4. 재료 및 방법

4.1. 식물 재료

이 연구에 사용된 아프리카 S. 아우레아 종자는 이탈리아의 전문 매장에서 구입했습니다. 묘목은 칼리아리 대학(UNICA)의 식물 생물학 및 약학 식물학 연구실에서 재배되었습니다. 5주 후 종의 생태생리학적 필요에 따라 "Planta Medica" 온실에 두었습니다. 그런 다음 개화 기간에 2년 동안 성장한 후 식물을 수집했습니다. 공중 부품은 완전히 건조될 때까지(일정한 무게에 도달했을 때) 공기 강제 환기 오븐(FD 115, BINDER)에 즉시 두었습니다. 바우처 표본은 바우처 번호(6/23.8/V1)로 이탈리아 칼리아리 대학의 식물표본관 카라리타눔(CAG)에 기탁되었습니다.

Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 리포푸신 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼의 강력한 소거 능력, 비타민 C보다 높은 환원 능력, 정자 현탁액에서 SOD의 활동을 개선하고 MDA의 함량을 감소시키며 정자 막 기능에 대한 특정 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리학적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력이 있으며 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼로 인한 콜라겐 분해를 방지하는 능력이 있으며 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 우수한 복구 효과도 있습니다.

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4.2. 에센셜 오일 분석

에센셜 오일은 유럽 약전 가이드라인에 따라 Clevenger 유형 장치를 사용하여 3시간 동안 수첨 증류하여 얻었습니다[89]. 불꽃 이온화 검출(GC-FID) 및 가스 크로마토그래피/질량 분석법(GC-MS)을 사용한 가스 크로마토그래피에 의한 후속 분석은 [13]에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해서, GC 분석을 위해 HP 5 캐필러리 컬럼을 사용하여 60°C에서 246°C까지 3°C/min의 속도로 각각 다른 온도에서 82분 동안 실험 절차를 수행한 다음 20분 동안 246ºC. 헬륨(순도 99.9999% 이상)을 운반 기체로 1mL/분의 유속으로 사용했습니다. 총 1μL의 희석된 샘플(n-헥산 중 1:100, w/w)을 1:20 분할 비율로 자동 시료 주입기에 의해 주입했습니다. MS 조건은 240°C 이송 라인, 200°C EI 이온 소스 및 150°C 사중극자 온도를 사용했으며 이온화 에너지는 70eV, m/z of scan에서 3.2 scans-1 범위(30에서 480까지). MSD ChemStation 소프트웨어(Agilent, rev. E.01.00.237, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 크로마토그램과 질량 스펙트럼을 관리하고 정교화했습니다. 마지막으로, 얻어진 화합물은 NIST02와 Adams 라이브러리 비교[37,38]에 의해 확인되었다. 화합물의 실험 보유 지수(RI)를 RI가 문헌에 보고한 반극성 상과 비교하여 결과를 추가로 교차 확인했습니다. 실험적 RI는 n-알칸의 두 가지 표준 혼합물을 참조로 사용하여(각각 C8–C20 및 C21–C40) 선형 보간법을 사용하여 결정되었습니다[90]. 보고된 구성 요소의 백분율은 FID 응답 계수 수정 없이 GC 피크 영역에서 계산되었습니다.

4.3. 항진균 작용

S. aurea EO 항진균 활성에 대해 7개의 피부사상균 균주를 테스트했습니다. 각각, 손톱 및 피부 분리로부터 세 가지 임상 균주를 얻었다: Epidermophyton floccosum FF9, Trichophyton mentagrophytes FF7 및 Microsporum canis FF1. 나머지 4개의 피부사상균 균주는 CECT(Colección Espanõla de Cultivos Tipo)에 속하지만 T. mentagrophytes var. interdigital CECT 2958, T. rubrum CECT 2794, T. verrucosum CECT 2992 및 M. gypseum CECT 2908. 모든 균주는 순도와 생존력을 보장하기 위해 각 테스트 전에 Sabouraud dextrose agar(SDA) 또는 Potato dextrose agar(PDA)에서 배양되었습니다.

EO의 최소 억제 농도(MIC)와 최소 치사 농도(MLC)는 미세희석을 위한 CLSI 프로토콜에 의해 제안된 수정에 따라 수행되었습니다[91]. 간단히 말해, EO를 DMSO(5–0.32 µL/mL)로 희석한 다음 멸균 테스트 튜브에 추가했습니다. 접종물은 탁도를 0.5 McFarland로 조정한 다음 글루타민 없이 3-(N-모폴리노) 프로판 설폰산(MOPS) pH 7{-1640이 있는 RPMI-1640로 희석하여 준비했습니다.{ {10}}을 1–2 × 104 CFU/mL의 농도로 만든 다음 EO가 들어 있는 시험관에 추가했습니다. 그런 다음 튜브를 30ºC에서 7일 동안 배양했습니다. 그 후, 튜브를 진균 성장에 대해 평가하고, 성장이 관찰되지 않는 가장 낮은 농도를 최소 억제 농도(MIC)로 간주하였다. 음의 튜브를 30ºC에서 7일 동안 SDA에 도금한 후 성장이 관찰되지 않는 최저 농도를 최소 치사 농도(MLC)로 간주했습니다. 참조 항진균 화합물인 플루코나졸(Pfizer)을 사용하여 테스트한 미생물의 민감도를 조절했습니다. 결과는 중복으로 수행된 3개의 독립적인 실험으로부터 얻어졌으며 결과는 평균으로 표현되었다. 최대 DMSO 농도(1%)를 갖는 접종되지 않은 배지 및 접종된 배지로 각각 대표되는 음성 및 양성 대조군도 포함되었다.

4.4. 항염 작용

4.4.1. 세포 배양

American Type Culture Collection(ATCC TIB-71)에 속하는 마우스 백혈병 대식세포 RAW 264.7 세포주는 이전에 우리 그룹에서 보고한 대로 배양되었습니다[92].

4.4.2. 산화질소 생산

NO 생성은 Griess 시약을 사용하여 배양 상등액의 질산염 농도를 평가하여 평가했습니다[93]. 세포(0.6 × 106 세포/웰)를 48-웰 배양 플레이트에서 배양했습니다. 대식세포를 하룻밤 동안 안정화시킨 다음 DMSO에 희석한 EO(0.08–1.25 μL/mL)로 1시간 동안 전처리한 다음 24시간 동안 50ng/mL의 LPS로 활성화했습니다. LPS로 자극된 대식세포와 미처리 대식세포를 각각 양성 대조군과 음성 대조군으로 사용하였다. Griess 반응은 이전에 우리 그룹 [92]에서 설명한 대로 수행되었습니다. 사용된 최고 농도(0.4%)의 DMSO는 이미 우리 그룹에서 항염증 또는 세포독성 활성이 없는 것으로 나타났습니다(데이터는 표시되지 않음).

4.4.3. 전 염증성 단백질, iNOS 및 COX의 발현-2 

RAW 264.7 세포(1.2 × 106 세포/웰)를 6-웰 플레이트에서 배양하고 밤새 안정화시켰다. 그런 다음, 이들 세포를 1.25 μL/mL 농도의 EO와 함께 1시간 인큐베이션한 후, 24시간 동안 LPS 활성화(50 ng/mL)하였다. 음성 대조군은 처리되지 않은 세포로 구성되었고, 양성 대조군은 LPS 처리된 세포로만 구성되었다. 세포 용해물 준비는 이전에 Zuzarte 등이 수행한 프로토콜을 따랐습니다. [92]

Inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase{{0}} (COX-2) 함량은 이전에 설명한 대로 Western blot 분석으로 평가했습니다[13]. 단백질 분리를 위해 130V에서 10%(v/v) SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용한 전기영동 실행을 1.5시간 동안 수행했습니다. 결과적으로 단백질 라인을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(미리 메탄올로 활성화됨)에 400mA에서 3시간 동안 블롯팅했습니다. 그런 다음 막을 TBS-T에서 5%(w/v) 탈지유와 함께 비특이적 IgG와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 특정 항-iNOS(1:500; R & D Systems) 또는 항-COX-2(1:5000; Abcam, Cambridge, UK) 항체와 함께 4ºC에서 하룻밤 더 배양했습니다. . 마지막으로 TBS-T(10분, 3회)로 30분 동안 세척하고 2차 항체(1:40,000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. ) 고추냉이 과산화효소와 결합. 면역복합체 검출은 화학발광 스캐너(Image Quant LAS 500, GE, Boston, MA, USA)로 수행하였다. 튜불린에 대한 항체(1:20,000; Sigma, St. Louis, MO, USA)를 로딩 대조군으로 사용하였다. ImageLab 소프트웨어 버전 6.1.0(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)을 단백질 정량에 사용했습니다.

4.5. 세포 이동

마우스 배아 섬유아세포 세포주 NIH 3T3(ATCC CRL-1658)은 ​​이전에 [6]에서 설명한 대로 배양되었습니다.

4.5.2. 세포 이동 분석

세포 이동은 Martinotti et al. [94] 이전에 보고된 [13]과 같이 약간 수정했습니다. 간략하게, NIH 3T3 섬유아세포를 2.5 × 105 세포/mL로 시딩하고 컨플루언시(confluency)에 도달하도록 했습니다. 그 후, 200 μL 피펫 팁으로 상처를 가하고 비부착 세포를 PBS pH 7.4로 세척하여 제거하였다. EO(1.25µL/mL)가 추가되거나 추가되지 않은 2% FBS가 포함된 DMEM. 위상차 현미경을 사용하여 스크래치 후 0, 12, 18시간에 이미지를 획득하고 ImageJ/Fiji 소프트웨어를 사용하여 상처 부위를 측정했습니다. 제시된 결과는 다음 방정식을 사용하여 얻었습니다.

4.6. 세포 생존력

이전에 보고된 바와 같이, 대식세포 및 섬유아세포의 생존력에 대한 상이한 농도의 EO의 효과를 레자주린 감소 분석법을 사용하여 평가하였다[6].

4.7. 에토포사이드 유도 노화

노화는 다른 곳에서 보고된 [95]와 같이 노화 유도제로 에토포사이드를 사용하여 일부 수정하여 평가되었습니다. 간략하게, 에토포시드의 24시간 후, 세포를 S. 아우레아 EO의 존재 또는 부재(CT)에서 72시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 베타-갈락토시다아제는 제조업체의 프로토콜(#9860, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA)에 따라 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 평가되었습니다. 뚜렷한 파란색 염색은 베타-갈락토시다제 활성을 나타냅니다. 발색 후, 후속 이미지 분석을 위해 웰을 촬영했습니다. ImageJ 소프트웨어는 노화 세포의 백분율을 평가하여 정량 분석에 사용되었습니다.

4.8. 통계 분석 

실험은 세 번의 독립적인 실험에 대해 적어도 이중으로 수행되었습니다. 평균값 ± SEM(평균의 표준 오차)이 결과에 표시됩니다. 항염증, 세포 생존력 및 노화 분석에 대한 통계적 유의성은 일원 분산 분석(ANOVA) 및 GraphPad Prism 버전 9.3을 사용하는 Dunnett의 사후 테스트로 평가했습니다.0(GraphPad Software, San Diego, CA , 미국). 세포 이동 분석에 대한 통계적 유의성은 양방향 ANOVA와 Sydák의 다중 비교 테스트를 사용하여 평가되었지만 p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 받아들여졌습니다.

5. 결론

이 작업은 일반적으로 Salvia spp에 기인하는 유익한 효과를 강화합니다. S. aurea에 기인한 전통적인 용도 중 일부를 검증함으로써. 또한, 1,8 cineole, -pinene, cis-thujone, camphor, (E)-caryophyllene, trans-thujone, -pinene, camphene, -humulene을 주성분으로 하는 단일 화학조성을 공개하였다. 우리는 여기에서 EO가 항진균, 항염증 및 상처 치유 효과를 나타내어 피부 감염, 염증 관련 질병 및 상처 치료를 위해 이 종과 관련된 전통적인 용도를 검증했다고 보고합니다.

또한 본 연구를 통해 처음으로 이 종이 항노화 효과를 발휘할 수 있음을 보고하여 이 종에 대한 관심을 더욱 높였다. 따라서 이러한 결과는 염증 및 피부 관련 감염을 완화하는 S. aurea의 역할을 강조하여 더모 화장품에 대한 관심을 강화합니다. 본 연구는 재배를 통해 관련 생물학적 활성을 가진 고부가가치 대사산물의 생산이 촉진될 수 있음을 보여주었지만, 유전적 및 환경적 요인에 따른 화학적 프로필의 극심한 변동성을 고려하여 재배된 식물에 대한 정확한 화학적 분석이 필수적입니다. (스트레스, 토양 특성, 수확 시기).

저자 기여:LS 및 AM; 검증, DM, EC, MJG, MTC 및 SP; 공식 분석, JMA-S., MJG 및 AP; 조사, JMA-S., AM 및 AP; 자원, AM, MTC 및 LS; 데이터 큐레이션, AP; 작문 - 원본 초안 준비, EC, DM, JMA-S., AP 및 AM; 쓰기 - 검토 및 편집, EC, DM, MTC, LS 및 AM; 시각화, JMA-S.; 감독, LS 및 AM; 프로젝트 관리, LS; 자금 조달, LS 및 MTC 모든 저자는 원고의 게시된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.

펀딩: 이 작업은 COMPETE 2020—경쟁력 및 국제화를 위한 운영 프로그램 및 FCT를 통한 포르투갈 국가 기금—Fundação para a Ciência ea Tecnologia, 프로젝트 UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020 및 LA/P/0058/에 따라 재정 지원되었습니다. 2020.

감사의 말: 저자는 기술 지원에 대한 International Study and Language Institute(The University of Reading, UK, d.standen@reading.ac.uk)의 Daniela Standen의 소중한 공헌에 감사를 표합니다.

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