SK-N-SH 신경모세포종 세포막에 대한 퀘르세틴의 유리/불량 효과 파트 2
Apr 29, 2022
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2.2.2. 케르세틴의 항산화 활성
산화 스트레스로부터 막을 보호하는 케르세틴의 효과를 테스트하기 위해 막의 지질 모델이 6.25μM 농도의 케르세틴이 없고(그림 4a) 오존에 노출되는 실험이 수행되었습니다(그림 4b).
오존의 영향으로 두 종속성의 과정, 즉 π{{0}}f(A) 및 Cs-1=f(rn)가 변경됩니다. 오존 함유 하위상에서 단층 확산에 대해 얻은 등온선은 더 작은 기울기와 더 낮은 A 값으로의 이동을 특징으로 합니다. 또한 오존의 영향으로 Cs-1 값이 감소했습니다. 이러한 변화는 약 0.4ppm의 오존 농도에서 가장 컸다.신탄체오존 농도의 추가 증가는 단층 특성의 변화를 증가시키지 않았습니다(그림 4a 삽입).
그림 4. 표면 압력 등온선 및 해당 압축성 모듈러스(삽입)는 완충액에 용해된 표시된 농도의 오존을 포함하는 서브페이즈에 퍼진 신경모세포종 층의 지질 모델입니다. 등온선:(a) 항산화제가 없을 때, (b) 케르세틴(6.25μM)이 있을 때 오존 함유 완충액에 첨가됩니다.
6.25μM 농도의 퀘르세틴이 하위 단계에 도입되었을 때 오존은 r(A) 등온선의 과정에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 그러나 압축 계수의 값은 케르세틴이 없는 경우와 유사하게 오존이 있을 때 변했습니다(그림 4b 삽입).
얻어진 등온선에 기초하여 결정된 단층을 특성화하는 매개변수의 수치 값은 표 3에 제시되어 있다.
표 3. 단층 Alim 및 Cs-I의 표면 매개변수는 서브페이즈 상의 신경모세포종 막 확산 모델의 단층에 대해 계산되었으며, 케르세틴(6.25μM)의 부재 및 존재하에 완충액에 용해된 표시된 농도의 오존을 포함했습니다. 데이터는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타냅니다. 다른 문자는 상당한 차이를 나타냅니다(p 0.05 이하).
오존이 존재하면 조밀하게 채워진 단층에서 분자당 표면적(Alim)의 약간의 감소가 관찰됩니다. 이 매개변수의 최대 감소는 대조군(순수 버퍼의 단층)과 비교하여 3.2%입니다. Cs-I 매개변수도 감소하여 0.6ppm O 이상의 오존 농도에서 안정기 값에 도달합니다. 이 매개변수의 최대 감소는 대조군과 관련하여 24%에 이릅니다.
6.25 uM 농도의 퀘르세틴이 하위 단계에 존재할 때 Alim 값(1-2 퍼센트)은 약간 감소하는 반면 Cs-1 값은 약 27% 감소합니다.
Alim의 성질은 오존의 존재와 케르세틴과 결합된 오존의 변화 과정이 다릅니다. 약 0.3ppm의 오존 농도에서 케르세틴이 없는 경우 Aim은 약 88.3A2로 급격히 감소합니다. 그런 다음 특징적인 S자형 종속성을 제공하는 최소 고원 값에 도달합니다(그림 5a, 빨간색 점). 케르세틴이 있는 경우 Alim이 약간 부드럽고 단조롭게 감소하여 약 93.5 A2의 더 높은 오존 농도 고원에 도달합니다(그림 5a, 녹색 점).
그림 5. 오존 농도에 대한 분자당 면적의 의존성(a) 및 오존 농도에 대한 압축 계수의 의존성(b) 서브페이즈의 신경모세포종 막: 케르세틴-레드 포인트 없음; 케르세틴 그린 포인트. 선은 물리적 모델을 나타내지 않고 수학적으로 적합하며 매개변수 변경을 추적하기 쉽도록 그렸습니다. 최대 층 압축 계수 값은 두 가지 모두에 대해 오존 농도에 따라 유사하게 변경됩니다. 케르세틴의 부재 및 존재(그림 5b).
3. 토론
케르세틴의 작용 메커니즘은 수년 동안 집중적으로 연구되었지만 실험 결과는 종종 모순되며 어떤 상황에서는 이 화합물이 유익하고 다른 경우에는 세포에 불리하다는 것을 나타냅니다. 이용 가능한 연구의 분석은 세포에 대한 이 화합물의 효과가 두 가지 측면, 즉 막과의 상호작용 및 항산화 활성과 관련되어 있음을 보여줍니다. 그러나 세포에서 케르세틴 작용의 이러한 두 가지 모드를 구별하는 것은 불가능하며 이 화합물이 잠재적인 물질(예: 항종양 활성)로서의 적합성을 평가하는 것은 불가능합니다. 이러한 이유로 실험은 이 화합물이 막의 기계적 특성에 미치는 영향과 모델 시스템에서 항산화 활성에 미치는 영향을 정성적 및 정량적 방식으로 평가하는 방식으로 계획되어 있습니다. 다른 대사 경로의 활동.
수행한 실험에 따르면, 케르세틴은 최저 농도(6.25 uM)에서도 신경모세포종 세포막의 지질 부분을 모방하여 모델 단층을 변형(Alimvalue의 증가로 표시됨)하는 것으로 확인되었습니다. 이는 낮은 농도에서도 뇌에 도달할 때 케르세틴과 이러한 세포막의 상호작용 가능성을 나타냅니다. 이것은 막이 상대적으로 많은 양의 지질을 포함하는 신경 세포에 특히 중요합니다.
Cistanche는 면역력을 향상시킬 수 있습니다
신경 세포에 대한 대략적인 지질-단백질 비율은 80:20%이고, 예를 들어 적혈구막의 경우 이 비율은 50:50%입니다[29]. 신경 세포막의 지질 수준은 이러한 세포가 전기 신호를 전달하는 역할과 관련이 있습니다. 동시에, 세포막의 유연성 및 강성과 같은 물리화학적 특성의 미세한 변화라도 이 기능을 크게 방해할 수 있습니다.
이온채널의 작용으로 신경세포막을 따라 활동전위가 전달되고, 이온펌프의 작용으로 휴지전위가 회복된다. 이러한 단백질의 적절한 기능(특히 모양에 따라 결정됨)은 지질 환경에 밀접하게 의존합니다. 더욱이, 멤브레인의 기계적 특성의 변화는 게이팅 메커니즘이 멤브레인의 기계적 특성에 정확하게 의존하는 채널의 작동을 방해할 수 있습니다.
이러한 논문은 케르세틴이 세포막에 미치는 영향이 특히 Ca2+이온 및/또는 Ca2+대사의 수송과 관련이 있음을 보여주는 연구에 의해 확인되었습니다[30,31]. 따라서 막 환경(특히 신경 세포)에 케르세틴 분자를 도입하면 기능에 중대한 영향을 미칠 수 있습니다.
모델 시스템에서 결정된 케르세틴 작용이 세포에서 유익한 역할을 하는지 또는 불리한 역할을 하는지 확인하기 위해 모델 막에 대해 얻은 결과를 전체 신경모세포종 세포에 대한 이 화합물의 효과와 비교했습니다. SK-N-SH cell의 경우 MTT test를 하였고,Cistanche 추출물 항 알츠하이머미토콘드리아 탈수소효소에 정비례하는 세포의 세포 생존력에 대한 정보를 제공합니다.
얻어진 결과는 100 및 200uM 농도의 퀘르세틴의 존재가 생존 세포의 수를 증가시키는 것으로 나타났습니다. Bao et al.에서도 비슷한 결과를 얻었습니다. [32], PC-12 세포에 대한 케르세틴의 효과 조사. 세포막 파괴에 대한 정보를 제공하는 세포외 환경으로의 LDH 누출도 동일한 케르세틴 수준에서 조사되었습니다. 얻어진 결과는 시험된 세포의 막이 이러한 조건에서 손상되지 않았음을 입증하였다. Boots et al. 케르세틴이 폐 상피 세포에 미치는 영향을 연구한 [2]에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다. 따라서 이러한 농도에서 케르세틴은 세포에 긍정적인 영향을 미치고 세포의 생존력을 증가시킨다는 결론을 내릴 수 있습니다.
케르세틴 작용 메커니즘의 두 번째 중요한 측면은 항산화 특성과 관련이 있습니다. 연구된 폴리페놀의 관련 효과를 평가하기 위해 케르세틴이 산화 스트레스에 노출된 세포에서 보호 역할을 하는지 여부를 확인하는 실험이 수행되었습니다. 산화 스트레스는 H, O2를 세포 환경에 도입하여 생성되었습니다.기억력 향상을 위한 시스탄체이 연구에서 입증된 바와 같이 과산화수소는 미토콘드리아 손상으로 표현되는 상당한 세포 사멸을 유발합니다.
SK-N-SH 세포를 3mM 및 5mM H2O2가 포함된 배지에서 3시간 동안 배양한 경우 세포 생존율은 처리되지 않은 세포의 약 44%로 감소했습니다(MTT 분석). 연구에 따르면 퀘르세틴으로 세포를 24시간 전처리하면 H2O2로 처리된 세포와 관련하여 살아있는 세포 수가 증가합니다. Suematsu et al. [13] 유사한 효과를 보고했다.
우리는 또한 지질 과산화의 최종 산물로서 산화 스트레스의 바이오마커인 MDA의 수준을 측정했습니다[33]. 높은 퀘르세틴 농도로 세포를 전처리한 후 과산화수소를 첨가하면 H2O에만 노출된 세포와 비교하여 MDA 함량이 약간 증가했습니다. 이는 케르세틴(더 높은 농도에서)이 산화물 환원 활성화를 겪을 수 있고 산화환원 순환의 대상이 되어 세포 내 반응성 산소 종을 생성하기 때문일 수 있습니다[34].
세포가 산화 스트레스에만 노출된 경우와 비교하여 케르세틴과 H2O2로 처리된 세포의 막 파괴(변화하지 않은 LDH 수준으로 표시됨)에 큰 변화가 없었습니다. 따라서 높은 퀘르세틴 농도에서 지질 과산화의 증가에도 불구하고 멤브레인을 파괴하고 연속성을 방해할 만큼 유의하지 않은 것으로 결론지을 수 있습니다.
네이티브 시스템에 대해 얻은 관찰은 퀘르세틴 농도와 스트레스 수준을 모두 정확하게 제어할 수 있는 모델 시스템에 대해 받은 관찰과 직면했습니다. 신경모세포종 막의 지질 부분이 산화 스트레스에 어떻게 저항하는지 확인했습니다. 스트레스 조건은 버퍼에 오존을 도입하여 생성되었으며, 수중 환경의 오존은 산화 라디칼, 특히 하이드록실 라디칼 및 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼을 형성하는 분해 반응을 겪습니다[35]. 얻어진 활성 산소 종의 혼합물은 산화 환원 상태 장애 불균형 [36-38]으로 인해 세포에서 자연적으로 발생하는 것과 일치합니다.
응력의 영향으로 등온선의 모양이 변경되어 조밀하게 채워진 단층에서 단일 분자당 면적이 크게 감소했음을 나타냅니다. 이러한 변화는 지방산 사슬의 불포화 결합의 산화로 인해 발생했습니다. 이 효과는 오존 농도가 약 {{0}}.3 ppm으로 증가함에 따라 증가했으며, 이 등온선 매개변수는 ROS의 증가에도 불구하고 동일한 수준을 유지했습니다. 이것은 약 0.3ppm의 오존 농도에서 단층에 존재하는 모든 불포화 지방산이 산화되었음을 의미합니다(신경모세포종 모델에서 불포화 지방산의 총량은 52%).
산화된 단층은 상당한 강성을 가지며,시스탄체 in ChineseCs{0}} 값으로 표시됩니다(이 매개변수의 값이 높을수록 레이어의 강성이 커짐). 케르세틴이 있는 경우 낮은 농도(6.25μM)에서도 Alim 값의 변화로 시각화된 오존에 노출된 막의 변형이 크게 감소했으며(그림 5a), 이는 이 화합물의 항산화 활성을 입증합니다. . 그러나 케르세틴이 라디칼을 제거하여 불포화 지방산을 산화로부터 보호하지만 막 강성의 변화를 역전시키지는 못했다는 점은 주목할 가치가 있습니다(그림 5b).
따라서 케르세틴은 항산화 작용을 나타내지만 지질 분자 사이에 존재하는 것만으로도 김의 매개변수에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 나는 대조군에 비해 약 25% 더 낮은 가치를 가집니다.
이러한 결과는 케르세틴의 존재로 인한 세포 효과의 주요 요인이 막 변화임을 나타냅니다. 그러나 이러한 변화(신호전달의 변형, 수송)의 결과는 폴리페놀 분자의 수, 막의 초기 구성 및 세포의 기능에 따라 다릅니다. 이것은 다른 상황과 다른 연구에서 케르세틴이 보호 효과를 나타내는 반면 다른 연구에서는 그 반대인 이유를 설명합니다.
산화 스트레스가 높은 상황에서 항산화 효과는 세포의 구성 요소를 손상으로부터 보호하여 세포를 돕습니다. 그러나 이 화합물을 주변 환경에 위치시켜 막이 크게 변형되어 막 강성 변화에 의한 신호 전달 또는 수송 경로의 분포가 발생하면 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 세포의 많은 과정이 동시에 일어난다는 것을 기억해야 합니다. 막과 관련된 과정과 산화 스트레스를 생성하는 과정 모두입니다. 특정 지표의 수준을 결정하여 관찰하고 측정할 수 있는 효과는 항상 총체적입니다. 따라서 케르세틴의 효과가 호의적이거나 비호의적으로 인식되는 상황이 있습니다.
4. 재료 및 방법
4.1.재료
신경모세포종 세포막의 지질 부분 모델 구성은 [39-41] 저자의 작업을 기반으로 설정되었습니다. 인지질: 1-올레오일-2-팔미토일-sn-글리세롤-3-포스포콜린;1-헥사코사노일-d4-2-하이드록시-sn-글리세롤{11}}포스포콜린; 1,{13}}디올레오일-sn-글리세롤{16}}포스포콜린; L{17}}포스파티딜에탄올아민(뇌); 스핑고미엘린(뇌)-(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA). 콜레스테롤이 구매되었습니다(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany). 인지질 대 콜레스테롤 비율은 79% 대 21%였습니다. 포화지방산 대 불포화지방산의 비율은 48% 대 52%였다.
화학적 순도의 용매(클로로포름, 에탄올)-Poch(Gliwice, Poland); HLP 5 Hydrolab(Straszyn, 폴란드)에서 생산한 신선한 탈이온수. 배양 배지, 혈청 및 항생제는 CytoGen GmbH에서 구입했습니다. 실험에 사용된 화학 시약은 Sigma Aldrich에서 구입했습니다.
4.2.세포 배양
인간 신경모세포종 세포주 SK-N-SH(The European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC)는 0.01% 페니실린이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)의 10% 소 태아 혈청(FBS)에서 배양되었습니다. - 5% CO2를 함유한 습한 대기에서 37도의 스트렙토마이신.
4.3. 세포 생존율 측정(MTT 분석)
세포를 0.1mL의 부피로 웰당 1x104개 세포의 밀도로 {{0}}웰 플레이트에 시딩했습니다. 세포를 다양한 농도의 퀘르세틴(3.{7}} μM)으로 24시간 동안 처리한 후, 3mM 및 5mM 과산화수소를 3시간 동안 첨가했습니다. 3 및 5 μM 농도에서 HO2는 통계 연구를 위해 동일한 처리로 처리되었으며 3-5 uM H2O2 처리로 설명되었습니다.
그 후 50μL MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5 디페닐 테트라졸륨 브로마이드) 용액(5의 멸균 원액 mg/mL)를 세포에 첨가하고 가습된 5% CO 대기에서 37도에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 0.4 mL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 첨가하고 10분 동안 유지하였다. 원심분리 후, 마이크로리터 플레이트 리더(BioTek Instruments, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 상등액의 광학 밀도를 측정하였다.
4.4.Mem1brane 손상 분석(LDH 분석)
젖산 탈수소효소(LDH) 분석은 세포막 전체의 마커로 사용되었습니다.
웰당 1×1{{1{12}}}* 세포 양의 세포를 96-웰 플레이트에 파종하고 케르세틴(3.75-200 μM) 존재 하에 배양 24시간 동안; 그 다음, 3mM 및 5mM H2O를 3시간 동안 첨가하였다. 0.75mM 피루브산나트륨 0.5mL 및 NADH(140μM) 10uL(37C에서 10분 가열)을 포함하는 튜브에 150μL의 상청액을 첨가하고 37도에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 0.5 mL의 2,{24}}디니트로페닐히드라진을 샘플에 첨가하고 1시간 후 450 nm에서 흡광도를 측정했습니다.
4.5. 지질 과산화 측정(MDA 농도)
막 지질 과산화는 말론디알데히드(MDA)와 티오바르비투르산(TBA) 반응에 의해 추정되었습니다. 세포는 {{0}}웰 플레이트에 퀘르세틴과 H, O2(위에 설명된 농도 및 시간)를 웰당 1×104개 세포의 양으로 { {1{17}}}}.25mL. 처리 후, 샘플을 수집하고 원심분리했습니다(1{15}}×&,5분). 펠렛에 00.5% TCA 0.5mL를 첨가하고 1분 동안 볼텍싱하고 5분 동안 초음파 처리를 통해 용해했습니다. 10,000 xg에서 10분 동안 원심분리한 후, 상청액 0.4mL를 0.5% TBA가 포함된 1.25mL 20% TCA에 첨가하고 건조 열 블록(100도)에서 30분 동안 가열했습니다. 냉각 후, 흡광도는 155M-1 cm-1와 동일한 MDA의 몰 흡광 계수를 사용하여 532 nm에서 측정되었습니다.
4.6.모델 멤브레인
버퍼 오존 처리. 인산염 완충액(0.01 M, pH 7.4)은 오존 발생기 FM 500(Grekos, Poland)에 의해 생성된 오존으로 포화되었습니다. 완충액의 오존 농도는 Bader와 Hoigne[42]에 따라 결정되었습니다.
표면 압력 등온선.cistanche 음경 성장Langmuir trough(KSV, Finland)는 5mm/min 장벽 속도에 해당하는 일정한 압축 속도에서 표면 압력 등온선 등록에 사용되었습니다. 지질 단층은 퀘르세틴이 있거나 없는 pH 7.4, 오존이 있거나 없는 수용액 0.01M 인산염 완충액으로 구성된 하위상에 1mg/mL 농도의 지질 클로로포름 용액을 도포하여 형성되었습니다. 표면 장력은 Pt-Wilhelmy 플레이트를 사용하여 측정되었습니다. 실험은 25도 ±1도에서 수행되었습니다.
4.7. 통계 분석
테스트된 각 변이체에 대해 3~6개의 독립적인 분석을 수행하고 평균화했습니다(±SD). SAS ANOVA 절차를 활용하여 대조군과 비교한 유의미한 차이를 추정했습니다. 통계 분석은 Duncan의 다중 범위 검정에 의해 수행되었으며, p를 취했습니다.<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">
저자 기여: 개념화, BK, BD 및 ER-S.방법론, BKBD; 소프트웨어, BK, BD검증, BK, BD, ER-S., ABwriting—원본 초안 준비 BK, BD, ER-S., 쓰기—검토 및 편집, BK, BD, ER-S., ABvisualization, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., AB모든 저자는 원고의 출판된 버전을 읽고 동의했습니다.
자금:이 연구는 외부 자금 지원을 받지 않았습니다.
기관 검토 위원회 성명서: 해당 없음.
사전 동의서: 해당 없음.
데이터 가용성 선언문: 기사 내에 데이터가 포함되어 있습니다. 이해 상충: 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
이 기사는 Molecules 2021, 26, 4945에서 발췌했습니다. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules
