10}의 농도가 감소했습니다. } 및 TNF-는 증가한 반면, IL-6의 농도는 크게 변하지 않았습니다(그림 3).
그림 2. 재조합 HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 단백질의 식별 및 아데노바이러스 역가 결정. (A) 표적 유전자 S1을 갖는 재조합 플라스미드의 PCR 검출. (B) SARS-CoV-2의 웨스턴 블롯 검출. 지수 성장 HEK293 세포를 SARS-CoV-2에 48시간 동안 감염시킨 다음 SDS-PAGE를 통해 세포 단백질을 추출하고 분리했습니다. SARS-CoV-2 발현은 염소 항토끼 IgG를 이용한 Western blotting으로 확인되었습니다. (C) Ad-S1(녹색)에 감염된 HEK-293 세포의 면역형광 현미경. 세포를 40, 6-디아미디노- 2-페닐인돌(DAPI)로 대비염색하여 핵을 염색했습니다. 스케일 바 1000μm. (D) 플라크 분석을 측정에 사용했습니다. 10-5, 10-6, 10-7 및 10-8 희석을 묘사하는 현미경 사진(왼쪽에서 오른쪽으로).
그림 3. Ad-S1은 1/2형 사이토카인, 1형 인터페론 및 기타 사이토카인의 혈장 수준 변경을 유도했습니다. 첫 번째 면역화 후 7일째에 마우스에서 혈액을 채취하여 결과를 확인했습니다. 데이터는 상자 및 수염 산점도로 표시됩니다. 각 원은 한 개인을 나타냅니다. p-값은 2-표본 t-검정을 사용하여 계산되었습니다.
3.5. 예방접종 후 항SARS-CoV-2 S1 항체 검출
ELISA에서는 첫 번째 및 두 번째 Ad-S1을 주사한 마우스에 SARS-CoV{1}}특이적 항체가 존재했지만 대조 아데노바이러스 캡시드 또는 PBS 용액(Ad/PBS)을 주사한 마우스에는 존재하지 않았음을 확인했습니다(그림 4A). 1:210과 1:212의 IgG 역가는 Ad-S{10}}백신을 접종한 마우스에서 각각 1차 및 2차 면역 2주 후에 검출되었습니다. 백신 접종 후 28일째의 희석 역가(D28, GMT 2297.4)는 D14(GMT 378.9)의 희석 역가보다 6.1-배 더 높았습니다.
그림 4. Ad-S1은 마우스에서 높은 항체 역가(A)와 중화 활성(B, C)을 유도했습니다. (A) Ad-S1- 면역화된 마우스의 SARS-CoV-2-특이적 혈청 IgG의 ELISA. (B) Ad-S1-면역화된 마우스의 혈청의 슈도바이러스 활성 분석. (C) Ad-S{10}}면역된 마우스의 혈청 중화 활성 분석
3.6. 중화 항체 분석
Vero E6 세포의 SARS-CoV-2 챌린지는 면역화된 마우스 혈청에서 중화 활성의 검출을 가능하게 했습니다(그림 4B, C). SARS-CoV{{1{27}}}} 생체 외 공격에 대한 Ad-S1-면역화된 Vero E6 세포의 D14 및 D28 중화 역가는 각각 1:24.3 및 1:26.3이었습니다. 슈도바이러스 분석은 생 바이러스 분석과 유사한 결과를 나타냈으며, D14 및 D28에 각각 최대 1:28.1 및 1:29.6의 중화 역가를 나타냈습니다. D28 슈도바이러스 중화 역가(GMT 769.0)는 D14(GMT 283.7)에 비해 2.{29}}배 높았습니다.
4. 토론
We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 ~<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.
본 연구에서 우리는 SARS-CoV-2 S1 서브유닛을 포함하는 재조합 아데노바이러스 SARS-CoV-2 백신을 제작하고 이를 Ad-S1로 지정했습니다. 마케팅 승인을 받은 CanSinoBIO와 마찬가지로[28] 이 백신에는 HAdV-C5를 사용했습니다. 아데노바이러스는 재조합 유전자 치료 및 백신 벡터로 널리 사용됩니다. 그러나 HAdV-C5의 혈청양성률은 정상인의 75~80%에 달한다[29]. 이는 HAdV-C5 벡터에 대한 저장 전 면역이 백신 유발 면역을 크게 감소시킨다는 것을 의미합니다. 영국 옥스포드 대학에서 개발된 ChAdOx1 nCoV-19는 침팬지 아데노바이러스 벡터를 사용하는데, 이와 대조적으로 인간에서는 혈청양성률이 낮고, 양성일 경우 일반적으로 혈청 항체 역가가 더 낮습니다[30] . 따라서 기존 면역을 회피할 수 있는 아데노바이러스 벡터를 탐색하여 아데노바이러스 백신의 보호 효능을 강화할 수 있습니다. 본 연구에서는 면역화 전과 후의 생쥐의 혈청 상태를 ELISA 및 중화 테스트를 통해 확인했으며 백신 후보에 대한 체액성 면역의 증거를 얻었습니다. 쥐에게 백신을 근육 주사한 후 생성된 혈청은 시험관 내 SARS-CoV-2 감염으로부터 Vero E6 세포를 효과적으로 보호했습니다(그림 4). 우리는 또한 두 번째 예방접종 후 생쥐에서 더 강력한 면역 반응과 더 나은 보호를 발견했습니다(그림 4). 우리의 실험 결과는 주류 실험 결과와 유사합니다.
SARS-CoV-2 연구가 계속됨에 따라 SARS-CoV-2 감염에 따른 이차적인 사이토카인 폭풍이 T 세포 생산에 영향을 미쳐 환자가 장기간 면역을 유지하기 어렵게 한다는 여러 연구 결과가 나타났습니다. SARS-CoV-2 [31]. 따라서 Ad-S1이 마우스에서 T세포 매개 면역을 유도할 수 있는지 여부를 판단하는 것이 필요하다. 우리의 결과는 Ad-S1 그룹에서 IFN- 및 IL-12 농도가 증가하고 IL-4 농도가 감소하는 것을 보여주었습니다. 이는 백신에 의해 유발된 Th1 세포 생존 및 생쥐 성장을 나타냅니다. Th1 세포에 의한 IL-12, IL-10 및 TNF- 분비는 실험군에서 약간 증가했습니다. 이러한 결과는 Ad-S1이 쥐에서 Th{26}} 편향된 T 세포 반응을 효과적으로 유도했음을 나타냅니다[32]. 증가된 IL-5은 Th2 세포도 면역 반응에 참여하고 특정 효과를 생성한다는 것을 나타냅니다. 실험군의 KC/GRO 농도는 PBS 대조군에 비해 현저히 감소했는데, 이는 호중구 화학주성이 감소하여 염증 반응이 억제되고 백신 부작용이 약간 조절되었기 때문일 수 있다. 이는 노인이나 화학요법을 받는 환자 등 면역력이 저하된 사람들에게 더 유익할 것입니다. 리 M., 외. [29]는 Ad68을 벡터로 사용하여 아데노바이러스 백신을 개발했습니다. 그 결과, BALB/c 마우스의 근육주사 면역 후 2주 이내에 SARS-CoV-2의 생체 내 중화 활성이 검출된 후 계속 증가했으며, 8시에 중화 항체 역가(PRNT ID50)가 957.3에 도달한 것으로 나타났다. 주. 한편, Liu J., et al. [33], AdC6 및 AdC68을 벡터로 사용하는 백신이 개발되었습니다. 면역화 후 결합 및 중화 항체 반응은 모두 투여 후 14일에 생성되었으며, IgG 역가는 7108(기하 평균 역가, GMT; AdC6) 및 5489(GMT, AdC68)였습니다. 슈도바이러스 중화 분석의 중화 역가 50(NT50)은 125(GMT, AdC6) 및 67(GMT, AdC68)이었습니다.
cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.
본 연구에서 Ad-S1로 백신 접종한 생쥐는 각각 1차 및 2차 면역 접종 2주 후 ELISA에 의해 검출된 1:1{32}}10 및 1:122의 IgG 역가를 나타냈습니다. ad-s1의 희석역가는 접종 후 14일째에 378.9(GMT)이었고, 접종 후 28일째에는 2297.4(GMT)였다. 중화 항체 테스트에서 Ad-S1로 면역화된 Vero E6 세포는 시험관 내에서 살아있는 SARS-CoV-2 바이러스 공격에 대해 D14 및 D28에서 각각 1:24.3 및 1:26.3의 중화를 나타냈습니다. D14 및 D28에서의 슈도바이러스의 중화 역가는 각각 283.7(GMT) 및 769.0(GMT)이었다. 따라서 본 연구의 백신은 마우스 모델의 면역 반응 측면에서 더 효과적이었습니다.
실험 조건의 한계로 인해 실험 쥐의 비장 면역 세포에 대한 ELISpot(효소 결합 면역 흡착 지점) 분석을 수행하지 않았습니다. 또한 생쥐를 대상으로 한 SARS-CoV-2 공격 방어 실험은 물리적 방호 실험실의 한계로 인해 수행할 수 없었습니다. 그러나 우리는 이 백신이 마우스 모델에서 높은 효능을 가지며 이상적인 예비 백신 균주로 사용될 수 있다고 판단했습니다. 또한, SARS-CoV-2 백신 후보의 면역원성, 안전성 및 유효성은 추가적인 동물 모델(예: 토끼, 영장류, 너구리, 개)에서 검사되어야 합니다. 마우스 모델은 인간 면역학적 특성을 완전히 복제하지 못할 수 있기 때문입니다. 특징.
시스탄체 식물의 면역 체계 증가
5. 결론
아데노바이러스 백신에 대한 전임상 연구에서 얻은 데이터는 해당 백신이 충분한 안전성과 유효성을 가지고 있음을 입증했습니다. 따라서 이는 SARS-CoV-2 감염에 대한 유망하고 실행 가능한 예방 백신이 될 수 있습니다.
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