박테리아 표면 단백질의 유비퀴틴화를 포함하는 선천적 병원체 감지 전략 2부
Jul 28, 2023
논의
후생동물은 유비퀴틴화를 세포질의 항상성을 유지하고 손상된 단백질/소기관의 축적을 방지하고 침입하는 병원체를 방어하는 다용도 메커니즘으로 사용합니다(40, 41). 다양한 병원균과 다양한 손상된 단백질 세트가 발생하는 경우 기질 인식 및 후속 유비퀴틴화를 위한 공통 모티프를 식별하는 것은 자원 최적화를 위한 현명한 전략을 나타냅니다. 단백질 분해가 예정된 진핵 세포의 단백질은 일반적으로 세 부분의 degron 모티프에 의해 식별됩니다(24).
면역은 박테리아, 바이러스 및 기타 유해 물질에 대한 반응을 포함하여 질병과 싸우는 신체의 능력입니다. 신체의 면역 체계가 손상되면 질병의 맹공격에 대처할 수 있을 만큼 강하지 않습니다. 연구에 따르면 영양 실조는 면역 체계의 기능에 영향을 미쳐 신체가 감염과 질병에 더 취약하게 만듭니다. 단백질은 면역력을 유지하는 중요한 물질 중 하나입니다.
단백질은 아미노산으로 이루어지며, 그 중 일부는 음식으로 공급되어야 하고 체내에서 합성될 수 없기 때문에 필수 아미노산이라고 합니다. 이러한 필수 아미노산에는 트립토판, 류신, 페닐알라닌, 리신, 이소류신, 메티오닌, 발린 및 히스티딘이 포함됩니다. 신체가 필수 아미노산을 충분히 섭취하지 못하면 단백질 대사가 손상되어 면역 체계의 기능에 영향을 줄 수 있습니다.
또한 고품질 단백질 섭취는 정상적인 면역 체계와 신체 기능을 유지하는 데 도움이 됩니다. 신체에 단백질이 부족하면 면역 체계가 약해지고 신체가 질병에 더 취약해질 수 있습니다. 인체에 장기간 단백질이 부족하면 면역 체계가 장기적으로 손상되어 다양한 질병에 걸리기 쉽습니다.
따라서 균형 잡힌 식단과 적절한 운동이 단백질 섭취를 유지하는 열쇠입니다. 사람들은 육류, 가금류, 생선, 콩, 계란, 유제품, 곡물, 견과류 및 씨앗과 같은 단백질이 풍부한 식품을 더 많이 섭취함으로써 신체의 단백질 요구를 충족할 수 있습니다. 또한 적당한 운동은 신체의 단백질 요구량과 흡수 효율을 높일 수 있습니다. 균형 잡힌 다양한 식단과 건강한 생활 습관은 면역력을 유지하고 신체를 건강하고 안정적으로 유지하며 질병의 침입에 저항하는 열쇠입니다. 이러한 관점에서 우리는 면역력을 향상시켜야 합니다. Cistanche는 육류의 다당류가 인간 면역 체계의 면역 반응을 조절하고 면역 세포의 스트레스 능력을 향상시키고 면역 세포의 면역력을 향상시킬 수 있기 때문에 면역력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 살균 효과.
이것은 기질 인식을 위한 프록시로 기능할 수 있는 병원체 표면에서 유사한 모티프를 찾을 수 있는지 여부를 조사하도록 자극했습니다. 여기에서 우리는 숙주 유비퀴틴 리가제가 유사한 분자 시그니처를 사용하여 계통발생학적으로 별개의 병원체를 감지한다는 것을 입증합니다. 일반적인 분자 패턴/모티프(PAMP)를 통한 병원체 인식은 선천성 면역의 특징으로 잘 알려져 있습니다(42). 우리의 결과는 박테리아 표면 단백질 내의 데그론 유사 서열이 세포내 병원균 감시를 부여하기 위해 PAMP와 동등한 방식으로 작용한다는 것을 시사합니다. 이 방식 피연산자는 세포내 병원체에 대한 강력한 CD8 반응을 유도하기 위해 주요 조직 적합성 복합체 I에 대한 미생물 단백질 항원의 제시를 위해 숙주에 의해 추가로 이용될 수 있다.
숙주 방어에 대한 병원체의 유비퀴틴-매개 검출의 잠재적 중요성은 BgaA 및 PspA 둘 다 결여된 돌연변이 SPN에서 검출된 실질적인 잔류 유비퀴틴화에 의해 더욱 강조된다. 이것은 유비퀴틴 기구의 미확인 기질이 더 있음을 나타내며 결과적으로 중복성이 있어 강력한 병원체 차단을 보장합니다. 특히 데그론 모티프와 박테리아에 대한 중요성(인식 가능한 단위가 아닌)에 대한 몇 가지 즉각적인 질문은 흥미로운 진화적 각도를 제공합니다.
degron 모티프는 생체 내에서 필요하지 않으며 모티프를 돌연변이시키거나 삭제하면 세포 내 지속성이 향상되어 병독성이 증가합니다. 이것은 degron 모티프의 돌연변이가 SPN 혈청형 19F에서 볼 수 있는 것처럼 유비퀴틴 매개 인식을 피하기 위해 병원체에 의해 사용될 수 있다는 우리의 결과에 의해 입증됩니다. 그러나 대부분의 SPN 혈청형에 걸쳐 BgaA에서 데그론 모티프의 보존된 특성은 박테리아가 숙주에 덜 치명적이기 위해 채택한 대응 전략을 암시할 수 있습니다.
이것은 병원체가 점유 가능한 서식지를 증가시킬 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 동시에 degron 모티프에서 박테리아 표면의 유비퀴틴화 또는 분비 단백질은 궁극적인 이점을 위해 숙주 반응을 약화시키거나 재배선하도록 기능적으로 조절할 수 있습니다(43). 따라서 진핵생물 유사 기능 영역 또는 모티프(예: 데그론)의 존재 또는 부재는 병원성 틈새에 의존할 수 있으며 숙주 면역 반응을 회피하거나 조절하도록 적응될 수 있습니다.
구아닐레이트 결합 단백질을 포함하는 유사한 병원균 감지 메커니즘도 세균 제거와 관련되어 있습니다. 그러나 ubiquitination과 달리 그들의 역할은 그람 음성 병원체에 국한되는 것으로 보고되었다(44-47). Ubiquitination은 그람 기원에 관계없이 병원체를 표적으로 합니다. 예를 들어 RNF213은 Listeria spp를 표적으로 하는 것으로 문서화되었습니다. LPS(48)의 부재와 관계없이. 따라서 우리는 SPN에 대한 항균 작용의 가능성도 제거하지 않습니다.
병원성 표면은 체인간 상호작용을 통해 서로 다른 E3 리가제에 의해 여러 체인 유형으로 유비퀴틴화될 수 있습니다(41). 특히, Mtb의 경우, Smurf1, Parkin이 병원체를 분해하는 상승 작용을 하는 K48 및 K63 사슬 유형을 형성하는 것으로 입증되었습니다(12). K48 유비퀴틴화의 기계적 역할과 감염 시나리오 동안 관련된 E3 리가제를 이해하는 것은 여전히 연구되지 않았습니다. STm의 경우, 단일 E3 리가제 ARIH1이 K48 유비퀴틴 사슬을 가진 세포질 STm을 표적으로 삼아 시스템에서 STm을 제거하는 것으로 묘사되었습니다(15). 우리와 다른 사람들의 연구 결과에 따르면, K48-Ub 표지된 병원균은 프로테아좀 기계와 연관되면서 마지막으로 분해됩니다.
그러나 이 연구는 특정 박테리아 표면 단백질의 K48-Ub 장식을 보여줍니다. 일부 병원체는 표면 단백질을 능동적으로 변형하여 유비퀴틴화 및 후속 사멸로부터 보호하므로 유비퀴틴 기질의 표면 국소화의 중요성을 강조하는 것으로 알려져 있습니다(10). 또한, 다수의 절대 세포내 병원체는 유비퀴틴 매개 클리어런스를 회피하기 위해 스스로 또는 숙주 조절 성분을 탈유비퀴틴화하는 전략을 발전시켰습니다(5). 함께, 이러한 발견은 숙주 방어의 중심인 근본적인 세포내 병원체 감지 메커니즘으로서 유비퀴틴 매개 경보 각성의 중요성을 강조합니다.
우리의 연구는 특히 FBXW7과 함께 SCF E3 리가아제의 중심 역할이 박테리아 유비퀴틴화 증가 병원체 분해에서 더 입증되었습니다. FBXW7의 이형접합 돌연변이, 특히 R505C(기질 인식 포켓의 중요한 잔기) 변이는 인간에서 다발성 암종과 림프구성 백혈병을 유발합니다(49, 50). 최근 코호트 기반 연구에 따르면 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자의 거의 43%가 세균성 폐렴 및 패혈증에 걸리고 그 다음에는 진균 감염이 발생합니다(51).
이것은 병원체를 감지하고 제거하기 위해 FBXW7 돌연변이를 지닌 숙주 세포의 폐기된 능력에 대한 우리의 관찰을 확증합니다. 따라서 우리의 연구 결과는 CLL 환자의 감염 위험 증가에 대한 예상치 못한 분자 설명을 제공합니다. E3 리가아제 유전자의 유전적 다형성과 세균 감염에 대한 감수성 사이의 연관성은 장티푸스나 나병에 취약한 파킨슨병 환자에 의해 입증되었으며(14), 세균 감염에 대한 숙주 면역 및 유지에 있어 E3 리가아제의 주목할 만한 기여를 시사합니다. 세포 정상 상태.
결론적으로 우리는 후속 제거를 위해 미생물을 인식하기 위해 숙주가 효율적으로 적용할 수 있는 감지 세포질 거주 병원체의 보편적인 언어를 해독했습니다. 종합적으로, 이러한 발견은 항균 면역을 강화하기 위해 활용할 수 있는 기본적인 세포 면역 과정을 이해하는 데 빛을 비춰줍니다.
재료 및 방법
세포 배양
인간 폐포 암종(제II형 폐포세포) 세포주 A549[American Type Culture Collection(ATCC) no. CCL185)] 및 자궁경부 선암종 세포주 HeLa(ATCC 번호 CRM-CCL-2)를 10% 태아 소 혈청(Gibco)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; HiMedia)에서 37도 및 5도에서 배양했습니다. 퍼센트 CO2.
박테리아 균주 및 성장 조건
SPN(R6, 혈청형 2, 영국 버밍엄 대학의 팀 J. 미첼(Tim J. Mitchell) 제공, 영국 버밍엄 대학교)은 5% CO2에서 37도에서 1.5% 효모 추출물이 보충된 Todd-Hewitt 국물에서 성장했습니다. 필요한 경우 다음 항생제를 사용하여 SPN 배양을 성장시켰습니다. 900 마이크로리터의 0.4 OD600(600 nm에서 광학 밀도) 성장된 SPN 배양물을 600 ul의 80% 멸균 글리세롤(32% 최종 글리세롤 농도)과 혼합하고 -80도 냉동고에 보관했습니다. 이러한 글리세롤 스톡을 모든 실험의 시작 접종원으로 사용했습니다.
대장균 DH5 및 STm(ATCC 14028) 배양액은 Luria-Bertani broth(LB)에서 37도, 진탕 조건(200rpm)에서 배양하였으며, 필요에 따라 다음과 같은 항생제를 사용하였다: kanamycin(50 ug/ml), 스펙티노마이신(100 ug/ml), 클로람페니콜(20 ug/ml) 및 암피실린(100 ug/ml). 모든 감염 분석을 위해 박테리아를 OD600 ~0.4까지 성장시킨 다음 숙주 세포를 감염시키기 전에 유사한 밀도로 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁했습니다.
추정되는 유비퀴틴 표적 단백질의 스크리닝
STm 및 SPN 프로테옴에 존재하는 모든 표면 단백질은 출판된 문헌에서 처음 확인되었습니다. 표면 단백질의 완전한 단백질 서열은 UniProt에서 얻은 다음 degron 모티프의 존재를 확인하는 데 사용되었습니다. 출판된 문헌(24, 52, 53)과 Eukaryotic Linear Motif 데이터베이스에서 29개의 추정 데그론 모티프 세트를 선별했습니다. Python의 regex 모듈을 사용하여 표면 단백질 서열에서 이러한 모든 선별된 모티프의 위치를 식별했습니다. 확인된 모든 데그론 모티프 근처(8 내지 14개 아미노산 잔기)의 라이신 잔기의 존재를 확인하기 위해 선형 검색을 추가로 수행하였다. 이 라이신 잔기는 유비퀴틴 모이어티의 부착 부위로 작용하는 것으로 추정됩니다. 마지막으로, 후보에 오른 단백질 서열을 단백질 구조 예측 도구인 IUPred(54)에 공급하여 degron 모티프와 근위 라이신 사이에 무질서한 영역의 존재를 찾습니다. 생성된 단백질(SPN의 경우 BgaA 및 PspA, STm의 경우 RlpA)을 선택하여 유비퀴틴화 표적으로 평가하고 병원균 제거에서의 역할을 해독했습니다.
박테리아 균주 구성
상동 재조합에 의한 대립형질 교환은 SPN 및 STm 모두에서 돌연변이 균주 생성을 위해 삽입된 항생제 카세트를 운반하는 유전자 플랭킹 영역을 사용하여 수행되었다(표 S2).
SPN의 경우 bgaA, pspA 및 그의 유전자의 500-bp 업스트림 및 다운스트림 영역을 적절한 프라이머(표 S3)를 사용하여 게놈에서 증폭하고 pBKS 벡터에서 조립했습니다. 이들 단편의 클로닝 후, 항생제 내성 카세트(bag용 스펙티노마이신 및 hysA용 pspA 및 클로람페니콜)를 이 구조물에 삽입하였다. 이어서, 선형화된 재조합 플라스미드를 역량 자극 펩티드 1(GenPro Biotech)을 사용하여 WT SPN으로 형질전환시키고, 각각의 항생제를 사용하여 재조합체를 선택하고, 유전자 교체를 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 각각의 유전자좌의 시퀀싱에 의해 확인하였다. STm의 경우, λ-red recombinase 방법을 유전자 결실 돌연변이 생성에 사용했습니다(55).
간략하게, 로프 유전자의 말단에 상동인 서열이 카나마이신 내성 카세트의 증폭에 사용되는 프라이머 서열에 부가되었다. 그런 다음 카세트를 WT STm 균주에 전기천공하고 상동 재조합에 의해 생성된 녹아웃을 카나마이신 내성을 기준으로 선택했습니다. 유전자 결실은 PCR 및 유전자좌의 시퀀싱을 사용하여 확인하였다. 전장 pspA, hysA 및 절단된 bgaA-T(1 내지 3168bp)를 셔틀 벡터 pIB166(56)의 P23 프로모터 하에 클로닝하고 보완을 위해 사용하였다.
이러한 재조합 플라스미드는 또한 bgaA-T(bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R 및 bgaATΔDegron), pspA(pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R 및 pspAΔDegron)의 다양한 변이체를 생성하기 위한 부위 지정 돌연변이 유발에 사용되었습니다. ), 그의 (hysADegron-BgaA 및 hysADegron-PspA)를 적절한 프라이머 세트(표 S3)를 사용하여 ΔbgaA 및 ΔpspA 돌연변이체로 형질전환시켰다. 모든 클론은 DNA 시퀀싱으로 확인되었습니다. BgaA, PspA 및 HysA의 상이한 변이체의 발현을 적절한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
항체 및 시약
항-에놀라제 및 항-PspA 혈청(S. Hammerschmidt, 독일 그라이프스발트 대학); 항-BgaA 혈청(S. King, The Ohio State University, USA); 및 His6(Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub 연결(Millipore, 05-1307), K63-Ub 연결(Millipore, 14-6077-80 ), Ply(Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7(Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1(Invitrogen, MA5-15928), Cullin1(Invitrogen, {{15} }), 글리세르알데하이드 포스페이트 탈수소효소(Millipore, MAB374), GSK3[Cell Signaling Technology(CST), D5C5Z], 포스포트레오닌(CST, 9381S), IgA, 쥐 골수종의 Kappa, 클론 TEPC-15(Sigma-Aldrich, M1421) 및 PSMB7(Invitrogen, PA5-111404)을 조달했습니다. 다음과 같은 2차 항체가 사용되었습니다: 양고추냉이 과산화효소(HRP) 태그 항토끼(BioLegend, 406401), HRP 태그 항마우스(BioLegend 405306), 항토끼 Alexa Fluor 488(Invitrogen, A27206), 항토끼 Alexa Fluor 555(Invitrogen, A31572), 비오틴 결합 항마우스 면역글로불린 A(Life Technologies, M31115), 항마우스 Alexa Fluor(Invitrogen, A31570), 항마우스 Alexa Fluor 488(Invitrogen, A21202), 항염소 Alexa Fluor 633(Invitrogen, A21082) 및 FM4-64(Thermo Fisher Scientific, T13320).
단백질 발현 및 정제
BgaA-T 및 그 변이체는 Xba I/Not I 제한 사이트를 사용하여 pET28에 복제되었습니다. N-말단 His-tag를 갖는 BgaA-T를 코딩하는 재조합 플라스미드를 단백질 발현을 위해 대장균 BL21(DE3) 세포로 형질전환시켰다. 갓 형질전환된 콜로니를 37도에서 12시간 동안 카나마이신(50 ug/ml)을 포함하는 LB에서 성장시켰다. 1차 배양액의 1%를 LB broth 1리터에 첨가하고 OD600nm가 0.6에서 0.8 사이에 도달할 때까지 진탕 배양기에서 37도에서 배양했습니다. 단백질 발현은 100 μM isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하고 배양물을 37도에서 5~6시간 동안 150 rpm으로 교반하여 더 성장시켜 유도했습니다.
세포를 6000 rpm에서 10분 동안 4도에서 원심분리하여 수확했습니다. 세포 펠릿을 완충액 A[25mM 트리스(pH 8.0) 및 300mM NaCl]에 재현탁시키고 초음파처리로 용해시켰다. 세포 파편을 원심분리(14,000 rpm, 50분, 4도)로 분리하고, 상층액을 버퍼 A로 평형화한 Ni-NTA 컬럼에 적용했습니다. 컬럼을 10 컬럼 부피의 버퍼로 세척했습니다. A 및 His-태그가 부착된 단백질을 완충액 A에서 이미다졸(250mM)로 용출시켰다. BgaA-T의 모든 변이체를 발현시키고 동일한 절차를 사용하여 정제하였다. Eco RI 제한 효소를 사용하여 pCMV6-Entry-FBXW7 벡터로부터 N-말단 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그를 갖는 pGEX-4 T-1 벡터에 FBXW7을 서브클로닝하였다.
GST 태그 FBXW7은 0.1mM IPTG로 단백질 발현을 유도하고 30도에서 4시간 동안 성장시킨 후 대장균 BL21(DE3) 세포에서 발현되었습니다. E. coli 원유 추출물의 GST-FBXW7을 Glutathione-Sepharose(GE HealthCare) 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제했습니다. 정제된 단백질을 포함하는 분획을 모으고 10-kDa 분자량 컷오프 필터(Amicon)를 사용하여 4700rpm에서 4도에서 원심분리하여 0.5mg/ml까지 농축했습니다. 단백질의 순도는 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 확인한 후 Coomassie blue로 염색하였다.
숙주 세포 형질감염
BgaA-T는 주입 클로닝 키트(Takara)를 사용하여 doxycycline-inducible vector pAK_Tol2_TRE_Blast(Addgene no. 130261)에 클로닝되었습니다. Sanger 시퀀싱으로 양성 클론을 확인했습니다. FBXW7R505C 돌연변이는 pMRX-GFP-FBXW7을 주형으로 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 수행되었으며 Sanger 시퀀싱으로 확인되었습니다. 모든 형질감염은 Lipofectamine 3000 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행되었으며, 선택은 블라스티시딘 하이드로클로라이드(2 ug/ml; HiMedia)의 존재 하에 수행되었습니다.
siRNA 지시 유전자 녹다운
특정 유전자의 RNA 간섭 매개 녹다운을 위해 다음 siRNA가 사용되었습니다. SMARTpool L-003010-00-0005). 간략하게, 24-웰 플레이트에서 성장한 A549 세포는 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 3000을 사용하여 유전자 특정 siRNA 또는 스크램블(siControl)(150pmol)로 일시적으로 형질감염되었습니다. 형질감염 36시간 후, 웨스턴 블롯팅 및 면역형광법 또는 페니실린-젠타마이신 보호 검정을 위해 세포를 처리하였다.
구조 예측 및 모델링
모든 구조는 AlphaFold(Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0)(57)에 의해 예측되었으며 PyMOL(The PyMOL Molecular Graphics System, 버전 2.0 Schrödinger, LLC)을 사용하여 시각화되었습니다. 구조는 정렬된(파란색)에서 무질서한(빨간색)에서 흰색까지 범위의 IUPred(54) 점수를 기반으로 PyMol에서 색상으로 구분되었습니다.
웨스턴 블로팅
{0}}.4 OD600nm까지 성장한 SPN 배양물을 초음파 처리로 용해시키고, 원심분리(15,000 rpm, 30분, 4도) 후 조 추출물을 수집하였다. A549의 경우 단층을 PBS로 여러 번 세척하고 얼음처럼 차가운 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 완충액[50mM tris-Cl(pH 7.89), 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% 나트륨에서 용해했습니다. 데옥시콜레이트 및 1% SDS] 프로테아제 억제제 칵테일(Promega), 불화나트륨(10mM) 및 EDTA(5mM)를 포함합니다. 세포 현탁액을 간단히 초음파 처리하고 원심분리하여 세포 용해물을 수집했습니다. 박테리아 또는 A549 세포 용해물(10 또는 20ug)에 존재하는 단백질을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리하고 활성화된 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 옮겼습니다. 5% 탈지유에서 블로킹한 후 멤브레인을 적절한 1차 및 HRP 태그가 붙은 2차 항체로 조사했습니다. 블롯은 향상된 화학발광 기질(Bio-Rad)을 사용하여 마지막으로 개발되었습니다.
페니실린-겐타마이신 보호 분석
0.2% 효모 추출물(THY)이 보충된 Todd-Hewitt 국물에서 OD600nm 0.4까지 성장한 SPN 균주를 펠릿화하고 PBS에 재현탁했습니다( pH 7.4), 감염 다중도(MOI)가 10인 A549 단층의 감염을 위한 검정 배지에 희석하였다. 감염 1시간 후, 단층을 DMEM으로 세척하고 페니실린(10ug/ml)을 함유하는 검정 배지와 함께 배양하였다. ) 및 겐타마이신(400 ug/ml)을 2시간 동안 처리하여 세포외 SPN을 죽였습니다. 그런 다음 세포를 0.025% Triton X-100로 용해하고 용해물을 Brain Heart Infusion 한천 플레이트에 플레이팅하여 생존 가능한 SPN을 계산했습니다. 백분율 침습은 [감염에 사용된 용해물의 콜로니형성 단위(CFU)/CFU] × 100으로 계산되었습니다. 세포 내 생존을 평가하기 위해 감염 후 9시간(페니실린-겐타마이신 처리 시작부터)에 세포 용해물을 다음과 같이 준비했습니다. 위에서 언급한 확산도금균과 생존균을 열거하였다. 생존 효율(백분율)은 표시된 시점(0시간으로 정규화됨)에서 대조군에 비해 생존율의 배수 변화로 표시되었습니다.
면역형광
면역 형광 분석을 위해 A549 또는 HeLa 세포를 유리 커버슬립에서 성장시키고 MOI ~25에서 1시간 동안 SPN 또는 STm 균주로 감염시킨 후 2시간 동안 항생제 처리하였다. 감염 후 원하는 시점(A549s에서 SPN 감염의 경우 9시간, HeLa에서 STm 감염의 경우 3시간)에 세포를 DMEM으로 세척하고 얼음으로 냉각된 메탄올로 -20도에서 10분 동안 고정했습니다. 또한, 커버슬립을 실온(RT)에서 2시간 동안 PBS 중 3% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단했습니다. 이어서 세포를 4℃에서 밤새 PBS 중 1% BSA 중의 적절한 1차 항체로 처리하고, PBS로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중 1% BSA 중의 적합한 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로 커버슬립을 PBS로 세척하고 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSM 780, Carl Zeiss)을 사용하여 시각화를 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(Vector Laboratories)이 있거나 없는 VECTASHIELD와 함께 유리 슬라이드에 장착했습니다. ) 40× 또는 63× 오일 대물렌즈 아래. 이미지는 광학 절편 후에 획득한 다음 ZEN lite 소프트웨어(버전 5.0)를 사용하여 처리했습니다. 초고해상도 현미경 검사는 SIM 모드에서 Elyra 7(Carl Zeiss)을 사용하여 유사하게 수행되었습니다. colocalization 분석을 위해 박테리아는 복제당 n > 100 박테리아의 시각적 계수로 점수를 매겼습니다.
투과 전자 현미경
SPN 및 STm으로 감염시킨 후, 세포를 {0}}.1M 카코딜산 나트륨 완충액으로 세척하고, 0.1M 카코딜산 나트륨 완충액( Sigma-Aldrich) 4도에서 3시간 동안 . 고정 후 세포 스크레이퍼를 통해 세포를 수집하고 2000 rpm에서 10분 동안 펠릿화했습니다. 이어서 세포를 0.1M 소듐 카코딜레이트 완충액으로 세척하고 0.1M 소듐 카코딜레이트 완충액 중 1% 오스뮴 테트록사이드로 4도에서 20분 동안 후고정하였다. cacodylate 완충액과 증류수로 연속적으로 세척한 후, 세포를 에탄올(50, 70, 95 및 100%) 및 프로필렌 옥사이드의 농도를 증가시키면서 30분 동안 탈수하고 마지막으로 에폭시 수지(Electron Microscopy Sciences, 14300)에 45분 동안 75도에서 중합. 이어서, 캡슐을 45분 동안 95도 오븐으로 옮겼다. 극박 절편(70nm)을 Leica EM UC7 Ultramicrotome의 다이아몬드 나이프를 사용하여 절단하고 2% 우라닐 아세테이트 및 1% 시트르산 납으로 염색하고 투과 전자 현미경(Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 120KV에서 관찰했습니다.
생체 외 유비퀴틴화
A{0}}발현 BgaA-T 및 변이체에 MG132(5μM)를 처리하고 독시사이클린(100ug/ml)으로 24시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 그런 다음 세포를 RIPA 완충액에 용해시키고 샘플을 SDS-PAGE(8%)로 전기영동했습니다. BgaA-T 및 그 변이체의 단백질 발현 및 유비퀴틴화의 확인은 각각 항-BgaA 및 항-K48-Ub 항체로 프로빙한 후 웨스턴 블롯으로 입증되었습니다.
체외 유비퀴틴화
시험관 내 유비퀴틴화 분석을 위해, 재조합 단백질을 앞서 기술한 바와 같이 정제하였다(58). SCFFBW7 E3 리가제 복합체를 재조합 0.1 mM E1(UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2(cdc34; Boston Biochem) 및 유비퀴틴(2.5 ug/ml; Boston Biochem) 정제된 BgaA-T 및 그 변이체의 존재. Ubiquitylation 반응은 assay buffer [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenosine triphosphate (ATP), 1 mM -mercaptoethanol, and 0.1% Tween 20]에서 25도에서 2시간 동안 수행되었습니다. . 반응을 5X Laemmli 완충액으로 중단하고, SDS-PAGE 겔에서 분석하고, 항-BgaA 항체를 사용하여 면역블롯팅으로 분석했습니다.
체외 키나아제 분석
시험관 내 키나아제 분석을 수행하기 위해 GSK3 키나아제 효소 시스템(Promega)을 제조업체의 프로토콜에 따라 다음과 같이 수정하여 사용했습니다. 요약하면, 재조합 BgaA-T 3㎍을 40mM 트리스(pH 7.5), 20mM MgCl , BSA(0.1mg/ml) 및 50μM 디티오트레이톨. 반응을 30도에서 2시간 동안 인큐베이션하고 1X Laemmli 완충액을 첨가하여 중단시켰다. 그런 다음 샘플을 끓여서 앞에서 언급한 대로 Western blotting을 위해 전기영동했습니다. 인산화된 BgaA-T는 항-포스포트레오닌 항체로 검출되었다.
생체 내 모델
All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >시작 체중의 20%, 현저한 콧물 또는 눈 분비물. 말기 마취 하에 심장 천자에 의해 혈액 샘플을 얻었고, 박테리아 계수를 위해 비장을 사후 절제하였다. 조직 샘플을 휴대용 조직 균질기로 처리하고 균질물을 혈액 한천 플레이트에 점적하기 전에 PBS에서 연속 희석했습니다. 플레이트를 37도, 5% CO2에서 밤새 배양하고 박테리아 콜로니 수를 다음 날 평가했습니다.
통계 분석
GraphPad Prism 버전 5는 통계 분석에 사용되었습니다. 개별 실험에 대해 수행된 통계 테스트는 해당 그림 범례에 언급되어 있습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 데이터는 정규성에 대해 테스트되었고 테스트된 각 그룹의 분산을 정의했습니다. 모든 다중 매개변수 분석에는 다중 비교에 대한 수정이 포함되었으며 달리 명시되지 않는 한 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.
참조 및 참고
ME Bianchi, DAMPs, PAMPs 및 alarmin: 위험에 대해 알아야 할 모든 것. J. 루콕. 비올. 81, 1–5(2007).
2. TH Mogensen, 선천적 면역 방어에서의 병원체 인식 및 염증 신호. 클린. 미생물. 22, 240–273(2009).
3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Life on the inside: 세포질 박테리아의 세포내 라이프스타일. Nat. Microbiol 목사. 7, 333–340(2009).
4. X. Jiang, ZJ Chen, 면역 방어 및 병원체 회피에서 유비퀴틴화의 역할. Nat. Immunol 목사. 12, 35–48(2011).
5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, 박테리아 숙주-병원체 상호 작용 내의 유비퀴틴화 시스템. 미생물 9, 638(2021).
6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, 살모넬라 티피뮤리움 감염에 대한 숙주 및 박테리아 유비퀴티놈의 글로벌 분석. 몰. 셀 62, 967–981(2016).
7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, 결핵균 표면 단백질은 유비퀴틴을 모집하여 숙주 제노파지를 유발합니다. Nat. 공동. 1973년 10월 (2019).
8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, 박테리아 감염 중 RNF213에 의한 지질다당류의 편재화. 자연 594, 111–116(2021).
9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubiquitin ligase 복합체는 박테리아 표면 글리칸 인식을 통해 제노파지를 지시합니다. EMBO 담당자 22, e52584(2021).
10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, 라이신 메틸화는 유비퀴틴화 및 자가포식으로부터 세포내 병원체를 보호합니다. 과학. 고급 7, eabg2517(2021).
11. J. Celli, LRSAM1, 박테리아에 대한 감각이 있는 E3 유비퀴틴 리가제. 세포 숙주 미생물 12, 735–736 (2012).
12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, ubiquitin ligase Smurf1은 결핵균의 선택적 자가포식과 항결핵 숙주 방어에서 기능합니다. 세포 숙주 미생물 21, 59–72 (2017).
13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBAC 합성된 선형 유비퀴틴 사슬은 자가포식 및 NF-κB를 활성화하여 세포질을 침범하는 박테리아를 제한합니다. Nat. 미생물. 2, 17063(2017).
14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, 유비퀴틴 리가제 파킨은 세포내 병원균에 대한 저항성을 매개합니다. 자연 501, 512–516(2013).
15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, 세포질 살모넬라를 대상으로 하는 숙주 세포 유비퀴틴화 기계 확장. EMBO 담당자 18, 1572–1585 (2017).
For more information:1950477648nn@gmail.com
