신경 줄기 세포 및 노화 쥐에 대한 Ribes Meyeri Anthocyanins의 노화 방지 효과 파트 2

Nar는 23M-NSC의 노화 표현형을 구출합니다.

R. Meyer 안토시아닌은 많은 종류의 플라보노이드와 생리 활성 성분이 풍부합니다[1,{1}}]. R. Meyer 안토시아닌의 어떤 성분이 노화 방지에 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해 R.의 대사체 분석을 수행했습니다. 마이어 안토시아닌. 우리는 플라보노이드 생합성 경로에 R. Meyer 안토시아닌이 매우 풍부하기 때문에 Nar가 중요한 플라보노이드 대사 산물일 수 있음을 밝혔습니다(보충 표 1). Nar의 노화 방지 효과를 확인하기 위해 다양한 농도(0, 1.7,3.4,6.8,13.6 및 27.2 ug/mL)를 23M-NSC에 적용하고 CCK{18}} 분석을 사용하여 보충 그림 3에서 볼 수 있듯이 6.8 ug/mL Nar 처리는 세포 생존율을 150% 증가시켰습니다. Nar의 노화 방지 효과를 추가로 조사하기 위해 23M-NSC를 Nar로 처리하고 노화 관련 지표를 검출했습니다. .헤스페리딘 사용6.8 ug/mL Nar로 처리된 23M-NSC에서 p16nk4a mRNA 발현이 감소되었습니다(그림 3A). Nar는 또한 배양된 mNSC의 텔로미어를 연장하고 DNA 합성을 증가시켰습니다(그림 3B,3C). 세포 증식에 대한 Nar의 영향을 더 조사하기 위해 G{10}} [19,27]를 제외하고 세포 주기 전반에 걸쳐 발현되는 유사분열 세포의 핵 항원인 Ki67의 면역형광 염색을 수행했습니다. Nar로 처리하면 Ki{13}}양성 세포의 수가 증가하여 세포 증식이 향상되었습니다(그림 3D, 3E). 다음으로 우리는 NSC의 뉴런으로의 분화 가능성도 감지했습니다. 실제로 6.8ug/mL Nar 처리는 MAP{18}}양성 세포 수도 증가했습니다(그림 3F,3G). 이러한 결과는 Nar가 23M-NSC 노화를 역전시킬 수 있음을 일관되게 입증합니다.

그림 2. Ribes Meyer 안토시아닌은 신경 줄기 세포(NSC)를 증가시켜 마우스 기억력과 학습 능력을 향상시킵니다. (A) 플랫폼을 찾는 데 시간이 걸립니다. (B) 플랫폼에 먼저 도달하는 데 시간이 걸립니다. (C) 플랫폼을 찾는 평균 속도. (D) 플랫폼을 찾기 전에 거리를 헤엄쳤습니다. (E.F)R로 치료잃어버린 제국모든 안토시아닌은 대조군과 비교하여 신경구 수와 크기를 증가시켰습니다. (G) 50-100 um 크기의 신경구는 마우스에서 R. Meyer 안토시아닌 처리에 의해 수가 증가했습니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ±SD로 표시됩니다. *피<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

그림 3. 쥐 신경줄기세포(MNC)의 노화에 대한 나린제닌(Nar)의 효과. (A) p16k4a mRNA 발현은 48시간 동안 6.8 ug/mL Nar의 처리가 있거나 없는 23M-NSC에서 qRT-PCR에 의해 측정되었습니다. (B) 48시간 동안 Nar로 처리한 23M-NSC 및 대조군 세포의 세포 주기 단계 분포. (C) 23M-NSC의 상대 텔로미어 길이는 Nar 처리로 유의하게 증가했습니다. (D) DAPI 핵 라벨링으로 48시간 동안 Nar로 처리된 근육의 면역형광 Ki67 염색, (E) (D)의 정량화,(F)대표 대조군 및 Nar 처리 후 배양된 mNSC의 MAP2 및 GFAP면역형광 염색 분야. (G)(F)의 정량화. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시됩니다. *피<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

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Nar는 노화된 쥐의 기억력과 인지 능력을 향상시킵니다.

인지 수준은 노화와 함께 감소하며, 노화 방지 치료는 인지 수준을 향상시킬 수 있습니다[11, 28]. 생체 내 Nar의 노화 방지 효과를 확인하기 위해 노화된 C57BL/6 마우스(12개월)에 꼬리 정맥을 통해 20 mg/kg Nar를 주입했습니다. MWM 테스트는 마우스의 공간 기억과 인지 능력을 검사하는 데 사용되었습니다.미분화 정제 플라보노이드 분획 1000 mg 사용반복 훈련 5일 동안 Nar 처리된 노화 마우스가 플랫폼을 찾는 데 걸리는 시간은 대조군에 비해 점차 감소했습니다(그림 4A). 테스트 결과는 플랫폼 영역에서 보낸 시간이 증가한 반면(그림 4C)플랫폼에 처음 도달하는 데 걸리는 시간이 감소한 것으로 나타났습니다(그림 4B). 또한, Nar 처리된 노화 마우스는 대조군보다 높은 빈도로 플랫폼 영역 내에서 관찰되었습니다(그림 4D). 이러한 결과는 Nar가 노화된 쥐의 공간 기억과 인지 능력을 향상시킬 수 있음을 시사합니다.

노화된 쥐에서 나르 처리된 혈액의 RNA 시퀀싱 분석

Nar 특이적 노화 방지 기전을 조사하기 위해, 우리는 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 사용하여 노화 마우스에서 Nar 처리 혈액의 유전자 발현 프로파일을 분석했습니다. 그 결과 1,961개의 차등 발현 유전자(DEG)가 밝혀졌습니다. 일반적으로 Nar는 유전자 발현을 하향 조절하였고, 미처리 대조군과 비교하여 소수의 유전자만이 상향 조절되었다(도 5A, 5B). 또한 노화와 관련된 중요한 신호 전달 경로 유전자, 특히 TNF 신호 전달 경로의 유전자가 하향 조절되었습니다(그림 5C).오테플라보노이드이러한 결과는 Nar가 TNF 신호전달 경로에 영향을 미쳐 노화 관련 인지 장애에 관여하는 TNF-α의 기능에 지대한 영향을 미친다는 것을 의미합니다[29,30]. 따라서 우리는 생쥐의 혈장에서 TNF- 수준을 조사했습니다. d 면역흡착 분석(ELISA) 효소 결합 결과

그림 4. Naringenin(Nar)은 노화된 쥐의 기억력과 학습 능력을 향상시킵니다. (A) Nar 처리된 노화 마우스의 탈출 잠복기는 대조군에 비해 짧았다. (B) 처음 플랫폼에 도달하는 데 걸리는 시간은 대조군보다 Nar 처리된 노화 마우스에서 더 짧았습니다. (C) 플랫폼 구역에서 보낸 시간. (D) 대조군과 비교하여 Nar 처리된 노화 마우스의 플랫폼 영역에서 관찰되는 빈도. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ±SD로 표시됩니다.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

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Cistanche 캔 안티 에이징

논의

노화는 학습 및 기억 능력의 상실뿐만 아니라 인지 저하의 위험 증가와 관련이 있습니다[22,23]. 신경 손실 및 손상된 신경 발생은 연령 관련 뇌 기능 장애[11-13]와 밀접한 관련이 있습니다. 따라서 신경 세포의 수를 늘리고 신경 발생을 개선하는 것이 노화 방지 치료에 중요합니다. 플라보노이드 및 기타 생리활성 물질[1, 3-6]이 풍부한 식물인 R. Meyer는 아직 설명되지 않은 많은 기능을 가지고 있습니다. 본 연구에서 R. Meyer 안토시아닌은 NSC 증식을 촉진하고 균일한 형태의 신경구 형성을 증가시켰습니다. R. Meyer 안토시아닌 처리는 또한 감소된 ROS 수준 및 노화 관련 P16nk4 유전자 발현, 증가된 DNA 합성 단계 및 연장된 텔로미어와 함께 세포 노화 표현형을 개선했습니다.청교도 비타민 C또한, 면역형광 염색 결과 R Meyer 안토시아닌이 뉴런 형성을 자극하는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 R. Meyer 안토시아닌이 mNSC에 노화 방지 효과가 있으며 시험관 내에서 뉴런의 형성을 직접 촉진할 수도 있음을 시사합니다. 또한 인지저하는 노화와 밀접한 관련이 있다[22, 23]. 우리의 MWM 결과는 R. Meyer 안토시아닌의 위내 투여가 노화 생쥐의 공간 기억과 학습 능력을 개선하고

Figure 5. Tumor necrosis factor(TNF)-a plays an essential role in naringenin (Nar)-mediated anti-aging effects. (A) Summary of gene expressions in mouse blood, as determined by RNA-seq. (B)Heatmap showing differentially expressed genes (DEGs) in the blood between control and Nar-treated mice. DEGs were identified by a fold change of >2.0 또는<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

R. Meyer 안토시아닌의 특정 구성을 조사하기 위해 대사체 분석을 사용한 결과 Nar가 중요한 플라보노이드 대사산물일 수 있음이 밝혀졌습니다. Nar는 이전에 심근 세포 노화를 개선[31], 장관의 대사 능력을 향상[32], 항염[33] 및 항암[34] 효과를 발휘하는 것으로 보고되었습니다. 그러나 노화 동안 NSC에 대한 Nar의 영향은 아직 알려지지 않았습니다. R. Meyer 안토시아닌의 노화 방지 효과를 조사하기 위해 우리는 Nar를 사용하여 추가 연구를 수행했습니다. 6.8ug/mL Nar로 처리하면 세포 생존력이 증가하고 P16ink4a 유전자 발현이 감소하고 텔로미어가 길어지고 시험관 내에서 NSC의 뉴런으로의 분화가 촉진됩니다. 세포 증식에 대한 Nar의 영향을 추가로 평가하기 위해 면역형광 연구를 수행했습니다. 결과는 Nar 치료가 Ki{11}양성 세포의 수와 MAP{12}}양성 세포의 비율을 모두 증가시켰으며, 이는 Nar가 신경발생을 촉진할 수 있음을 시사합니다. 또한, 학습과 기억에 대한 Nar의 효과는 노화된 쥐에서도 평가되었습니다. MWM 테스트 결과는 Nar 처리가 노화된 마우스에서 공간적 leaming을 향상시킨다는 것을 일관되게 보여주었습니다. 흥미롭게도, RNA-seq 분석은 Nar가 특히 노화 마우스의 혈액에서 TNF-α 발현을 하향 조절함으로써 TNF 신호 전달 경로를 통해 노화에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다. ELISA 분석은 또한 Nar 처리가 대조군 노화 마우스와 비교하여 혈장 TNF-α 수준을 감소시켰다는 것을 나타내었다. TNF-α는 TNF 신호전달 경로의 핵심 인자이며 인지 노화와 밀접한 관련이 있습니다. 그 기능은 해마 시냅스의 병리학적 변화 촉진[29] 및 전구체 세포 증식의 억제[35]를 포함합니다. 변경된 TNF 수치는 우울증, 정신분열증, 양극성 장애 및 알츠하이머병의 인지 장애와 관련이 있습니다[30,36,37]. 보다 구체적으로, TNF-α는 알츠하이머병 환자에서 상향조절된다[38].

요약하면, 우리의 연구는 R. Meyer 안토시아닌이 Nar를 통해 NSC의 노화 효과를 개선한다는 것을 보여줍니다. 종합적으로, 우리의 연구 결과는 R.Meyer 안토시아닌의 의학적 가치의 더 큰 실현을 목표로 하는 임상 치료법 개발을 위한 새로운 전략을 제공합니다.

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재료 및 방법

실험 동물

이 연구는 Tongji University Animal Care Committee의 승인을 받았으며 기관 지침에 따라 수행되었습니다. R. Meyer 안토시아닌은 C57BL/6 배경에서 유지된 12-개월된 마우스에 2개월 동안 위내 투여되었습니다. Nar는 C57BL/6 배경에서 유지된 1-개월에서 12-개월된 마우스에 대해 꼬리 정맥에 주사되었습니다. 대조군 마우스에는 동일한 부피의 인산완충식염수(PBS)가 제공되었습니다.

R. Meyer 안토시아닌 및 Nar의 제조

R. Meyer 과일(500g)을 조직 균질화기를 사용하여 균질화하고 0.1% 염산을 함유하는 1L 메탄올에 현탁시켰다. 초음파 추출은 실온에서 30분 동안 3회 수행되었습니다. 추출물을 합하고, 메탄올을 감압 농축하여 R Meyer 추출물을 얻었다. 추출물을 AB-8 거대다공성 수지로 추가 정제하여 안토시아닌 함량을 증가시켰다.

Naringenin(C15H1205; MW:272.25; 순도: 98% 이상; HPLC 등급)은 Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd.(중국 쓰촨성)에서 구입하여 2도{6 }} 빛이 없는 건조한 환경에서. 스톡 용액의 농도는 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 100mM이었다. 최종 DMSO 농도는 배양 배지에서 0.1%를 초과하지 않았습니다.

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신경구 및 분화 분석

NSC는 마우스 SVZ에서 파생되었습니다. 마취 후 마우스를 희생시키고 SVZ를 조심스럽게 해부하고 0.4 U/mL 파파인(Imogen, Alexandria, VA, USA; Cat No: LS003126)을 사용하여 단일 세포로 분리했습니다. NSC는 10ng/mL EGF(PeproTech,Cranbury,NJ, USA;Cat No:AF{6}}) 및 10ng/mL FGF(PeproTech, Cranbury, NJ)가 포함된 10mL NSC 기초 배지를 포함하는 10cm 접시에 플레이팅되었습니다. , 미국, Cat No:AF-100-18B). Neurospheres는 5일마다 통과되었습니다. 새로 분리된 계대 신경구의 NSC를 라미닌(Gibco, Gaithersburg, MD, USA; Cat No:23017015) 및 폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드(Poly-L, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)에 시딩했습니다. ; 카탈로그 번호: P3655) 차별화 보조제가 없는 NSCBasalMedium의 코팅된 유리 슬라이드. 분화된 세포는 Tu1(베타-튜불린 II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, Cat No:480011), MAP2(Thermo Fisher Scientific, Cat No: MA{21}}) 및 glial fibrillary acidic protein에 대해 면역염색되었습니다. (GFAP; Thermo Fisher Scientific, Cat No. PA{22}}), 그런 다음 4'{24}}diamidino-2-phenylindole(DAPI, Thermo Fisher Scientific, Cat No: D1306)로 대조염색됩니다. 슬라이드는 Olympus BX53 현미경(Olympus, Madison, WI, USA)을 사용하여 검사했습니다. TuJ{28}} 및 MAP{29}}양성 세포의 정량화는 3개의 독립적인 실험에서 표지된 세포를 계수하여 수행되었습니다. 통계적 분석은 unpaired t-test를 사용하여 수행되었습니다.

이 기사는 www.aging-us.com AGING 2020, Vol. 12, 17