mRNA 백신은 STING 의존성 항종양 면역 반응을 유도합니다
Dec 07, 2023
추상적인
지질 제제 RNA 백신은 질병 예방 및 치료에 널리 사용되어 왔지만, 그 작용 메커니즘과 그러한 작용에 기여하는 개별 구성 요소는 아직 설명되지 않았습니다. 여기서 우리는 프로타민/mRNA 코어와 지질 껍질로 구성된 치료용 암 백신이 세포독성 CD8+ T 세포 반응을 촉진하고 항종양 면역을 매개하는 데 매우 강력하다는 것을 보여줍니다. 기계적으로, 수지상 세포에서 I형 인터페론과 염증성 사이토카인의 발현을 완전히 자극하려면 mRNA 코어와 지질 껍질이 모두 필요합니다. 인터페론-b 발현 자극은 전적으로 STING에만 의존하며, Sting 유전자에 결함이 있는 쥐에서는 mRNA 백신의 항종양 활성이 크게 저하됩니다. 따라서 mRNA 백신은 STING 의존성 항종양 면역을 유도합니다.
남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능
1. 소개
SARS-CoV-2 감염 예방을 위한 mRNA 백신의 신속한 개발과 전 세계적 적용은 의료 분야에서 mRNA 기반 약물의 힘을 입증했습니다1,2. 분자량이 크고 음전하를 띠기 때문에 mRNA 분자는 포유동물 세포에 효과적으로 들어가려면 전달 수단에 포장되어야 합니다. 나노미터 크기 전달 수단으로 포장하면 mRNA 분자가 효소 분해로부터 보호되는 이점도 있습니다. 지질 나노입자4, 지질 폴리플렉스(LPP)5, 리포좀-프로타민-RNA(LPR)6, RNA 리포플렉스(RNA-LPX)7, 바이러스 유사 백신 입자(VLVP) 등 목적에 맞게 다양한 전달 플랫폼이 개발되었습니다. )8. 각 플랫폼에는 고유한 구조와 구성이 있지만 대부분의 차량에는 mRNA 포장과 엔도솜에서 mRNA 분자의 탈출을 촉진하는 이온성 지질 분자가 포함되어 있습니다. 예방적 백신의 성공으로, mRNA 치료제가 아마도 전부는 아니더라도 대부분의 질병 유형을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것이 일반적으로 인식되었습니다9e12. 실제로 mRNA 기반 치료 암 백신은 수년 동안 연구되어 왔습니다13,14. 최근 임상 시험의 발전을 통해 특정 암 환자에게 적용 가능성이 입증되었습니다15e17. 보조 분자로 제조된 펩타이드 암 백신과 달리18e20, mRNA 백신 입자는 자가 보조제 역할도 할 수 있습니다21.
예를 들어, 유리 및 프로타민 복합체 mRNA를 포함하는 2성분 mRNA 기반 암 백신은 TLR7(톨 유사 수용체 7) 신호 전달을 활성화할 수도 있습니다22. 그러나 Naked mRNA의 급성 선천성 면역 독성에 대한 우려가 증가함에 따라 대부분의 연구자와 회사는 TLR에 의한 선천적 인식을 피하기 위해 변형된 RNA를 사용하고 있습니다. 결과적으로, 지질 성분은 우선적으로 비TLR 신호전달을 활성화함으로써 mRNA 백신 입자에서 아주반트 활성을 향상시키는 데 중요한 역할을 하고 있습니다. 1,2- 디옥타데세닐-3-트리메틸암모늄(DOTMA, 양이온성 지질)/디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE, 보조 지질) 리포솜으로 구성된 지질 제제화, 음전하를 띤 RNA-LPX에 대한 최근 연구에서 밝혀졌습니다. 전염증성 사이토카인의 분비를 조절하는 인터루킨 1(IL1)-인터루킨 1 수용체 길항제(IL{18}}ra) 축의 활성화, 단핵구에서 2단계 염증복합체 경로를 활성화하는 필수 역할24. 흥미롭게도 ALC-0315(이온화된 지질), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC, 보조 지질)으로 제조된 LNP 기반 BNT162b2에 대한 또 다른 최근 조사가 있습니다. , 폴리에틸렌 글리콜-2000-N, N-디 테트라데실 아세트아미드(PEG2000-DTA) 및 콜레스테롤은 I형 인터페론 의존성 MDA5 신호를 활성화하는 핵심 역할을 나타냈지만 TLR이나 염증복합체는 활성화하지 않았습니다. 코로나-19 백신의 선천적 및 적응적 면역25. 이러한 연구는 가변 지질 분자로 구성된 전달 플랫폼이 백신 활성을 위한 다양한 신호 전달 경로에 의존할 수 있다는 가능성을 지적합니다. 따라서 mRNA 치료제를 더욱 개선하기 위해서는 주요 분자의 기능과 그 조합을 완전히 조사하는 것이 중요합니다.
현재 연구에서 우리는 치료용 암 백신에서 개별 구성 요소의 기능적 역할을 분석하기 위한 실험을 설정했습니다. mRNA 백신 입자(MVP)는 양이온성 지질, 보조 지질, 페길화된 지질 및 콜레스테롤로 구성된 지질 껍질에 캡슐화된 프로타민/mRNA 코어로 구성됩니다(그림 1A). 하전된 지질을 포함하면 표적화된 RNA 전달을 촉진할 수 있다는 것이 입증되었으며26 디올레오일에틸 포스파티딜콜린(EDOPC)과 디올레오일-3- 트리메틸암모늄 프로판(DOTAP)은 이러한 목적으로 테스트된 양이온성 지질 중 두 가지입니다5,27. mRNA 코어, mRNA-free vehicle 및 전체 MVP에 의한 인터페론-b(IFN-b), IL{7}}b 및 종양 괴사 인자-a(TNF-a)의 발현 자극을 조사했으며, 이러한 활동을 TLR7, 미토콘드리아 항바이러스 신호(MAVS, IPS{12}}라고도 함), IFN 유전자 자극제(STING) 및 TIR 도메인 함유 어댑터 유도 IFN-b(TRIF) 신호와 연관시켰습니다. 이어서, 우리는 IFN-b 및 TNF-α 발현을 자극하는 데 있어 코어의 프로타민과 껍질의 양이온성 지질의 역할을 조사했습니다. 마지막으로, 우리는 야생형 마우스와 유전자 녹아웃 마우스에서 MVP의 항종양 면역 반응을 비교했습니다.
cistanche tubeulosa-항종양의 장점
2. 재료 및 방법
2.1. 재료
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDOPC)(890704), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜-에탄올아민(DOPE)(850725 ), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- 디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)(890890), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)(850375)은 Avanti Polar Lipids, Inc.(850375)에서 구입했습니다. 버밍엄, 앨라배마, 미국). 콜레스테롤(C8667)은 Sigma-Aldrich(Saint Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 시약은 DSPE-PEG2k의 경우 2 mg/mL, 콜레스테롤 및 DOPC의 경우 10 mg/mL, EDOPC, DOPE 및 DOTAP의 경우 각각 20 mg/mL의 농도로 에탄올에 용해되었습니다. 황산프로타민(P4020)은 Sigma Aldrich에서 구입했습니다. 오브알부민(OVA-mRNA)(L-7210), eGFP(eGFP mRNA)(L{45}}) 및 루시퍼라제(Luc-mRNA)(L-7204)를 코딩하는 mRNA 분자는 다음에서 구입했습니다. TriLink Biotechnologies(미국 캘리포니아주 샌디에고). RNase가 없는 물(W0805-010)은 GeneDEPOT(Baker, TX, USA)에서 구입했습니다. TLR7 작용제 이미퀴모드(tlrimq) 및 Sting 작용제 20 30 - cGAMP(tlrl-nacga23)는 Invivogen(San Diego, CA, USA)의 제품이었습니다. Lipofectamine 2000(11668019) 및 Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 분석 키트(R11490)는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다. 재조합 마우스 GM-CSF(554586)는 BD Biosciences(San Diego, CA, USA)에서 구입했습니다. 500 단백질 수송체 억제제 칵테일(00-4980-93)은 Invitrogen의 제품이었습니다. Cytofix/Cytoperm 키트(AB_2869010)는 BD Biosciences에서 구입했습니다. EasySep™ 마우스 T 세포 분리 키트(19851)는 STEMCELL Technologies, Inc.(Vancouver, BC, CAN)에서 구입했습니다. 다음 항체는 BioLegend(San Diego, CA, USA)에서 획득했습니다: 항-CD80-PE-Cy7(104734), 항-CD86-FITC(105006), 항-CD11b-APC- Cy7(101226), 항CD8-BV510(100752), 항CD44-APC(103012), 항CD69-APC(104514) 및 항H{89 }}Kb(SIINFEKL)-PE(141604), 항CD64- PE-Cy7(139314), 항B220-APC(103212), 항MHCII-BV711(107643) 및 CD 방지{105}}PE(121406). 항-CD{108}FITC(553723), 항-LY6C-AF700(557979), 항-IFN-g-PE(554412)는 BD Biosciences에서 구입했습니다. OVA257e264-MHCI dextramerPE(JD2163)는 ImmuDex(Fairfax, VA, USA)에서 구입했습니다. IL-1b(EM2IL1B) 및 TNF-a(BMS{126}})에 대한 ELISA 키트는 Invitrogen에서 구입했으며 CCL5(DY478) 및 IFN-b(DY8234)에 대한 ELISA 키트는 R&D Systems에서 구입했습니다. , Inc.(미국 미네소타주 미니애폴리스). 항-MAVS(4983), 항-STING(13647), 항-TBK1(3504), 항포스포-TBK1(5483), 항-b-액틴(4970) 및 항-GAPDH(5174)를 포함한 웨스턴 블롯 분석용 항체 Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA, USA)에서 구입했습니다.
그림 1 mRNA 입자의 준비 및 특성 분석. (A) 백신 입자 준비의 개략도. (B) 아가로스 겔 전기영동은 mRNA 분자가 1:1 ~ 1:2 비율로 mRNA/프로타민으로 제조된 샘플의 샘플 로딩 웰에 유지되었음을 보여줍니다. (CeF) 캡슐화 비율, 다분산 지수, 제타 전위 및 크기를 기반으로 한 mRNA 백신 입자(MVP)의 특성 분석. (G) MVP2 입자의 대표적인 TEM 이미지, 스케일 바 Z 50 nm. (H) DC2.4 세포를 16시간 동안 eGFP-MVP로 처리한 후 eGFP 발현 비율. (I) eGFP 발현 DC2.4 세포의 형광 이미징, 스케일 바 Z 400 mm. (J) 16시간 동안 루시퍼라제 코딩 mRNA로 캡슐화된 MVP로 처리된 BMDC의 생물발광에 대한 정량 분석. (K) PBS, mRNA가 없는 비히클, mRNA/프로타민 코어 또는 mRNA 캡슐화 MVP2로 처리된 BMDC의 생존 가능성 변화. 처리 농도는 mRNA와 동일했습니다. 데이터는 평균 SEM(n Z 3)으로 표시됩니다. *P < 0.05; **P < 0.01.
2.2. 세포주 및 세포 배양
DC2.4 쥐 수지상 세포주는 ATCC(Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 10% 태아소혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 RPMI-1640에서 배양하였다. 쥐 흑색종 세포주 B16-OVA는 Dana-Farber Cancer Institute(Boston, MA, USA)의 Kenneth Rock 박사로부터 구입했습니다. B16-OVA 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양했습니다. 쥐 결장 선암종 세포주 MC38은 ATCC에서 구입했습니다. 세포를 OVA 발현으로 조작하고 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 배양했습니다. 세포 배양은 5% CO2와 함께 37℃에서 유지되었습니다.
cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.
2.3. mRNA 백신 입자 준비
모든 mRNA 백신 입자는 Precision Nanosystems, Inc.(Vancouver, BC, CAN)의 NanoAssemblr Benchtop 미세유체 기기를 사용하여 유기상과 수성상을 혼합하여 제조되었습니다. 유기상을 제조하기 위해 EDOPC(20mg/mL), DOPE(20mg/mL), 콜레스테롤(10mg/mL) 및 bis-DSPE-PEG2k(2mg/mL)을 에탄올에 용해시키고 34℃에서 혼합했습니다. :30:35:1 M 비율, 유속 9mL/분. 수성상 mRNA 코어를 준비하기 위해 mRNA를 미세유체 기기에서 9mL/분의 유속으로 황산프로타민과 1:1(w/w)로 혼합했습니다. 20℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 수성상 mRNA 코어를 유기상과 혼합하여 mRNA 백신 입자를 생성했습니다. 20분 후, 백신 입자 현탁액을 Amicon 원심분리 필터(MWCO 30 kDa)로 옮기고 9-부피의 분자급 물을 첨가하여 에탄올 농도를 25%에서 2.5%로 희석시켰다. 이어서, 입자 현탁액을 4℃에서 2000g(Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 원심분리하여 농축하였다. 농축된 생성물에 동일한 부피의 2 PBS를 첨가하여 삼투압을 조정하였다.
2.4. 겔 지연 분석
mRNA/프로타민 코어는 먼저 겔 지연에 의해 분석되었습니다. 간략히 설명하면, 0.5 mg의 mRNA를 함유하는 mRNA/프로타민 코어를 1 TBE 용액에 용해된 1% 아가로스 겔의 웰에 로딩하고 120 V에서 30분간 전기영동을 수행하였다(PowerPac™, BioRad Co., Ltd., 캘리포니아주 허큘리스). RNA 밴드는 Gelred(Biotium, Hayward, CA)로 염색하고 GelDoc 시스템(Gel Doc XR+, BioRad Co., Ltd.)으로 검출했습니다.
2.5. mRNA 백신 입자의 특성 분석
크기 분포와 제타 전위는 동적 광산란 Zetasizer(Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, USA)를 사용하여 측정되었습니다. 캡슐화율은 Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 분석 키트를 사용하여 결정되었습니다. 간략히 말하면, 0.5mg의 mRNA를 함유하는 백신 입자 샘플을 0 2% Triton-X100이 포함되거나 포함되지 않은 TriseEDTA 완충액(10mmol/L TriseHCl, 1mmol/L EDTA, pH 7.5)으로 희석되었습니다. {10}}웰 플레이트. 37C에서 10분 동안 배양한 후 RiboGreen을 각 웰에 첨가하고 형광 강도를 측정했습니다. 캡슐화 효율은 Eq.와 같이 계산되었습니다. (1): 백신 입자의 투과전자현미경(TEM)은 이전에 설명한 절차에 따라 수행되었습니다9.
2.6. 동물
모든 동물 수술은 휴스턴 감리교 병원의 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호 AUP06200042)의 승인을 받았습니다. 마우스는 국립 보건원(National Institute of Health) 및 미국 실험 동물 관리 협회(American Association of Laboratory Animal Care) 표준의 규제 표준을 완전히 충족하는 환경에 보관되었습니다. 야생형 C57BL/6J 마우스 및 Tlr7/, Sting/, Mavs/ 및 Trif/마우스를 포함하는 유전자 조작 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입했습니다.
2.7. 쥐 골수 유래 수지상 세포(BMDC)의 생성
완전한 RPMI 1640을 사용하여 대퇴골과 경골에서 골수 세포를 씻어냈습니다. 적혈구를 ACK 용해 완충액으로 용해하고 미성숙 골수 세포를 20ng/mL 재조합 쥐 GM-CSF가 보충된 RPMI 1640에서 10분간 배양했습니다. 37C, 5% CO2에서 일합니다. 세포 배양 배지는 3일, 6일, 8일에 새로워졌고, 비부착성 수지상 세포는 10일에 수집되었습니다.
2.8. 사이토카인 및 케모카인 측정
BMDC는 24-웰 플레이트에 5 105 세포/웰의 밀도로 시딩되었습니다. 정착 1시간 후, 세포를 1 mg/mL 이미퀴모드, 20 mg/mL 20 30 -cGAMP, (1 mg/mL mRNA 등가) 백신 입자 또는 대조군으로 처리했습니다. 24시간 후에 세포 배양 배지를 수집하고 제조업체가 제안한 절차에 따라 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석) 키트를 사용하여 TNF-a, CCL5, IFN-b 및 IL{11}}b의 수준을 측정했습니다.
시스탄체 식물의 면역 체계 증가
2.9. DC 형질감염, DC 성숙 및 자극에 대한 분석
시험관 내에서 DC 형질감염 효율을 분석하기 위해 DC2.4 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 2.5 105 세포로 시딩했습니다. 세포를 eGFP- 또는 루시퍼라제-인코딩 mRNA-캡슐화 입자로 1 mg mRNA/mL의 최종 농도로 처리했습니다. 24시간 후 세포를 수확하고 PBS 용액에 용해된 2% FBS로 세척한 다음 동일한 용액에 재현탁한 후 BD LSR II 유세포 분석기(LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 유세포 분석에 적용했습니다. . 시험관 내에서 DC 성숙 및 항원 제시를 측정하기 위해 BMDC를 24-웰 플레이트에 2.{12}} 세포/웰로 시딩하고 24시간 동안 1 mg/mL OVA-MVP로 처리했습니다. BMDC는 DC 성숙을 위한 CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 및 CD{21}}에 특이적인 항체와 항원 제시를 위한 항-H{23}}Kb(SIINFEKL)로 30분 동안 염색되었습니다. 생체 내 자극 효능을 확인하기 위해 C57BL/6J 마우스의 발바닥에 마우스당 OVA-MVP 10mg을 1회 백신 접종하고 배수 슬와 LN을 수확하고 24, 48 세포 표면 마커: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.
2.10. T 세포 활성화 및 증식에 대한 유세포 분석
생체 내에서 T 세포 활성화를 측정하기 위해 마우스에 OVA-MVP 10mg을 1회 백신 접종하고 24시간 또는 48시간에 슬와 림프절을 분리했습니다. T 세포는 CD45, CD3, CD4, CD8 및 CD69 항체로 염색되었습니다. 항원 특이적 T 세포를 검출하기 위해 2차 백신 접종 5일 후 종양, 비장, 슬와 림프절을 채취했습니다. 조직을 처리하여 단일 세포 현탁액을 생성하고 세포를 제조업체의 지침에 따라 T 세포 특이적 항체 및 OVA257e264-MHCI 덱스트라머로 염색했습니다. 세포내 IFN-g 수준을 측정하기 위해, 슬와 림프절 및 종양에서 분리된 2 106 비장세포 또는 세포를 55mmol/L b-메르캅토에탄올 및 1가지 단백질 수송체 억제제가 보충된 완전 RPMI 1640 배지에서 10mg/mL OVA257e264 펩티드로 자극했습니다. 18시간 칵테일 세포를 수확하고 T 세포 특이적 항체로 염색했습니다. Cytofix/Cytoperm 키트를 사용한 고정 및 투과성화 후, 세포를 항-IFN-g 항체로 염색하고 BD LSR II 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 분석을 위해 적용했습니다. T 세포 증식을 측정하기 위해, 마우스 T 세포 분리 키트를 사용하여 OT-1 형질전환 마우스의 비장으로부터 T 세포를 분리하였다. 200mg/mL BSA를 함유한 RPMI 1640에서 1mmol/L CFSE로 37℃에서 10분 동안 염색했습니다. CFSE 표지 T 세포를 5부피의 차가운 완전 RPMI 1640으로 2회 세척했습니다. 그 동안 성숙한 BMDC를 T 세포 분리 전 24시간 동안 2 mg/mL OVA mRNA 캡슐화 MVP. T 세포가 준비되면 BMDC와 T 세포를 1:5(DC:T)의 비율로 72시간 동안 공동 배양했습니다. 세포를 수집하고 T 세포에 대한 표면 항체로 염색하고, BD LSR II 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 증식을 테스트하고 분석했습니다. 모든 유세포분석 결과는 FlowJo v10 소프트웨어(Ashland, OH, USA)를 사용하여 분석되었습니다.
2.11. 살아있는 쥐의 단백질 발현 추적
BALB/c 마우스에 Luc mRNA 캡슐화 MVP 10mg을 발바닥 내 주사하여 치료했습니다. 6시간, 12시간, 24시간 또는 48시간 후에 마우스당 RediJect D-루시페린 30mg을 복강 내 주사하고 Xenogen IVIS{9}} 이미징 시스템(Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, 매사추세츠, 미국).
2.12. ELISpot 분석
IP 필터 플레이트를 50mL의 35% 에탄올로 미리 헹구고 에탄올이 증발하기 전에 PBS로 3회 철저하게 세척했습니다. 이어서 플레이트를 항-IFN-g 포획 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 55mmol/L b-메르캅토에탄올을 함유하는 RPMI 1640 완전 배지로 37℃에서 2시간 동안 차단했습니다. 세포(1 105 비장세포, 슬와 LN의 1 105 세포)를 각 웰에 접종하고, 10 mg/mL OVA257e264 펩티드로 36시간 동안 자극했습니다. 배지를 버리고, 세포를 PBST(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)로 4회, PBS로 2회 세척하였다. 최종 세척 후 항-IFN-g 검출 항체를 첨가하고 암실의 실온에서 2시간 동안 배양했습니다. 플레이트를 PBST로 4회, PBS로 2회 세척하고, 아비딘-HRP를 첨가하고 암실의 실온에서 추가로 45분 동안 인큐베이션했습니다. 마지막으로, 상기한 바와 같이 플레이트를 PBST 및 PBS로 다시 세척하고, AEC 기질 50mL를 적용하고 스팟 반응을 관찰하였다. 얼룩이 보이면 AEC 기판을 버리고 이중 증류수로 5회 플러싱하여 반응을 중단했습니다. 밤새 공기 건조시킨 후, CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot 분석기(S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, USA)를 사용하여 플레이트를 스캔하고 분석했습니다.
2.13. 웨스턴 블롯 분석
야생형, Mavs KO 또는 Sting KO 마우스로부터 유래된 BMDC를 수집하고, 세포를 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 보충된 RIPA 세포 용해 완충액에서 용해시켰다. 세포 용해물의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정되었습니다. 단백질 샘플을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮겼습니다. MAVS 및 STING 발현은 1:2000 희석 비율로 항-MAVS 또는 항-STING 항체와 함께 멤브레인을 배양한 후 SuperSignal West Pico 및 Femto Chemiluminescent Substrate를 사용하여 면역 검출한 후 검출되었습니다. STING 경로의 활성화를 측정하기 위해 야생형 마우스에서 유래된 BMDC를 비히클 또는 OVA mRNA로 캡슐화된 MVP로 표시된 농도에서 2시간 동안 처리했습니다. 세포를 용해시키고 1:2000 희석에서 항-TBK1 및 항포스포-TBK1 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 진행했습니다.
2.14. 항종양 분석
마우스 종양 모델은 마우스당 2 105 세포 B16-OVA 흑색종 세포 또는 5 105 MC38-OVA 세포를 6 내지 {{5}의 왼쪽 옆구리에 피하 접종하여 생성되었습니다. }주령 암컷 C57BL/6J 마우스. 마우스를 치료 그룹으로 무작위로 할당하고 7일 간격으로 10mg의 OVA MVP 또는 대조군을 발바닥에 두 번 치료했습니다. 종양 성장을 2일마다 모니터링하였다. 종양 부피는 Eq. (2):
2차 백신 접종 5일 후 마우스를 안락사시키고, 종양 조직의 무게를 기록하였다.
2.15. 통계 분석
모든 결과는 평균 SEM으로 표시됩니다. 통계는 다중 그룹 비교를 위한 Tukey 보정과 두 그룹 비교를 위한 짝이 없는 양측 t-테스트를 사용하는 일원 분산 분석 테스트로 평가되었습니다. 데이터는 GraphPad Prism v8.0.2 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. P < 0.{{10}}5는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005; ****P < 0.001).
3. 결과
3.1. MVP는 수지상 세포(DC)에서 강력한 mRNA 발현을 중재합니다.
우리는 2단계 미세 유체 접근법(그림 1A)으로 코어-쉘 백신 입자를 준비하고 나노입자의 개별 구성 요소를 체계적으로 평가하여 DC에서 높은 안정성, 높은 세포 흡수 및 높은 발현 가능성을 가진 백신 입자를 조립했습니다. 겔 전기영동을 통해 mRNA 대 프로타민 비율이 1 이하가 되면 안정적인 mRNA 코어가 형성될 수 있음이 밝혀졌습니다(그림 1B). eGFP 인코딩 mRNA를 대리 마커로 사용하여 우리는 34% EDOPC/30% DOPE/35% 콜레스테롤/1% DSPEPEG2k 몰비의 지질 조성이 이상적인 캡슐화 속도와 최고의 발현 효율을 제공한다는 것을 발견했습니다(표 1, 지원 정보 그림 S1AeS1D). 전하 비율을 변경해도 입자의 캡슐화 속도, 다분산 지수 또는 표면 전하가 크게 변경되지 않았습니다(표 2, 그림 1CeE). 그러나 생성된 입자의 크기는 비율이 12와 16 사이일 때 직경이 70~80 nm였으며, 비율이 범위를 벗어나면 직경이 120e130 nm였습니다(그림 1F 및 G). 전하비가 12인 MVP2로 처리된 DC2.4 세포에서 가장 좋은 발현이 검출되었습니다(그림 1H 및 I). 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA로 입자를 제조한 경우 유사한 패턴이 관찰되었으며, 용량 의존적 발현이 검출되었습니다(그림 1J). mRNA로 캡슐화된 입자는 동결건조 또는 동결-해동 후에도 활성을 잃지 않았기 때문에 바람직한 안정성을 나타냈습니다(그림 S1E 및 S1F). 또한 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 mRNA 코어 단독, mRNA 분자 없이 제조된 비히클 입자 또는 mRNA 함유 MVP2로 처리한 후에도 세포 독성이 없었습니다(그림 1K). 따라서 MVP2는 최고의 발현 가능성을 보여주었습니다. 이는 연구의 모든 추가 실험에 사용되었으며 나머지 텍스트에서는 MVP로 표시되었습니다. MVP 입자는 생체 내에서 mRNA 분자를 효과적으로 전달할 수 있었고, 체중 변화에 따라 mRNA로 캡슐화된 MVP에서는 검출 가능한 독성이 없었습니다(그림 S1GeS1I).
3.2. MVP는 시험관 내 및 생체 내에서 항원 제시 및 T 세포 활성화를 효과적으로 유도합니다.
우리는 mRNA 코어, mRNA가 없는 비히클 및 OVA mRNA 캡슐화 MVP를 준비하고 이를 DC 성숙 및 항원 제시 테스트에 적용했습니다(그림 2A). MVP로 처리된 BMDC는 CD40, CD80 및 CD86를 포함한 DC 성숙 마커의 용량 의존적 과발현을 나타냈습니다(그림 2BeD). mRNA가 없는 비히클 또는 mRNA로 캡슐화된 MVP로 처리하면 MHC I 과발현이 유발되었으며(그림 2E), 이는 효과가 mRNA 복합체가 아닌 비히클과 관련이 있음을 나타냅니다. 또한 MVP 처리로 인해 항-SIINFEKL-MHCI 항체로 검출된 OVA257e264 항원 에피토프-MHC I 복합체(SIINFEKL-MHC I)가 세포 표면에 표시되어(그림 2F) BMDC에 의한 효과적인 항원 처리 및 제시가 입증되었습니다. . 또한 MVP 처리된 BMDC를 OVA257e264 에피토프를 특이적으로 인식하는 CD8+ T 세포주인 B3Z 또는 OVA257e{25}}특이적 T 세포를 발현하는 OT-I 마우스의 비장에서 분리된 T 세포와 함께 배양합니다. IL-2 분비를 유발하는 수용체는 비히클 단독 또는 mRNA/프로타민 코어 단독으로 처리된 DC와 함께 배양된 T 세포에서는 관찰되지 않은 결과입니다(그림 2G). 유동 세포 계측법 분석에서는 MVP와 함께 배양한 후 32.5%의 증식성 CD8+ T 세포가 검출되었습니다(그림 2H 및 I). OVA mRNA-캡슐화된 MVP 입자는 또한 피내 주사에 의해 마우스를 치료하기 위해 적용되었습니다. 배수 림프절의 세포를 조사한 결과 처음 48시간 동안 고전적 DC(CD8+ DC, CD11b+ DC, CD103+ DC)와 형질세포성 DC(pDC) 모두에서 CD{34}} 발현이 꾸준히 증가한 것으로 나타났습니다. 이는 DC의 자극을 나타냅니다. 성숙(그림 2J). 치료는 또한 림프절에서 CD8+ T 세포의 농축을 촉진했으며, CD69+CD8+ T 세포의 개체수가 크게 증가하여(그림 2K 및 L), 이는 치료에 의한 T 세포 활성화를 나타냅니다. T 세포 활성화를 확인하기 위해 MVP 치료 후 3, 5 또는 7일에 배액 림프절에서 세포를 수집하고 세포에 OVA257e264 항원 펩타이드를 투여한 후 ELISpot 분석을 수행했습니다(지원 정보 그림 S2). MVP 치료는 해당 기간 동안 IFN-g 분비 세포에서 큰 도약을 촉발했으며, 5일째에 최대 활동을 보였습니다(그림 2M). 이러한 결과는 MVP 치료 후 강력한 DC 자극, 항원 제시 및 T 세포 활성화를 입증했습니다.
풀 사이즈 테이블
표 2MVP의 지질 구성 및 전하 비율입자.
3.3. MVP는 대장 종양 및 흑색종의 쥐 모델에서 강력한 항종양 면역을 유도합니다.
MVP는 MC38 결장암 및 B16 흑색종에 걸린 쥐를 치료하기 위해 적용되었습니다. 두 모델 모두에서 OVA mRNA 캡슐화 MVP를 두 번 처리하면 피하 종양 성장이 완전히 차단되었습니다. 이에 비해 eGFP mRNA 캡슐화 MVP 또는 비히클 단독 처리는 종양 성장에 대해 검출 가능한 억제 효과를 나타내지 않았습니다(그림 3AeD, 지원 정보 그림 S3). 림프절에서 CD4에서 CD8로의 이동 패턴(그림 2)에 따라 우리는 OVA mRNA 캡슐화 MVP로 처리한 마우스의 종양에서 CD8+/CD4+ T 세포 비율의 증가를 관찰했습니다(그림 3E). 또한 OVA mRNA 캡슐화 MVP로 처리한 마우스의 비장, 림프절 및 종양에서 IFN-g+CD8+ T 세포의 수준이 증가한 것을 발견했지만 비히클 단독 또는 GFP mRNA 캡슐화 MVP에서는 그렇지 않았습니다(그림 3FeH, 지원 정보) 그림 S4). 또한 OVA mRNA로 캡슐화된 MVP 치료 그룹의 종양에서 OVA257e264-MHCI 덱스트라머 양성 CD8+ T 세포가 유의하게 증가했는데 이는 항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식을 나타냅니다(그림 3I). 비장과 림프절에서 분리된 세포를 사용한 ELISpot 분석은 T 세포 활성화에 대한 추가 지원을 제공했습니다(그림 3JeM).
3.4. MVP는 STING 의존 신호를 활성화하여 선천적 면역 반응을 자극합니다.
우리는 I형 IFN 및 염증성 사이토카인 발현의 자극을 담당하는 주요 요인과 경로를 식별하기 위해 BMDC를 치료하기 위해 mRNA 코어, mRNA 없는 비히클 및 mRNA 캡슐화 MVP를 적용했습니다. 흥미롭게도 MVP는 IFN-b 분비를 유발하는 데 있어 Tlr7 작용제 이미퀴모드만큼 강력했으며, 비록 그 효능이 MVP만큼 높지는 않았지만 차량 단독으로도 IFN-b 분비를 촉진하는 활성을 보였습니다. 그러나 mRNA 코어만으로는 IFN-b 분비를 자극하는 데 효과적이지 않았습니다 (그림 4A). 결과는 IFN-b 발현을 최대화하기 위해 차량의 mRNA와 구성 요소가 모두 필요하다는 것을 암시했습니다. 그 동안 이미퀴모드와 비히클은 TNF-a와 IL{8}}b 발현을 촉진하는 데 유사한 활동을 보인 반면, MVP는 둘 중 어느 것보다 훨씬 더 강력했습니다(그림 4B 및 C). NF-kB 및 IFN 조절 인자와 일반적으로 연관된 사이토카인인 CCL5의 발현은 이미퀴모드, 비히클 단독 또는 MVP로 처리된 세포에서 동일하게 자극되었습니다(그림 4D). TLR7, MAVS, STING 및 TRIF는 바이러스 RNA 및 손상된 DNA28e30에 대한 세포 반응을 중재하는 주요 신호 전달 경로의 핵심 요소입니다. 우리는 Tlr7, Mavs, Sting 또는 Trif 유전자 녹아웃(KO)이 있는 마우스에서 BMDC를 생성하고 mRNA 코어, mRNA가 없는 비히클 또는 mRNA 캡슐화 MVP로 세포를 처리하여 IFN-b 및 TNF-a 발현을 검사했습니다.
그림 2 MVP에 의한 면역 반응 자극. (A) mRNA/프로타민 코어, mRNA가 없는 비히클 및 완전한 MVP의 개략도. (BeD) OVA-MVP로 24시간 동안 처리한 후 BMDC의 성숙. (E 및 F) 24시간 동안 OVA-MVP로 처리한 후 BMDC에서 MHC I 발현 및 OVA257e264 항원 에피토프-MHC I 복합체. (G) B3Z 또는 OT-I T 세포와 함께 배양된 처리된 BMDC의 IL-2 수준. (H 및 I) 증식성 T 세포의 유세포 분석. T 세포의 대표적인 크로마토그램이 표시됩니다. (J) 생체 내 MVP 처리 후 DC 성숙. C57BL/6J 마우스를 OVA-MVP로 치료하고 슬와 림프절의 DC를 분석했습니다. (K 및 L) T 세포 집단 분석. C57BL/6J 마우스를 비히클 또는 OVA-MVP로 처리하고 슬와 림프절의 T 세포를 유세포 분석기로 분석했습니다. (M) ELISpot 분석. C57BL/6J 마우스를 OVA-MVP로 처리하고 지정된 시점에 림프절을 수집했습니다. IFN-g 발현 세포의 측정을 위해 분리된 세포를 적용하였다. 데이터는 평균 SEM(n Z 3)으로 표시됩니다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005; ****P < 0.001; ns, 중요하지 않습니다.
그림 3 MVP의 항종양 활동. (A) MC38-OVA 종양 성장 억제. 암컷 C57BL/6J 마우스에 5 105 MC38-OVA 종양 세포/마우스를 0일에 피하 접종하고 2일에 PBS 대조군, 비히클 대조군, GFP-MVP 또는 OVA-MVP로 처리했습니다. 3일과 1일0. (B) B16-OVA 종양 성장의 억제. 암컷 C57BL/6J 마우스에 2 105 B16-OVA 종양 세포/마우스를 0일에 피하 접종하고 PBS 대조군, 비히클 대조군, GFP-MVP 또는 OVA-MVP로 처리했습니다. 3일차와 1일차0. (C 및 D) 17일째 B16-OVA 종양의 이미지 및 무게. (E) 치료 후 마우스 종양의 T 세포 집단. (FeH) 비장, 림프절(LN) 및 치료 후 마우스 종양의 IFN-g+CD8+ T 세포. (I) 치료 후 마우스 종양의 OVA 특이적 CD8+ T 세포. (JeM) 치료 후 마우스의 비장 및 림프절 세포에 대한 ELISpot 분석의 이미지 및 정량 분석. 데이터는 평균 SEM(n Z 5)으로 표시됩니다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005; ****P < 0.001.
BMDC에서 Mavs 및 Sting의 KO 상태는 Western blot 분석을 통해 확인되었습니다(지원 정보 그림 S5A). 놀랍게도 Sting KO는 차량 단독과 MVP 모두에서 IFN-b 분비에 대한 자극 활동을 제거했으며(그림 4E), 이는 MVP가 STING을 통해 I형 IFN 발현을 활성화했음을 나타냅니다. 이 개념을 뒷받침하기 위해 우리는 일반적으로 STING 활성과 관련된 키나제인 탱크 결합 키나제 1(TBK1)(그림 S5B)의 인산화를 감지했습니다. 또한, 이 경로는 이미퀴모드로 처리된 세포에서 IFN-b 발현이 손상되지 않았기 때문에 TLR7 신호전달과 독립적이었습니다(그림 4E). 이에 비해 Trif 또는 Mavs KO는 MVP가 추진하는 IFN-b 발현에 최소한의 영향을 미쳤습니다. 예상한 대로, 이미퀴모드는 Tlr7 KO로부터 유래된 BMDC에서 IFN-b 분비를 자극하는 데 효과적이지 않았습니다. 그러나 Tlr7 KO는 MVP의 자극 효과에 부정적인 영향을 미쳤습니다(그림 4E). 흥미롭게도, 동일한 처리에서 TNF-α 분비에 대해 다른 프로필이 관찰되었습니다. Sting, Trif 또는 Tlr7의 녹아웃은 MVP 자극 사이토카인 발현에 전혀 또는 최소한의 영향을 미쳤습니다. 반면, Mavs의 녹아웃은 비히클 단독 또는 MVP로 처리된 세포에서 TNF-α 수준을 극적으로 감소시켰습니다(그림 4F). 결과는 MAVS가 MVP 치료 시 DC에서 TNF-α 발현의 주요 조절자임을 나타냅니다.
3.5. MVP는 STING 및 MAVS 경로를 자극하여 IFN-I 및 염증성 사이토카인의 분비를 촉진합니다.
STING 및 MAVS 신호 전달을 담당하는 차량의 구성 요소를 식별하기 위해 주요 구성 요소를 교체하거나 생략하여 차량과 MVP를 준비하고 이를 BMDC 치료에 적용했습니다. Sting 작용제 순환 GMP-AMP(cGAMP)는 IFN-b 분비를 자극하는 데 양성 대조군 역할을 했습니다. 차량의 양이온성 지질 EDOPC를 다른 양전하 지질인 DOTAP로 교체하면 IFN-b 분비가 완전히 제거됩니다. 이에 비해, 비히클과 MVP의 자극 효과는 프로타민 유무에 관계없이 유지되었으며 이러한 자극 활성은 손상되지 않은 Sting 유전자에 따라 달라졌습니다(그림 4G). 흥미롭게도 EDOPC를 포함한 지질 껍질의 개별 구성 요소로 처리된 BMDC는 강력한 IFN-b 분비를 촉진하지 않았습니다(지원 정보 그림 S6). 따라서 EDOPC는 STING 활성화에 필수적이며 그 활성은 지질 나노입자(즉, 비히클 또는 MVP)의 형성에 따라 달라집니다. EDOPC 또는 DOTAP로 제조된 비히클 및 MVP를 야생형 및 Mavs KO 마우스에서 유래된 BMDCS를 처리하기 위해 적용하고 세포 성장 배지의 TNF 수준을 결정했습니다. 예상대로 EDOPC를 DOTAP 또는 DOPC로 교체하면 차량과 MVP의 자극 노력이 제거되었습니다. 또한, TNF-α 수준은 야생형 세포에 비해 Mavs KO 세포에서 유의하게 감소했지만 감소하지는 않았으며(그림 4H), 이는 MVP 자극 TNF-α 발현을 매개하는 데 추가 요인이 관여할 수 있음을 나타냅니다.
3.6. STING 경로는 MVP 매개 항종양 면역 반응에 필수적입니다.
야생형 및 녹아웃 마우스 모두 OVA mRNA 캡슐화 MVP로 처리하고 DC 성숙 및 T 세포 증식을 검사했습니다. Sting KO는 CD80+ 및 CD{2}}+ DC 세포와 CD69+ T 세포의 비율을 크게 감소시켰습니다(그림 5AeD). ELISpot 분석에서는 동일한 용량의 MVP를 처리한 후 야생형 마우스에 비해 Sting KO 마우스의 비장 및 림프절에서 IFN-g 생성 세포가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다(그림 5EeH). Mavs KO의 영향은 CD44+CD8+ 기억 T 세포, OVA257e264-MHCI 덱스트라머 양성 CD8+ T 세포 또는 야생 KO와 비교하여 림프절 내 IFN-g 생산 세포 수에 대한 차이가 모니터링되지 않았기 때문에 미미했습니다. 유형 마우스(그림 5IeL). 이 결과는 MAVS 이외의 추가 요인이 MVP 자극 염증성 사이토카인 발현에 관여할 수 있다는 개념을 강화합니다. 야생형 및 Sting KO 마우스 모두 B16-OVA 종양을 접종하기 위해 적용되었으며, 마우스는 PBS 대조군 또는 OVA mRNA-캡슐화된 MVP로 처리되었습니다. 백신 접종한 생쥐에서 수집한 림프절 및 종양 샘플에 대한 유세포 분석 결과 Sting KO 생쥐에서 IFN-g 생성 CD8+ T 세포 수가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다(그림 6A 및 B). 그 결과, MVP를 처리한 야생형 마우스에서는 종양 성장이 완전히 억제된 데 비해 Sting KO 마우스에서는 부분적으로만 억제되었습니다(그림 6C).
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4. 토론
현재 연구에서 우리는 항종양 면역 반응 자극에 대한 MVP의 개별 구성 요소의 기능적 역할을 체계적으로 조사했습니다. 우리의 세포 기반 연구는 IFN-b와 IL{4}}b 및 TNF를 포함한 수많은 염증성 사이토카인의 발현을 촉진하는 완전한 활동을 위해서는 MVP의 mRNA 분자와 RNA 없는 운반체가 모두 필요하다는 것을 분명히 보여주었습니다. -수지상 세포에서. 이러한 사이토카인은 수지상 세포 활성화 및 백신 매개 항종양 면역에 필수적인 역할을 하는 것으로 나타났습니다20. 우리의 연구는 또한 사이토카인 생산의 자극이 STING 및 MAVS에 의해 매개되는 경로를 포함하여 선천적 면역 감지와 관련된 여러 주요 신호 전달 경로에 의존한다는 것을 밝혔습니다. STING은 IFN-b 발현에 필수적이지만 MAVS는 주로 TNF-a 발현 조절에 관여합니다(그림 6D). MVP 매개 항종양 면역에 대한 STING 신호 전달의 중요성은 Sting KO 마우스에서 T 세포 활성 감소 및 결과적으로 손상된 종양 성장 억제에 의해 추가로 입증됩니다. 이 결과는 STING 활성화가 세포독성 T 세포 매개 항종양 면역을 결정한다는 다른 보고서와 일치합니다. MAVS는 바이러스 감염에 반응하는 RIG-I 수용체(RLR) 신호 전달의 핵심 중재자입니다. 이 경로가 활성화되면 일련의 염증 반응이 발생합니다. MAVS 신호전달이 TNF-α를 포함한 염증성 사이토카인의 발현을 조절하는 데 분명히 큰 역할을 한다는 점을 고려하면, Mavs KO 마우스에서 T 세포 활성이 손상되지 않는다는 것은 흥미롭습니다. 가능한 이유는 MVP에 의한 이러한 사이토카인의 자극이 여러 경로에 의해 매개되고 MAVS 경로의 중단이 사이토카인 발현을 심각한 영향을 미칠 만큼 낮은 수준으로 감소시키지 않는다는 것입니다. 또는 MAVS 신호 전달의 손실은 다른 경로에 의해 보상됩니다. MVP 백신의 작용 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 이러한 경로를 확인하기 위한 추가 연구가 필요합니다. TLR7은 전통적으로 mRNA 치료제와 연관되어 있었지만 TLR7 신호전달은 MVP 활동을 중재하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보이지 않습니다. 현재 연구에서 완전히 메틸화된 mRNA 분자를 적용하면 TLR7 신호 전달의 관련성이 낮아질 수 있습니다. RNA 메틸화가 TLR에 의한 인식을 억제한다는 것이 잘 입증되었습니다. TRIF는 TLR3/7/8 신호 전달을 위한 핵심 어댑터 단백질입니다. Trif의 녹아웃은 MVP 활동에도 영향을 미치지 않으며, 이는 TLR7을 포함한 위의 TLR이 MVP에 대한 세포 반응을 중재하는 데 중요한 역할을 하지 않는다는 개념을 강화합니다. 고리형 디뉴클레오티드와 크고 작은 분자 화합물을 포함한 여러 Sting 작용제가 암 백신 개발에 적용되었습니다34e37. 이러한 스팅 작용제는 백신 제조 중에 외부 보조제로 첨가되어야 하며, 이는 백신 구성에 또 다른 복잡성을 추가합니다. 또한, 외부적으로 첨가된 Sting 작용제는 일단 mRNA 복합체에서 분리되면 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 있습니다. 이에 비해 MVP는 EDOPC를 포함한 백신의 개별 구성 요소 중 어느 것도 사이토카인 발현을 촉진할 수 없기 때문에 자가 보조제 역할을 하며 암 백신의 맥락에서 작동합니다. 흥미롭게도 양이온성 인지질 EDOPC는 양전하를 띠는 비인지질 DOTAP로 대체될 수 없습니다. 이 두 양이온성 지질 사이의 차이에 대한 잠재적인 메커니즘을 추측하는 것은 흥미롭습니다. 그러나 소수성과 같은 지질 분자 성분의 다른 특성이 나노입자의 전반적인 기능과 핵산에 대한 전달 효능에 중대한 영향을 미칠 수 있다는 것이 문서화되었습니다38. 따라서 완전한 기능을 갖춘 mRNA 백신을 준비하려면 적절한 분자를 선택하는 데 주의를 기울여야 합니다. 요약하자면, 우리는 강력한 mRNA 기반 치료 암 백신을 개발했으며 백신의 개별 구성 요소에 기능성을 부여했습니다. 그 작용 메커니즘은 예방 및 치료 개입에 사용되는 다른 mRNA 플랫폼과 상당히 다릅니다. 현재 연구에서 파생된 지식은 추가 mRNA 치료제의 향후 개발을 확실히 안내할 것입니다.
그림 4 MVP에 의한 선천적 면역 반응 촉진. (AeD) 1 mg/mL 이미퀴모드, 1 mg/mL mRNA 등가 코어, 비히클 또는 MVP로 24시간 동안 처리된 BMDC. IFN-b, TNF-a, IL-1b 및 CCL5 수준은 ELISA로 측정되었습니다. (E 및 F) 야생형 및 유전자 녹아웃(KO) 마우스로부터 유래된 BMDC의 IFN-b 및 TNF-a 발현. BMDC를 표시된 시약으로 24시간 동안 처리했습니다. IFN-b와 TNF-a는 ELISA로 측정되었습니다. (G) 야생형 및 Sting 녹아웃 마우스에서 유래된 BMDC의 IFN-b. BMDC는 20 mg/mL cGAMP, 1 mg/mL mRNA 등가 코어, 비히클 또는 MVP로 24시간 동안 처리되었습니다. 차량(DOTAP): EDOPC를 DOTAP으로 대체하여 준비되었습니다. 비히클(프로타민 없음): 프로타민을 생략하여 제조함. ND: 감지할 수 없습니다. (H) 야생형 및 Mavs 녹아웃 마우스로부터 유래된 BMDC의 TNF-α. BMDC는 1 mg/mL mRNA 등가 코어, 비히클 또는 MVP로 24시간 동안 처리되었습니다. 차량(DOTAP): EDOPC를 DOTAP으로 대체하여 준비되었습니다. 차량(DOPC): EDOPC를 DOPC로 대체하여 제작되었습니다. 데이터는 평균 SEM(n Z 3)으로 표시됩니다. ***P < 0.005; ****P < 0.001; ns, 중요하지 않습니다.
그림 5 Sting 및 Mavs 녹아웃 마우스의 항종양 면역 반응. (AeD) Sting 녹아웃 마우스에서 감소된 DC 및 T 세포 활성화. 야생형 및 Sting 녹아웃 마우스를 모두 OVA mRNA로 캡슐화된 MVP로 처리하고 DC 및 T 세포 측정을 위해 48시간 후에 림프절을 수집했습니다. (EeH) Sting 녹아웃 마우스의 비장 및 림프절에서 IFN-g 발현 T 세포 감소. 반점 이미지와 정량 분석이 모두 표시됩니다. (IeL) Mavs 녹아웃 마우스의 T 세포 활동에 영향을 미치지 않습니다. 야생형 및 Mavs 녹아웃 마우스 모두 PBS 대조 또는 OVA mRNA로 캡슐화된 MVP로 처리되었으며 CD44+CD8+ 기억 T 세포(I), OVA257e264-MHCI 덱스트라머 양성 CD8+ 측정을 위해 48시간 후에 림프절을 수집했습니다. T 세포(J) 및 IFN-g 생산 세포의 수(K 및 L). 데이터는 평균 SEM(n Z 3 또는 5)으로 표시됩니다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005; ****P < 0.001; ns, 중요하지 않습니다.
그림 6 스팅 의존성 항종양 면역. (A 및 B) B16-OVA 종양을 보유하는 야생형 및 Sting 녹아웃 마우스를 OVA mRNA 캡슐화 MVP로 처리한 후 림프절 및 종양 조직에서 IFN-g 발현 T 세포의 분석. 3일과 1일0에 마우스를 치료하고, 15일에 림프절과 종양을 수집했습니다. 단일 세포를 유세포 분석기로 분석했습니다. (C) 야생형 및 Sting 녹아웃 마우스의 종양 성장 억제. 3일과 1일0에 마우스를 PBS 대조군 또는 MVP로 처리했습니다. 데이터는 평균 SEM(n Z 5)으로 표시됩니다. *P < 0.05; ****P < 0.001; ns, 중요하지 않습니다. (D) DC에서 사이토카인 생산으로 이어지는 신호 전달 경로의 MVP 자극에 대한 개략도. IFN-b 발현 자극은 STING에 의해서만 매개되지만 TNF-a 및 IL{19}}b 발현을 매개하는 MAVS를 포함한 여러 요인이 있습니다.
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