기억 재구성 및 재발의 알코올 관련 전사 역학 파트 4
Jan 29, 2024
Arc 외에도 우리는 Bdnf가 아닌 Egr1의 mRNA 수준이 알코올 기억 검색에 의해 DH 및 mPFC에서 증가한다는 것을 발견했습니다.
시간이 지남에 따라 사람들은 점차적으로 망각의 신비에 대해 새로운 이해를 얻게 됩니다. 이 과정에서 신기술 메모리 검색은 점차 연구 핫스팟이 되었습니다.
그렇다면 알코올 기억력 인출과 기억력 사이에는 관계가 있을까요? 지금 와서 살펴보세요! 우선, 분명히 해야 할 점은 알코올 기억 검색은 별도의 기술이 아니라는 것입니다. 알코올을 통해 뇌 신경세포에 영향을 미치는 기술이다. 이 과정은 뇌의 "잠자는" 기억을 활성화하여 이러한 기억을 새로 고칠 수 있습니다.
둘째, 기억력 향상은 단순히 더 많은 것을 "기억"하는 것이 아니라 다양한 방식으로 기억을 검색하고 재구성하는 과정이라는 것을 알아야 합니다. 이 과정은 우리가 배운 지식을 더 잘 통합하고 이해하는 데 도움이 되므로 기억력이 향상됩니다.
그러므로 우리는 알코올 기억인출과 기억수행 사이에 관계가 있다는 결론을 내릴 수 있다. 우리가 술을 마신 후 이 기술을 이용하여 이전 기억을 다시 추출하면, 우리는 이러한 기억을 재결합하는 과정을 거치게 되어 어느 정도 기억력이 향상되는 것입니다.
물론, 알코올 기억 검색은 기억력 향상을 위한 오래 지속되고 신뢰할 수 있는 기술이 아니라는 점에도 유의해야 합니다. 오랫동안 우수한 기억력을 갖고 싶다면 일상의 학습과 생활을 통해 기억력을 지속적으로 공고히 하고 향상시키며, 기타 기억력 훈련 기법도 병행해야 합니다.
이 과정에서 우리는 학습 동기와 기억 잠재력을 더 잘 자극하기 위해 항상 낙관적인 태도를 유지해야 합니다. 그러므로 기억력 훈련에 적극적으로 참여하고, 끊임없이 우리 자신이 되어 지속적으로 기억력을 향상시키는 길로 용감하게 전진합시다! 기억력 향상이 필요하다고 볼 수 있는데, Cistanche Deserticola는 아세틸콜린 수치와 성장인자 수치를 높이는 등 신경전달물질의 균형도 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 물질은 기억과 학습에 매우 중요합니다. 또한 고기는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌에 충분한 영양분과 에너지를 공급하여 뇌의 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
증가된 Egr1 mRNA 발현은 이전에 두려움과 약물 기억의 재구성에 연루되었으며[19, 21, 48, 61], 이 전사 인자가 알코올 기억의 재구성에도 역할을 할 가능성을 높였습니다.
기억 재구성에서 Bdnf의 역할은 여전히 논란의 여지가 있는 반면[19, 49], Bdnf 유도는 기억 획득 및 소멸 학습에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다[19, 62]. 따라서 우리 연구에서 Bdnf 발현의 변화가 없다는 것은 우리의 기억 검색 절차가 기억 검색과 병행하여 멸종 학습을 시작하지 않았다는 것을 암시할 수 있습니다.
더욱이, 우리는 최근 DH에서 Bdnf의 mRNA 수준이 알코올 기억 검색 자체에 의해 증가되지는 않지만, 검색 후에 재발을 예방하는 혐오적인 역조건화가 뒤따를 때 성장인자의 발현이 증가한다는 것을 보고했습니다[44]. 이는 Bdnf의 복잡한 역할을 시사합니다. 알코올 기억 역학에서.
우리의 연구 결과는 IEG 발현의 증가가 알코올 관련 기억의 재구성에만 국한되지 않는다는 것을 나타냅니다.
실제로 ARC와 EGR1은 이전에 공포 기억[19, 46, 47, 62], 인식 기억[21], 다양한 약물 남용과 관련된 기억[20, 22, 61]을 포함하여 여러 유형의 기억을 통합하는 데 관여했습니다.
그러나 알코올 추구의 기본 메커니즘 중 일부가 자연적 보상 추구를 제어하는 메커니즘과 다를 수 있다는 증거도 늘어나고 있습니다 [5, 27, 28, 63]. 또한 다양한 보상(특히 다양한 약물)에 대한 기억이 차등적으로 처리된다는 증거가 있습니다[29-32]. 우리의 RNAseq 분석 결과는 실제로 알코올 기억 검색에 의해 유도된 독특한 전사체 서명을 밝혀냈습니다.
구체적으로, 우리는 DH에서 44개의 유전자를 발견했고, PFC에서 9개의 유전자로 구성된 다른 세트를 발견했는데, 이는 알코올 기억 검색 후 중요한 변화를 보여주었습니다. 추가 데이터 검증 후, 우리는 mPFC(Fkbp5)의 한 유전자와 DH(Adcy8, Scl8a3 및 Neto1)의 세 유전자에 초점을 맞췄으며 이들의 발현이 자당 관련 기억 검색에 영향을 받지 않는다는 것을 발견했습니다.
이는 Arc 및 Egr1과 달리 이 4가지 특정 유전자가 보상 기억 처리에서 일반적인 역할을 수행하지 않지만 오히려 알코올 기억 처리에서 선택적인 역할을 수행할 수 있음을 시사합니다.
흥미롭게도 이 네 가지 유전자는 이전에 알코올 사용 장애, 학습 및 기억과 관련이 있었습니다. 따라서 Fkbp5는 스트레스 신경내분비계의 조절자인 FK506 결합 단백질 5를 암호화합니다.
FKBP5 변종은 알코올 금단 증후군의 심각도를 조절하고[65] 인간의 과음 경향을 예측합니다[66-68]. Fkbp5의 결실은 생쥐에서 알코올 금단 심각도[65] 및 알코올 음주[67]를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 반면, 단백질의 약리학적 억제는 적당한 알코올 소비를 감소시키고 생쥐에서 CPP의 복원을 감소시키며[69] 스트레스를 받는 수컷 쥐의 음주를 감소시킵니다[70].
칼슘 유입에 반응하여 cAMP 형성을 촉매하고 최근 알코올 섭취의 가능한 조절자로 표시된 adenylatecyclase 8(AC8)을 코딩하는 Adcy8 mRNA의 수준은 장기간 금주한 알코올 중독자의 혈액 세포에서 감소했습니다[72].
Adcy8의 삭제는 이전에 쥐의 음주를 줄이고 알코올의 진정 효과에 대한 민감성을 증가시키는 것으로 나타났습니다[73]. 또한, 쥐의 만성 알코올 노출은 Scl8a3에 의해 암호화된 단백질인 용질 캐리어 패밀리 8(나트륨/칼슘 교환체), 구성원 3(NCX3)의 뇌 발현을 상향조절했습니다[74, 75].
쥐의 알코올 섭취는 또한 NMDA 수용체 복합체의 구성 요소인 뉴로필린 톨로이드 유사 1(NRP1)을 암호화하는 Neto1[76]의 뇌간 발현 감소와 관련이 있었습니다[77].
이 단백질은 해마에서 시냅스 재구성 및 전달에 관여하며[78] 공간 학습 및 기억에 필요합니다[77].
따라서, 우리의 연구 결과는 알코올의 약리학적 효과가 없더라도 알코올 기억의 단순한 검색만으로도 이러한 유전자의 발현에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 그러나 알코올 기억 재구성 및 재발에 대한 구체적인 역할은 아직 테스트되지 않았습니다.
본 연구의 한계는 RNA-seq 분석이 기억 검색에 의해 활성화된 개별 세포가 아닌 대량 mPFC 및 DH 조직에서 수행되었다는 것입니다. 특히, 최근 연구에서는 일반적인 기억[79, 80], 특히 알코올 관련 기억[32, 81, 82]이 소수의 뉴런으로 구성된 신경 앙상블의 활성화를 통해 인코딩되며, 이는 신경 활성화 마커를 통해 식별될 수 있다고 제안했습니다. 예를 들어, cFOS) [80].
실제로, 조작 조건화된 알코올 및 달콤한 보상 기억의 검색에 의한 유사한 IEG(cFOS) 활성화 패턴이 쥐 뇌의 mPFC 및 추가 중중변연 영역에서 발견되었습니다[32, 81]. 따라서 기억인출에 의해 활성화된 신경세포 앙상블에 선택적으로 RNA-seq 분석을 수행하면 보다 정확한 결과를 얻을 수 있었을 가능성이 있다.
요약하면, 우리의 연구 결과는 알코올 기억 검색이 두 개의 병렬 전사 프로그램을 유도한다는 것을 시사합니다. IEG Arc 및 Egr1을 포함하여 학습 및 기억의 일반적인 분자 메커니즘을 통해 전달되는 한 프로그램은 일반적으로 기억의 통합에 관여합니다.
알코올 기억 검색에 의해 시작되는 다른 전사 프로그램은 특히 알코올 관련 행동을 촉진하는 유전자에 의해 제어됩니다. 알코올 기억에 대한 이러한 이중 처리 모델은 다양한 기억에 대한 기억 재구성이 유사한 이중 처리 분자 메커니즘을 가질 가능성을 제기합니다. 일부 구성 요소는 여러 기억에 의해 공유되고 다른 구성 요소는 각 기억 유형에 고유합니다.
이 가상 모델은 이러한 유전자를 조작하는 것이 알코올 및 자당 기억 재구성에 차별적으로 영향을 미치는지 여부를 평가하는 데 남아 있습니다. 그렇다면 알코올 기억 재구성을 넘어서는 많은 기능에 필수적인 주요 분자 메커니즘을 방해하기보다는 중독과 같은 병원성 기억과 관련된 장애를 치료하기 위해 보상 특정 분자 표적을 목표로 하는 것이 가능할 수 있음을 시사합니다.
재료 및 방법
장치, 약물 및 시약, ODN(올리고데옥시뉴클레오티드) 설계 및 준비, 웨스턴블롯 및 qRT-PCR 분석, RNA-seq 라이브러리 준비에 대한 자세한 내용은 보충 정보를 참조하세요.
동물
수컷 및 암컷 C57BL/JRccHsd 마우스(25~30g)는 텔아비브 대학 동물 시설(이스라엘)에서 케이지당 3~4마리 사육되었으며 12시간 명암 주기(오전 7시에 켜짐)로 유지되었습니다. 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있습니다.
자당 위치 조건화와 관련된 실험에서는 생쥐의 자당 펠릿 수집 동기를 높이기 위해 훈련 세션 전 6시간 동안 음식에 대한 접근이 제한되었습니다. 이러한 짧은 음식 결핍 기간은 낮 시간에 2~6시간의 단식이 섭식 행동에 영향을 주지 않으며[83] 대사 지표의 중요한 변화를 유발하지 않으며[84] 음식 제한 자체의 영향을 최소화한다는 연구 결과에 근거합니다. .
체중 감소를 조절하기 위해 마우스의 체중을 일주일에 두 번씩 측정했습니다. 모든 실험 프로토콜은 Tel AvivUniversity의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침과 NIH 지침(동물 복지 보증 번호A5010-01)의 승인을 받고 이를 준수했습니다. 사용되는 동물의 수를 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
행동 절차
장소 조절
알코올 조절 장소 선호도(CPP): 모든 마우스를 3일 동안 매일 복강 식염수 주사에 익숙해졌습니다.
기본 테스트(1일차): 첫째 날에는 슬라이딩 도어를 닫고 마우스가 30분 동안 전체 장치를 자유롭게 탐색할 수 있도록 허용했습니다. 알코올 장소 컨디셔닝(2~9일): 기본 테스트 후 24시간 후에 1회 세션으로 훈련을 시작했습니다. 미닫이 문을 닫은 상태에서 8일에 걸쳐 매일 투여합니다. 3일, 5일, 7일, 9일째에 마우스에게 알코올(1.8g/kg, 20% v/v; ip)을 투여하고 즉시 한 쌍의 구획에 5분 동안 가두었습니다.
이 복용량과 컨디셔닝 기간은 이전에 알코올 유발 CPP를 생성하는 것으로 나타났습니다 [42, 85]. 격일(즉, 2일, 4일, 6일, 8일)에 쥐에게 식염수를 투여하고 알코올 조절일과 동일한 기간 동안 짝이 없는 구획에 가두었습니다.
쌍을 이룬 구획은 균형을 이루었습니다. 장소 선호도 테스트 1(10일): 장소 선호도 테스트는 기준선 테스트에 대해 설명된 대로 이루어졌으며 알코올-CPP를 지수화하는 데 사용되었습니다[41]. 선호도는 기준선 테스트와 비교하여 장소 선호도 테스트 1 동안 알코올 짝을 이루는 칸에서 보낸 시간의 백분율 증가로 정의되었습니다.
기억 검색(11일): 이 단계 전에 마우스를 다른 실험 조건(CPP 점수 및 성별에 맞게 일치)에 할당했습니다. 기억 검색 세션 동안, 쥐를 알코올이 들어 있는 구역에 3분 동안 가두었다가 다시 집으로 돌아왔습니다. 대조 마우스는 간략하게 처리되었습니다. 장소 선호도 테스트 2(12일): 마우스에 장소 선호도 테스트 1과 동일한 장소 선호도 테스트를 실시했습니다.
자당 CPP: 자당 사전 훈련(1~6일): 1~3일에 생쥐는 집 우리에서 5~6개의 자당 펠릿(45mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, USA)을 수집하도록 습관화되었습니다. . 4~6일에 생쥐는 30-분 세션 동안 빈 Plexiglas 상자에 3개의 알약을 수집하도록 훈련되었습니다. 자당 훈련 동안 6개 미만의 펠렛(3일 동안 총 9개의 펠릿 중)을 수집한 마우스는 실험에서 제외되었습니다(32마리 중 2마리의 마우스).
기본 테스트(7일): 7일째에 CPP 챔버의 슬라이딩 도어를 닫고 마우스가 30분 동안 전체 장치를 탐색하도록 허용했습니다. 알코올-CPP 절차에 설명된 편견 없는 장치/편향되지 않은 할당 접근 방식도 여기에 채택되었습니다. 자당 장소 조건화(8~15일): 기준 테스트 후 24시간 동안 8일 동안 하루에 한 세션씩 훈련을 시작했습니다. 문이 닫혔습니다. 9일, 11일, 13일 및 15일에 마우스를 쌍으로 된 구획에 배치하고 1분 후 3개의 자당 펠렛을 바닥에 뿌렸습니다.
15분 후에 마우스를 집 우리로 돌려보냈습니다. 격일(즉, 8일, 10일, 12일, 14일)에 마우스를 간섭 없이 15분 동안 짝이 없는 구획에 두었습니다.
쌍을 이룬 구획은 균형을 이루었습니다. 장소 선호도 테스트 1(16일): 장소 선호도 테스트는 기준선 테스트에 대해 설명된 대로 수행되었으며 수크로스-CPP 지수를 제공했습니다. 선호도는 기준선 테스트와 비교하여 장소 선호도 테스트 1 동안 자당 쌍 구획에서 보낸 시간의 백분율 증가로 정의되었습니다. 기억 검색(17일): 자당 기억 검색 절차는 알코올 기억 검색 절차와 동일했습니다(위 참조). ).
ODN(올리고데옥시뉴클레오티드) 검증
아크 안티센스 ODN(AS-ODN) 및 스크램블 ODN(SCR-ODN)(Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) 설계는 이전에 설명한 지침을 따랐습니다[56, 86].
Arc AS-ODN 기능 검증. Arc AS-ODN(2nmol/μl, 0.5μl, 0.25μl/min)을 한쪽 반구의 DH에 주입했고, SCR-ODN(2nmol/μl, { {9}}.5 µl, 0.25 µl/min)을 반대쪽 반구에 주입했습니다(측면이 균형을 이루었습니다). 2시간 또는 4시간 후, 처리된 마우스는 5분 동안 익숙하지 않은 상황(CPP 구획, 위의 장치 설명 참조)을 탐색하여 신규성 의존 ARC 발현을 유도했습니다. 한 시간 후에(즉, ODN 주입 후 3 또는 5시간 후에) 마우스를 안락사시키고, 뇌 조직을 수집하고, ARC 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 평가했습니다(그림 S4).
수술 및 해마내 미세주입수술 및 미세주입은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[42, 87].
수술. 이소플루란 마취하에 정위 수술을 실시했습니다. 마우스를 정위 프레임(RWD Life Science, Shenzhen, China)에 배치하고 양측 가이드 캐뉼러(C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA)를 DH를 겨냥했습니다. 다음 좌표(브레그마 후방 -2mm, 내외측 ±1.3mm, 두개골 표면 복부 -1.45mm). 캐뉼라는 치과용 아크릴로 고정되었습니다. 일치하는 더미 캐뉼러(Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA)를 가이드 캐뉼러에 삽입하고 먼지 컵을 덮어 주입기 부위를 덮고 잔해물이 없도록 유지했습니다. 알코올-CPP 훈련 전 7~10일 동안 마우스를 회복하도록 허용했습니다.
해마내 주입. Actinomycin D(4μg/μl, 측면당 0.5μl, 0.25μl/min, DMSO 내)[19] 또는 이에 상응하는 양의 차량을 메모리 검색 직후 DH에 미세 주입했습니다. . 유사한 농도의 액티노마이신 D를 해마에 주입하면 기억 재구성을 방해하는 것으로 나타났습니다[19]. Arc AS-ODN 또는 대조군 SCR-ODN(2nmol/μl, 0.5 μl/side, 0.25 μl/min; in PBS)을 DH 4시간 2시간 전에 미세 주입했습니다. 기억 검색 후 4시간.
더스트 컵과 더미 캐뉼라를 제거한 후, 가이드를 넘어 0.5 mm 확장된 주사 캐뉼러(33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA)를 사용하여 각성 구속된 마우스에 2분에 걸쳐 미세주입을 수행했습니다. 캐뉼라 팁. 주입 캐뉼라를 추가로 2분 동안 제자리에 두었습니다. 주입 후 더미 캐뉼라를 가이드 캐뉼라에 삽입하고 먼지 컵으로 고정한 후 동물을 홈 케이지로 돌려보냈습니다. 캐뉼라 위치는 크레실 바이올렛으로 염색된 파라포름알데히드 고정 조직의 30 μm 두께의 관상 절편에서 확인되었습니다.
데이터 분석
Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >기준선 테스트 중 어느 한 구획에 있는 시간의 75%가 연구에서 제외되었습니다(267개 중 9개). 기준선과 CPP 테스트 1 간의 CPP 점수를 비교하여 CPP 확립을 확인하고 paired t-test로 분석했습니다. CPP의 발현(즉, 기억 형성)은 기억 회복에 필요하기 때문에 CPP를 나타내지 않은(기준선과 테스트 1 사이의 선호도가 최소 5% 증가) 마우스의 데이터는 실험에서 제외되었습니다(258마리 중 48마리).
기억 재통합 간섭에 따른 알코올-CPP는 치료(Actinomycin D 또는 ODN)의 개체 간 요인과 테스트(CPP 테스트 1, CPP 테스트 2)의 개체 내 요인을 사용하여 혼합 모델 ANOVA로 분석되었습니다. 중요한 상호 작용은 Student-Newman-Keul의 사후 테스트를 통해 분석되었습니다. 웨스턴 블롯 면역반응성 ARC 단백질 수준의 밀도를 해당 GAPDH로 정규화하고 치료 대상자 간 요인을 사용한 일원 분산 분석에 이어 Dunnett의 사후 테스트로 분석했습니다. qRT-PCR mRNA 발현 데이터를 Gapdh로 정규화하고 대조군의 발현 백분율로 표시했습니다.
각 뇌 영역에 대한 모든 유전자의 데이터는 대조군(검색 없음) 그룹에서 얻은 데이터와 비교하기 위해 치료의 피험자 간 요인을 사용하여 일원 분산 분석에 이어 각 유전자에 대한 Dunnett 테스트를 통해 분석되었습니다. RNA-seq의 경우, 우리는 각 복제에 대해 3마리의 동물로부터 조직을 모으고 다음과 같은 수의 복제를 준비했습니다: 등쪽 해마(DH)에 대해 3개 - 검색 없음, 2개는 DH 검색, 3개는 전두엽 피질(PFC)에 대해 - 검색 없음, 2개(( PFC)-검색. Trizol을 사용하여 전체 RNA를 분리한 후 우리가 개발한 방법을 사용하여 시퀀싱 라이브러리가 생성되었습니다[88].
라이브러리에 IlluminaHiseq 2000을 사용하여 50bp 단일 말단 시퀀싱을 수행했습니다. FastQC로 시퀀싱 데이터의 품질을 확인한 후 Bowtie2[89]를 사용하여 판독값을 mm9 참조 게놈에 매핑하고 Tophat2[90]로 주석을 달았습니다.
유전자에 매핑된 읽기는FeatureCounts[91]에 의해 정량화되었습니다. 우리는 이전에 설명한 대로 라이브러리 정규화를 왜곡할 수 있는 과도하게 증폭된 유전자의 수를 피하기 위해 Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a 및 미토콘드리아 염색체를 제외했습니다[92]. DESeq2[58]는 유의성 컷오프 조정 p-값(p(adj) < 0.05)을 사용하여 No Retrieval 대조군과 비교하여 Retrievalgroup에서 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 식별하는 데 사용되었습니다.
데이터 가용성RNA-seq 데이터는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi(GSE205586)의 NCBI Gene Expression Omnibus에서 리뷰어 토큰:knyfwwiorbutvuv와 함께 제공됩니다.
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For more information:1950477648nn@gmail.com
