노화 방지 -Klotho 유전자 활성화 발판은 인간 지방 유래 줄기 세포에서 원기 회복 상처 치유 반응을 촉진합니다

키워드:노화 방지; -클로토; 유전자 활성화 스캐폴드; 지방유래 줄기세포; 혈관신생;매트릭스 증착;회춘 치유

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1. 소개

상처 치유는 여러 세포 사건의 긴밀한 조율이 필요한 복잡한 생물학적 과정입니다.1]. 그러나 고령화 인구에서는 세포 이벤트가 중단되어 치유가 지연됩니다.2]. 치유 메커니즘의 붕괴는 부분적으로 골수에서 전구 세포의 귀소 감소 및 당뇨병과 같은 다른 일반적인 대사 질환으로 인해 발생합니다.3,4]. 상처 관리에서 생체 재료 발판의 적용은 치료로 점점 보편화되고 있습니다. 생체 재료 발판감염으로부터 상처를 보호하고, 상처 삼출물을 흡수하고, 상처를 촉촉하게 유지하여 조직 괴사를 방지합니다.5]. 치료제는 또한 생체 재료 스캐폴드에 적재되어 치유하기 어려운 상처에서 더 빠른 치유를 촉진할 수 있습니다.1]. 그러나 생체 재료 스캐폴드만으로는 상처 내에서 발생하는 다중 신호 캐스케이드를 효과적으로 조정하지 못할 수 있습니다. 줄기 세포 전달은 때때로 상처에서 복잡한 신호 이벤트를 조절하기 위한 솔루션으로 제안됩니다.6]. 

줄기 세포는 측분비 인자를 분비하고 여러 조직 계통의 세포로 분화할 수 있습니다.7]. 줄기 세포는 일반적으로 피내 주사를 통해 상처에 전달됩니다.6], 국소 분무 [8], 또는 조직 공학 이식편 [9]. 최근 몇 년 동안 만성 상처 치유를 위한 조직 공학 이식편의 적용은 상처를 신속하게 치유할 수 있는 능력 때문에 점차 더 널리 받아들여지고 있습니다.9–11]. 아플리그라프® 및 피부 이식® 만성 상처 치료를 위해 널리 사용되는 식품의약국(FDA) 승인 생체공학 구조 중 두 가지입니다.12,13]. 그러나, 이러한 이식편의 생성은 높은 세포 수를 생성하기 위해 장기간의 세포 배양을 필요로 합니다.14]. 줄기세포를 사용할 때 장기 배양은 세포 노화를 증가시키고 줄기세포의 줄기성을 감소시킬 수 있습니다.15,16]. 따라서 줄기세포의 줄기세포성을 유지하는 것이 최적의 치료 반응을 달성하는 데 핵심입니다. 비바이러스 벡터를 사용하여 줄기 세포에 대한 치료 유전자 전달은 줄기 세포의 기능을 향상시키는 잠재적인 전략입니다.17]. 전통적으로 세포는 2D 배양으로 형질감염되고 나중에 생체 내 이식됩니다.18]. 그러나 유전자 활성화 스캐폴드와 같은 플랫폼은 치료용 이식유전자를 운반하는 나노입자로 기능화된 생체 재료 스캐폴드로 구성됩니다.19], 우리 그룹이 개척해 온 3-D 환경 내에서 세포를 형질 감염시키기 위한 대체 솔루션을 제공합니다. 본 연구는 임상적으로 승인된 Integra의 DRT(Dermal Regeneration Template)와 조성이 유사하여 엄청난 임상 번역 잠재력을 가진 3D 콜라겐-콘드로이틴 설페이트(coll-CS) 스캐폴드의 유전자 활성화 버전 개발에 중점을 두었습니다. 만성 상처 치유를 위한 발판 [20]. 우리는 주로 폴리에틸렌이민(PEI)이라는 양이온 폴리머를 사용하여 간질 유래 인자 -1 알파 및 신경 성장 인자와 같은 성장 인자 유전자를 암호화하는 DNA 플라스미드를 응축하고 하전된 나노입자로 조립합니다.21–23]. 이 하전 된 나노 입자는 유전자 활성화 스캐 폴드를 생성하기 위해 coll-CS 스캐 폴드에 흡수됩니다. 우리의 이전 연구는 또한 PEI 기반 유전자 활성화 스캐폴드가 다양한 상처 치유 세포에서 치료용 이식유전자의 일시적인 과발현을 유발하고 재생 능력을 촉진할 수 있음을 보여주었습니다.21,24,25]. 전통적으로 유전자 활성화 스캐폴드는 숙주 세포를 표적으로 하고 국소 복구를 촉진하기 위해 개발되었습니다.26]. 그러나 새로운 증거는 세포가 가득한 유전자 활성화 스캐폴드가 유전자 활성화 스캐폴드 단독보다 복잡한 조직 구조를 재생하는 데 더 우수한 효능을 가지고 있음을 나타냅니다.27]. 

세포 풍부도는 조직 공학 이식편 생성을 위한 중요한 요구 사항 중 하나입니다.28]. 지방 조직은 많은 수의 줄기 세포를 공급할 수 있는 풍부한 공급원입니다. 지방 조직에는 줄기 세포 추출을 위한 전통적인 조직 공급원인 동일한 질량의 골수에 대해 500배나 되는 줄기 세포가 포함되어 있습니다.29]. 또한 최소침습 지방흡입술을 통해 지방조직에서 줄기세포를 추출할 수 있다.29]. 우리의 최근 연구는 인간 지방 유래 줄기 세포(ADSC)가 coll-CS 발판과 우수한 생체 적합성을 입증한다는 것을 발견했습니다. pro-angiogenic gene-activated scaffold를 사용하여 ADSCs의 재생 반응을 더욱 향상시켰습니다.30]. 그러나 ADSC는 확장 시 줄기성을 잃는 경향이 있습니다.31]. 이전에 우리는 노화 방지 단백질이 -Klotho는 건강한 당뇨병 인간 ADSC의 증식을 크게 개선할 수 있습니다.32]. 대부분의 연구는 일반적으로 기본 변형을 사용합니다. -클로토 [33–35] 단백질이 텔로머라제 전사 활성을 활성화하여 ADSC의 수명을 증가시킬 수 있음을 보여주었습니다.33]. -Klotho 과발현 중간엽 줄기세포는 또한 Wnt/ -카테닌 신호 [36]. 그러나, -줄기 세포의 Klotho는 비교적 미개척 상태로 남아 있습니다.

연구 초점의 차이 외에도 - 그리고 -안티에이징 클로토Klotho 단백질은 아직 조직 공학 전략에 완전히 통합되지 않았습니다.상처 치유를 위해. 따라서 본 연구에서는 의 기능적 영향을 연구하고자 하였다. -상처 치유 응용을 위한 인간 ADSC의 Klotho 유전자 활성화 스캐폴드. 우리먼저 고전적 다능성 인자의 전사 활성을 조사했습니다(10월-4,Nanog 및 Sox-2), 증식 마커(Ki-67) 및 상처 치유 조절제(TGF- 3 및 TGF- 1) ADSC에서. 그런 다음 조절 배지의 생체 활성을 평가했습니다.ADSCs-laden gene-activated scaffold에 의해 생성되어 paracrine 잠재력을 평가합니다.마지막으로 기저막(피브로넥틴, 라미닌,및 콜라겐 IV) 및 흉터 관련 단백질( -SMA 및 엘라스틴) ADSC 함유제어된 조직 성숙을 평가하기 위한 유전자 활성화 스캐폴드.

2. 결과

2.1. -Klotho 유전자 활성화 스캐폴드는 일시적으로 인간 ADSC의 줄기 및 프로-수복 유전자를 향상시킵니다.

유전자 발현 분석은 먼저 유전자 활성화 스캐폴드 상의 ADSC가 -172-배 이상의 Klotho 유전자(p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1ㅏ). 이 발견은 유전자 활성화 스캐폴드와 ADSC의 효율적인 상호작용을 확인시켜주었다. 증식 마커 Ki-67의 분석은 유전자 활성화 스캐폴드의 ADSC가 14일 동안 강력한 증식 능력을 유지함을 추가로 확인했습니다(그림1ㅏ). 안티에이징 과발현 확인 -Klotho 유전자, ADSC에서 "다능성" 인자의 활성화를 통해 줄기 세포의 회춘을 평가했습니다. 전반적으로 우리는 14일 동안 세 가지 전사 인자 모두의 일시적인 조절을 확인했습니다(그림1비). 그러나 ADSC는 14일째까지 Oct-4 유전자의 발현이 유의미하게 증가했을 뿐이며, 특히 ADSC는 2.5-배(p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1씨). 섬유화 촉진 TGF- 1개의 유전자 -Klotho 과발현 ADSC는 14일 동안 유전자가 없는 스캐폴드 그룹과 동등한 수준으로 나타났습니다. 그러나 항섬유화 TGF- 3개는 상당히(3.6-배,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -Klotho 유전자 활성화 스캐폴드

인간 ADSC의 측분비 효능 향상2.2.1. Pro-Angiogenic Bioactivity ADSCs-laden gene-activated scaffold에 의해 생성된 CM의 bioactivity 테스트는 처음으로 HUVECs의 대사 활동을 일시적으로 제어할 수 있음을 보여주었습니다. 3일째 CM은 HUVEC의 대사 활동을 크게 향상시켰고, 14일째부터 오래된 CM을 사용하면 HUVEC의 대사 활동을 크게 감소시켰습니다(그림2ㅏ). 이를 관찰한 후 Matrigel에 뿌린 HUVEC에서 3일과 14일째 CM의 혈관신생 촉진 효과를 테스트했습니다. 예상대로, 유전자 활성화 스캐폴드 그룹의 3일 CM은 상당히(p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2비). 그러나, CM 3일째와 비교하여 CM 14일째에는 혈관신생 활성이 더 이상 증가하지 않았다. 또한, 두 그룹의 14일째 CM은 유사한 프로-혈관신생 효율을 나타냈다(도2씨). 총체적으로, 우리의 발견은 유전자 활성화 스캐폴드가 일시적으로 ADSC의 프로-혈관신생 반응을 촉진한다는 것을 나타냅니다.

친 섬유화 TGF- 1. ** 및 * 표시p < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± 표준 편차 (n = 3).

그림 2. ADSC가 함유된 유전자 활성화 스캐폴드 CM의 전혈관신생 측분비 생물활성. (A) 14일 동안 ADSC가 함유된 유전자 활성화 스캐폴드에 의해 생성된 CM은 HUVEC의 대사 활동을 일시적으로 제어하는 ​​능력을 입증했습니다. (B) 유전자 활성화 스캐폴드 그룹의 3일째 CM은 유전자가 없는 스캐폴드 그룹에 비해 내피 세뇨관 형성 및 분기를 크게 향상시켰습니다.(C) ADSC에서 CM에 6h노출된 후 내피 세포의 세관 형성 및 분기 시드된 유전자 활성화 및 유전자 없는 스캐폴드, *는 p < 0.05를 나타냅니다. 데이터는 평균을 나타냅니다! 표준 편차(n=3)

2.2.2. 피부 섬유아세포 치유 및 성숙

혈관신생 연구에서 발견한 것 중 하나는 ADSC가 함유된 유전자 활성화 스캐폴드가 성숙함에 따라 더 이상 혈관신생을 촉진하지 않는다는 것입니다. 또한, 14일에 그들의 혈관신생 효능은 유전자가 없는 스캐폴드 그룹의 것과 유사했습니다(그림 2B, C). 혈관신생 연구 결과와 유사하게, 두 그룹 모두 14일 CM에서 유사한 수준의 섬유아세포 상처 봉합을 보였다. 특히, 두 그룹 모두 12시간 만에 상처를 약 40% 치유했습니다(그림 3A). 이 발견은 성숙 동안 유전자 활성화 스캐폴드 그룹이 진피 섬유아세포 상처 봉합을 지지하지만 촉진하지는 않는다는 것을 밝혔습니다.

그럼에도 불구하고 섬유모세포가 노화된 CM으로 자극됨에 따라 우리는 상처 성숙에 관여하는 기질 단백질 발현의 영향을 연구했습니다. 예상대로, 유전자가 없는 스캐폴드 그룹의 CM으로 자극된 진피 섬유아세포는 전 섬유성 콜라겐 I 단백질을 풍부하게 발현했습니다(그림3B). 반대로, 유전자 활성화 스캐폴드 그룹의 CM으로 자극된 섬유아세포는 콜라겐 I 단백질의 50% 낮은 발현(p < 0.05)을 보여주었습니다. 한편, 두 그룹 모두 항섬유화 콜라겐의 발현이 모두 부족하였고, 두 그룹 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 종합하면, 유전자 활성화 스캐폴드가 성숙 동안 ADSCswound 조절 반응을 향상시킨다는 것을 의미합니다.

그림 3. 피부 치유 및 성숙에 대한 측분비의 영향. (A) 두 그룹의 14일째 CM은 인간 성인 진피 섬유아세포에서 비슷한 수준의 상처 봉합 활동을 12시간 동안 약 40% 발휘했습니다.(B) 유전자 활성화 스캐폴드의 CM은 발현을 크게 감소시켰습니다. 섬유아세포에 있는 프로-섬유화 콜라겐. "는 p < 0.05Data를 나타냅니다. 평균=표준 편차(n=3)를 나타냅니다. 그림 3B에서 GAS 및 GFS는 각각 유전자 활성화 스캐폴드 및 유전자 프리 스캐폴드를 나타냅니다.

2.3. B-Klotho 유전자 활성화 스캐폴드는 인간 ADSC에서 개선된 항섬유화 반응으로 기저막 재생을 향상시킵니다.

ADSC의 기능에 대한 유전자 활성화 스캐폴드의 제어된 자극을 관찰한 후, 우리는 궁극적으로 진피 기질과 단백질의 재생에 대한 ADSC의 반응을 조사했습니다. 유전자 활성화 스캐폴드는 ADSC의 기저막 재생을 강력하게 향상시켰습니다. 구체적으로, 유전자 활성화 스캐폴드는 기저막 성분인 라미닌과 콜라겐 IV그림 4A)의 침착을 크게 촉진했습니다. 반 정량적 분석 후, 우리는 또한 매트릭스 증착이 유전자가 없는 스캐폴드 그룹에 비해 추세를 따랐다는 점에 주목했습니다. 관찰된 경향은 피브로넥틴(1.0-배) < 라미닌(2.1-배, p < {{10}}.05) < 콜라겐 IV였습니다. (8.8-fold, p < 0.01). 기저막 재생 능력이 결정되면 흉터 감소와 같은 우수한 질적 치유에 중요한 단백질 발현을 평가했습니다. 유전자 활성화 스캐폴드의 ADSC는 흉터 관련 수축성 단백질 a-SMA의 발현이 유의하게(p<0.05) 감소한 것으로 나타났습니다. ADSC에서 α-SMA 발현은 유전자가 없는 스캐폴드 그룹에 비해 50% 낮았습니다(그림 4B). 마지막으로 감소된 α-SMA 발현을 관찰한 후 탄성 매트릭스 단백질 엘라스틴의 발현을 평가했습니다. 유전자 활성화 스캐폴드의 ADSC는 유전자가 없는 스캐폴드의 ADSC에 비해 엘라스틴의 성숙한 섬유 네트워크의 침착을 통해 상대적으로 우수한 정성적 엘라스틴 발현을 입증했습니다(그림 4B).

그림 4. 14일째에 유전자 활성화 스캐폴드에서 ADSC에 의한 상처 치유 매트릭스 단백질의 침착.(A) 유전자 활성화 스캐폴드의 ADSC는 상당한 재생을 입증했습니다. 유전자가 없는 스캐폴드에서 ADSC와 비교하여 기저막의 작동. ADSC는 주로 상대적으로 성숙한 콜라겐 IV 단백질 네트워크를 침착시켰고, 이어서 라미닌과 피브로넥틴을 침착시켰습니다.(B) 유전자 활성화 스캐폴드의 ADSC는 또한 유전자의 ADSC에 비해 2-배 더 낮은 SMA 단백질을 발현했습니다. - 무료 비계. 지하실 mem과 함께. 브레인 재생, 유전자 활성화 발판의 ADSC는 질적으로 더 나은 탄성 매트릭스를 증착했습니다. 모든 이미지는 IX73 Olympus 현미경*을 사용하여 20x 대물렌즈를 통해 캡처되었으며 *는 각각 p < 0.01 및 p < 0.05를 나타냅니다. 스케일 바 50um. 데이터는 평균 표준 편차(n=3)를 나타냅니다. -SMA 및 피브로넥틴은 이중 면역염색되었습니다.

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