5.2. 에센셜 오일 분석

Hydrodistillation에 의한 에센셜 오일의 분리는 Clevenger 유형 장치에서 3시간 동안 수행되었습니다[64].

Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 리포푸신 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼의 강력한 소거 능력, 비타민 C보다 높은 환원 능력, 정자 현탁액에서 SOD의 활동을 개선하고 MDA의 함량을 감소시키며 정자 막 기능에 대한 특정 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리학적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력을 가지고 있으며 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼로 인한 콜라겐 분해를 방지하며 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 우수한 복구 효과도 있습니다.

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오일 분석은 가스 크로마토그래피(GC) 및 가스 크로마토그래피/질량 분석법(GC/MS) 모두에 의해 수행되었습니다. GC 분석은 30 m × 0.25 mm id와 0.25 µm 고정 장치가 장착된 가스 크로마토그래프(Agilent 7890A, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 필름 두께 HP-5 모세관 컬럼(Agilent J&W, Santa Clara, CA, USA). 다음과 같은 온도 프로그램이 사용되었습니다: 60ºC에서 246ºC까지 3ºC min-1의 속도로 246ºC에서 20분 동안 유지(총 분석 시간 82분). 다른 작동 조건은 다음과 같다: 캐리어 가스 헬륨(순도 99.9999% 이상 - Air Liquide, Milan, Italy); 유속, 1.0mL.min-1; 인젝터 온도, 250ºC; 감지기 온도, 300ºC. 자동 시료 주입기(Agilent, Model 7683B, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 1:20 분할 비율로 희석된 시료 1µL(n-헥산 중 1:100, w/w)를 주입했습니다.

GC-MS 분석은 30 m × 0.25 mm id와 0.25 µm 고정 필름 두께 HP{ {7}}ms 모세관 컬럼(Agilent J&W, Santa Clara, CA, USA)은 전자 이온화 장치, EI 및 사중극자 분석기(Agilent 5973, Santa Clara, CA, USA)를 갖는 질량 선택 검출기와 결합됩니다. 온도 프로그램 및 크로마토그래피 작동 조건(검출기 제외)은 GC-FID에 사용된 것과 동일합니다. MS 조건은 다음과 같습니다. MS 전송 라인 온도 240ºC; EI 이온 소스 온도, 200 ◦C, 이온화 ​​에너지 70 eV; 사중극자 온도 150ºC; 스캔 속도, m/z 스캔 범위에서 3.2 scans.s-1, (30 ~ 480). 크로마토그램과 질량 스펙트럼을 처리하고 처리하기 위해 MSD ChemStation 소프트웨어(Agilent, rev. E.01.00.237, Santa Clara, CA, USA)를 사용했습니다. GC/MS 시스템의 NIST02 라이브러리 데이터와 Adams 라이브러리의 질량 스펙트럼과 비교하여 화합물을 식별했습니다[32,33]. 결과는 문헌[32]에 보고된 반극상에 대한 머무름 지수와 함께 화합물의 용리 순서와 비교하여 추가로 확인되었습니다. 구성 요소의 머무름 지수는 일련의 n-alkanes(C8–C20 및 C21–C40 표준 혼합물)의 머무름 시간과 선형 보간을 통해 결정되었습니다[65]. 개별 구성 요소의 백분율은 FID 응답 계수 보정 없이 GC 피크 면적을 기반으로 계산되었습니다. 결과는 개별 피크의 백분율 ± 두 개의 독립적인 크로마토그래피 실행의 표준 편차로 표시됩니다.

5.3. 항진균 작용

S. cacaliifolia 정유의 항진균 활성은 사상균 및 효모에 대해 평가되었습니다. 손발톱과 피부에서 분리된 임상 피부사상균 3종(Epidermophyton floccosum FF9, Trichophyton mentagrophytes FF7 및 Microsporum canis FF1), Colección Espanõla de Cultivos Tipo(T. mentagrophytes var. interdigital CECT 2958, T. rubrum CECT)에서 분리된 4종의 피부사상균 유형 균주 2794, T. verrucosum CECT 2992 및 M. gypseum CECT 2908), 하나의 Cryptococcus neoformans 유형 균주(C. neoformans YPO186), 재발성 외음부 사례에서 분리된 두 개의 임상 칸디다 균주(C. krusei LF33, C. guillermondii MAT23) 및 3개의 칸디다 유형 균주(C. albicans ATCC 10231, C. tropicalis YPO128 및 C. paraphimosis ATCC 90018). 모든 균주는 -80 ºC에서 20% 글리세롤이 포함된 Sabouraud dextrose broth에 저장되었고 최적의 성장 조건과 순도를 보장하기 위해 각 테스트 전에 Sabouraud dextrose agar(SDA) 또는 Potato dextrose agar(PDA)에서 계대 배양되었습니다.

CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) 참조 프로토콜 M38-A2 [66] 또는 M27-A3 [67] 사상균 및 효모 각각. MIC는 접종된 시험관에서 생육이 관찰되지 않는 최저농도이며, MLC는 모든 음성관의 SDA 접종 후 생육이 관찰되지 않는 최저농도이다. 음성(비접종 배지) 및 양성(1% DMSO가 포함된 접종 배지) 대조군도 포함되었습니다.

5.4. 항염 작용

American Type Culture Collection(ATCC TIB-71)에서 얻은 마우스 백혈병 대식세포주인 RAW 264.7은 이전에 우리 그룹에서 보고한 대로 배양되었습니다[22].

NO 생성은 Griess 시약[68]을 사용하여 배양 상청액에 축적된 아질산염을 정량화하여 측정했습니다. 세포(0.6 × 106 세포/웰)를 48-웰 배양 플레이트에서 배양했습니다. 밤샘 안정화 후 대식세포를 DMSO에 희석한 에센셜 오일(0.08–1.25 μL/mL)로 1시간 동안 전처리한 다음 50 ng/mL의 LPS로 활성화했습니다. 24시간 양성(LPS 자극 대식세포) 및 음성 대조군(미처리 대식세포)을 수행했습니다. 이 배양 기간 후, 동량의 배양 상층액과 Griess 시약[0.1%(w/v) N-(1-나프틸) 에틸렌디아민 디하이드로클로라이드와 5%( w/v) H3PO4]를 혼합하고 어두운 곳에서 30분 동안 배양했습니다. 550 nm에서의 흡광도는 자동 플레이트 판독기(Agilent, Santa Clara, CA, USA)에 기록되었고 아질산 농도는 아질산나트륨 표준 곡선에서 결정되었습니다. 사용된 최대 농도(0.4%)의 DMSO는 이미 우리 그룹에서 항염증 및 세포독성 효과가 없음을 입증했습니다(데이터는 표시되지 않음).

RAW 264.7(1.2 × 106개 세포/웰)을 6-웰 플레이트에서 배양하고 12시간 동안 안정화시켰다. 다음으로, 세포를 정유(0.64μL/mL)와 함께 1시간 동안 배양한 다음 LPS(50ng/mL) 활성화를 24시간 동안 배양했습니다. 음성 대조군(미처리 세포) 및 양성 대조군(LPS만 처리된 세포)을 고려하였다. Zuzarte et al.에 의해 이전에 기술된 바와 같이 세포 용해물을 제조하였다. [22].

inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase{{0}} (COX-2)의 단백질 수준을 측정하기 위해 Western blot 분석을 수행하였다. 단백질을 130V에서 1.5시간 동안 SDS-폴리아크릴아미드 10%(v/v)에서 전기영동하여 분리하고 400mA에서 3시간 동안 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(이전에 메탄올로 활성화됨)으로 옮겼습니다. 실온에서 1시간 동안 TBS-T에서 5%(w/v) 우유로 비특이적 IgG를 차단한 후 멤브레인을 iNOS(1:500; R & D Systems) 또는 COX{{15} } (1:5000; Abcam, Cambridge, UK), 4 ºC에서 하룻밤. 다음으로 막을 TBS-T로 30분 동안 세척하고(10분, 3회) 실온에서 1시간 동안 2차 항체(1:40,000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)와 함께 배양했습니다. , USA) 양고추냉이 과산화효소와 결합. 화학발광 스캐너(Image Quant LAS 500, GE, Boston, MA, USA)를 사용하여 면역복합체를 검출하였다. 동일한 양의 단백질이 로딩되도록 보장하기 위해 항튜불린 항체(1:20,000; Sigma)로 멤브레인을 조사했습니다. ImageLab 버전 6.1.0(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)을 사용하여 단백질 정량을 수행했습니다.

5.5. 세포 이동

NIH 3T3, 마우스 배아 섬유아세포 세포주(ATCC CRL-1658)는 이전에 우리 그룹에서 설명한 대로 배양되었습니다[69].

5.5.2. 세포 이동 분석

Martinotti와 동료[70]가 보고한 스크래치 상처 분석법을 약간 수정하여 세포 이동을 수행했습니다. 간략하게, NIH 3T3 섬유아세포를 12-웰 플레이트에 2.5 × 105개 세포/mL로 시딩했습니다. 성장 24시간 후, 20–200 µL 피펫 팁을 사용하여 세포 단층에서 스크래치를 수행했습니다. 멸균 PBS 1x로 세포를 세척하여 탈착된 세포를 제거하였다. 에센셜 오일의 존재 또는 부재 하에 2% 세럼이 포함된 DMEM을 모든 플레이트에 첨가했습니다. 위상 수축 현미경을 사용하여 스크래치 후 0, 12 및 18시간에 이미지를 획득하고 ImageJ/Fiji 소프트웨어를 사용하여 상처 부위를 측정했습니다. 제시된 결과는 다음 방정식을 사용하여 얻었습니다.

5.6. 세포 생존력

대식세포와 섬유아세포 모두의 생존력에 대한 다양한 농도의 에센셜 오일의 효과는 resazurin reduction assay를 사용하여 수행되었습니다. 간단히 말해서, 대식세포({0}.6 × 106개 세포/mL) 또는 섬유아세포(1.25 × 105개 세포/mL)를 48-웰 플레이트에 시딩했습니다. 밤새 안정화한 후 DMSO에 희석한 다양한 농도의 에센셜 오일(0.08–1.25µL/mL)을 24시간 동안 첨가했습니다. 실험이 끝나면 배지를 제거하고 resazurin(1:10)을 포함하는 신선한 배지를 대식세포와 섬유아세포 각각 1시간 또는 4시간 동안 첨가하였다. 620 nm의 참조 필터를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 자동 플레이트 판독기(Agilent, Santa Clara, CA, USA)에 등록했습니다. 세포 생존력은 다음 방정식을 사용하여 결정되었습니다.

여기서 AbsExp는 다양한 실험 조건에서의 흡광도(570nm와 620nm의 차이)이고 AbsCT는 대조 세포(에센셜 오일 없음)의 흡광도입니다.

5.7. 에토포사이드 유도 노화 

제조사의 프로토콜(Cell Signaling Technology)에 따라 상업적으로 이용 가능한 베타-갈락토시다아제 염색 키트를 사용하여 노화를 평가했습니다. 간단히 말해서, 2.5 × 104개의 섬유아세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고 밤새 부착되도록 했습니다. 다음으로 세포를 12.5 μM의 etoposide로 24시간 배양하여 노화를 유도하였다. Etoposide를 제거하고 세포를 PBS 1x로 세척하였다. 다음으로 세포를 S. cacaliifolia 에센셜 오일의 부재 또는 존재 하에 DMEM에서 72시간 동안 회복되도록 두었고 형태의 변화를 매일 평가했습니다. 72시간 후, 세포를 1x 고정액(상업용 키트에 제공됨)을 사용하여 15분 동안 고정한 다음 PBS로 세척하고 CO2 공급 없이 37°C의 건조 인큐베이터에서 베타-갈락토시다아제 염색 용액과 함께 밤새 배양했습니다. 파란색 발색을 위해 현미경으로 다양한 필드를 관찰하고 이미지 분석을 위해 사진을 찍었습니다(조건당 8개 이미지). 뚜렷한 파란색 염색은 베타-갈락토시다제 활성을 나타냅니다. ImageJ를 이용하여 정량분석을 하였으며, 전체 세포에 대한 노화세포의 비율을 계산하였다.

5.8. 통계 분석

결과는 이중으로 수행된 적어도 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균값 ± SEM(평균의 표준 오차)으로 제시된다. 항염증, 세포 생존력 및 노화 검정에 대한 통계적 유의성은 편도 분산 분석(ANOVA)에 이어 GraphPad Prism 버전 9.3을 사용하는 Dunnett의 사후 테스트를 사용하여 결정되었습니다.0(GraphPad Software, San Diego, 캘리포니아, 미국). 세포 이동 분석의 경우 통계적 유의성은 양방향 ANOVA에 이어 Sydák의 다중 비교 테스트에 의해 결정되었습니다. p-값 < 0.05는 중요한 차이를 나타내는 것으로 간주되었습니다.

저자 기여:개념화, LS 및 AM; 검증, AS, MJG, MTC 및 SP; 공식 분석, JMA-S., MJG, AP 및 DF; 조사, JMA-S., AM 및 AP; 자원, AM, EC, MTC 및 LS; 데이터 큐레이션, AP; 작문 - 원본 초안 준비, JMA-S., AP 및 AM; 쓰기 - 검토 및 편집, MTC, LS 및 AM; 시각화, JMA-S.; 감독, LS 및 AM; 프로젝트 관리, LS; 자금 조달, LS 및 MTC 모든 저자는 원고의 게시된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.

자금 조달:이 작업은 UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020 및 LA/P/0058/2020 프로젝트에 따라 COMPETE 2020(경쟁력 및 국제화를 위한 운영 프로그램)과 FCT를 통한 포르투갈 국가 기금(Fundação para a Ciência ea Tecnologia)의 자금 지원을 받았습니다.

데이터 가용성 진술:데이터는 요청 시 제공됩니다.

이해 상충:저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

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