노화 방지 -Klotho 유전자 활성화 발판은 인간 지방 유래 줄기 세포에서 원기 회복 상처 치유 반응을 촉진합니다
Apr 12, 2023
3. 토론
본 연구는 노화 방지의 기능적 영향을 조사하는 것을 목적으로 합니다. - 향상된 상처 치유 응용을 위한 인간 ADSC의 Klotho 유전자 활성화 스캐폴드. 전반적으로 우리는 유전자 활성화 스캐폴드가 그림에 묘사된 것처럼 ADSC의 재생 능력의 제어된 활성화를 제공한다는 것을 발견했습니다.5. 구체적으로, 유전자 활성화 스캐폴드는 전사 인자 Oct-4의 활성화를 통해 ADSCs의 줄기성을 일시적으로 향상시켰습니다. 유전자 활성화 스캐폴드는 또한 항섬유화 유전자 TGF- 3, 흉터 감소로 통제된 치유를 위한 중요한 요소. 또한, 활성화된 ADSC는 내피 혈관신생을 일시적으로 제어하고 주변분비 신호전달을 통해 진피 섬유아세포 치유를 지원했습니다. 성숙을 향해, ADSC는 진피 섬유모세포에서 전-섬유화 반응의 활성화도 제어했습니다. 한편, 유전자 활성화 발판의 ADSC는 라미닌 및 콜라겐 IV 침착을 강화하여 진피 기저막을 효과적으로 재생했습니다. 이 반응은 흉터 관련 감소와 더 관련이 있습니다. -SMA 단백질 발현 및 개선된 정성적 엘라스틴 매트릭스 침착. 우리의 연구는 총체적으로 다음과 같이 결정했습니다. -Klotho 유전자 활성화시탕슈에 대한 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.상처 치유그리고 수회춘 치유 응용을 위한 진보된 줄기 세포 기반 치료법.
그림 5. 상처 치유 응용을 위한 인간 ADSC에 대한 B-Klotho 유전자 활성화 스캐폴드의 기능적 영향의 개략도. 이 연구의 주요 발견은 (1) 줄기 세포 다능성 및 항섬유화 반응의 일시적인 향상, (2) 혈관신생에 대한 개선된 측분비 제어 및 진피 섬유아세포에서의 섬유화 전 콜라겐 리모델링 및 궁극적으로 (3) 세포의 성숙 증가입니다. 흉터 관련 단백질 발현을 제어하는 기저막엘라스틴 매트릭스에 대한 점선은 향상된 질적 침착을 의미합니다.
Cistanche 방법을 알고 싶으면 여기를 클릭하십시오.상처 치유 효과
상처 치유 전략에서, 플라스미드 기반 유전자 요법은 상처 치유가 완료될 때까지 세포 반응을 일시적으로 향상시키기 위해 적용됩니다.37]. 우리의 유전자 활성화 스캐폴드는 또한 치료가 -Klotho 유전자는 14일에 걸쳐 일시적으로 조절됩니다. 크게 향상된(170-fold) 표현 - 3일째의 Klotho mRNA는 암호화된 이식유전자의 전사 활성화를 향상시키는 것으로 알려진 초기 CMV 프로모터에 기인할 수 있습니다.38]. 그러나 중간엽 줄기세포에서 CMV는 도입유전자 발현을 감소시킬 수 있는 DNA 메틸화 또는 히스톤 탈아세틸화를 겪을 수 있습니다.39]. 더욱이, 플라스미드는 일반적으로 비복제 에피좀이며, 이식유전자가 분열하는 세포로 전이되는 것을 제한하고 시간이 지남에 따라 이식유전자 발현을 감소시킨다.40]. 박테리아 서열에서 유래하는 이색성 마커의 존재플라스미드는 도입유전자 발현을 더 억제할 수 있다.41], 전반적으로 일시적인 유전자 발현에 기여합니다.
치유하기 어려운 상처를 치료하기 위해 추구하는 방법 중 하나는 세포가 심어진 생체 활성 스캐폴드를 적용하는 것입니다. 한 가지 이유는 신속한 상처 복구를 촉진하는 능력 때문입니다. 이식편의 대사 활성 세포는 측분비 인자를 분비하고 분화를 거치며 상처 환경에서 복잡한 신호 전달 사건을 조율합니다.42]. 특히 줄기세포는 외부 자극을 감지하고 반응을 조절해 항상성을 회복하는 독특한 능력을 가지고 있다.43]. 그러나 줄기 세포는 이식편을 위한 많은 세포 수를 생성하기 위해 시험관 내에서 확장될 때 줄기 세포성을 잃습니다. 우리의 연구는 노화 방지 유전자를 운반하는 유전자 활성화 발판을 사용하여 줄기가 일시적으로 향상될 수 있음을 보여줍니다. - 클로토. 구체적으로, 우리는 노화 방지 유전자 활성화 스캐폴드가 ADSCs에서 줄기 유전자 Oct-4의 발현을 향상시켰다는 점에 주목했습니다. Oct-4는 배아 줄기 세포의 핵심 전사 인자 중 하나이며 제어된 배아 발달에 필수적입니다.44]. ADSC에서 Oct-4 유전자의 활성화는 ADSC의 증식 및 분화 가능성을 촉진할 수 있습니다.45]. 따라서 Oct-4의 증가된 발현은 유전자 활성화 스캐폴드 상의 ADSC의 숙주 세포로의 신속한 분화를 촉진하고 치유 과정을 도울 수 있습니다.
ADSC에서 Oct-4 유전자의 활성화를 관찰한 후 ADSC의 혈관신생 효능을 평가했습니다. 혈관 신생은 이식편과 숙주 조직의 효율적인 통합에 중요합니다.46]. 이식편의 세포는 측분비 인자의 분비를 통해 혈관신생을 유발합니다. 혈관 신생은 또한 육아 조직 발달에 중요한 사건이며 그 활동은 육아 조직이 성숙함에 따라 감소합니다.47]. 치유 후기 단계에서 프로그래밍된 혈관신생 활동의 제한은 재상피화를 방해할 수 있는 흉터 및 과립화를 조절하는 데 필수적입니다.48]. 우리의 발견은 또한 유전자 활성화 발판의 ADSC가 내피 발아를 향상시키고 측분비 신호를 통해 성장을 제어할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 내피 세포의 대사 활동의 현저한 증가와 3일째 CM에 대한 반응으로 발아는 ADSC가 함유된 유전자 활성화 스캐폴드가 숙주 조직과 빠르게 통합할 수 있는 가능성을 보여줍니다. 또한, 줄기 세포 CM의 사용은 상처 치유의 질을 향상시키기 위해 일반적으로 채택되는 무세포 접근 방식입니다.49]. 한계로서, 우리는 성인 진피 내피 세포가 혈관신생을 연구하기 위한 더 나은 세포 모델을 제공할 것임을 인정합니다. 그러나 우리의 이전 연구와 일관성을 유지하기 위해 HUVEC는 "황금 표준" 세포 후보로 널리 받아들여지고 있습니다.50], 우리는 HUVECs 혈관 신생 분석을 채택했습니다.
섬유아세포 리모델링 활동의 증가는 육아조직 성숙의 일반적인 특징이다.51]. 이 단계에서 콜라겐 III 매트릭스는 점차 더 강한 콜라겐 I 섬유로 대체됩니다.51]. 콜라겐 섬유는 상처 수축을 촉진합니다.52], 상처 수축은 완전한 상처 봉합에 필수적입니다.53]. 그러나 콜라겐 I 침착이 공격적으로 지속적으로 증가하면 흉터 형성이 증가할 수 있습니다.54]. 예를 들어 화상 상처에서 모낭, 피지선 및 땀샘과 같은 다른 피부 부속기의 발달을 억제할 수 있으므로 흉터를 제어하는 것이 중요합니다.54]. 우리의 발견은 유전자 활성화 스캐폴드 그룹의 노인(14일) CM이 성인 진피 섬유아세포에서 프로-섬유화 콜라겐 I의 발현을 조절할 수 있음을 보여줍니다. 섬유아세포에 대한 이러한 통제된 효과는 섬유아세포의 이동 또는 유전자가 없는 스캐폴드 그룹에 비해 항섬유화 콜라겐 III 발현에 추가 영향 없이 발생했습니다. 따라서 우리는 ADSC가 함유된 유전자 활성화 스캐폴드가 제어된 콜라겐 I 발현을 통해 생체 내 흉터를 제한하는 데 더 나은 제어를 제공할 수 있다고 제안합니다. Li 등은 또한 ADSCs CM이 비대성 반흔에서 파생된 섬유아세포에서 콜라겐 I 발현을 현저하게 감소시킬 수 있음을 보여주었습니다.55]. Wang 등의 또 다른 연구에서는 켈로이드 유래 섬유아세포에서 콜라겐 I 발현의 유사한 감소를 입증했습니다.56], ADSCs' CM의 항섬유증 잠재력을 집합적으로 보여줍니다.
의 적용과 함께 우리가 주목한 중요한 발견 중 하나는 -Klotho 유전자 활성화 발판은 ADSC에서 기저막의 향상된 재생입니다. 기저막의 재생은 혈관 성숙과 완전한 재상피화에 필수적이다.57,58]. 중요한 것은 단백질 라미닌이(2.1-fold) 및 콜라겐 IV(8.8-fold)가 상향 조절되는 것은 유전자 활성화 스캐폴드 그룹에서 기저막의 성숙이 증가했음을 추가로 나타냅니다.59]. 노화 방지 인자로 작용하는 것 외에도 [60], 베타 클로토는 FGF 수용체에 의한 섬유아세포 성장 인자(FGF)에 대한 민감도를 향상시키는 기능을 합니다.61]. 또한, FGF 신호의 증가는 라미닌 및 콜라겐 IV의 침착을 통해 기저막 성숙을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다.62]. 따라서 FGF의 공동 수용체로서의 베타 클로토의 역할을 고려할 때, 유전자 활성화 스캐폴드 그룹에서 증가된 기저 성숙은 잠재적으로 ADSC의 FGF 신호 증가에 의해 매개됩니다.
유전자 활성화 스캐폴드 그룹에서 현저하게 상향조절된 기저막 성분은 콜라겐 IV 단백질입니다. 콜라겐 IV 단백질은 모든 기저막의 50%를 차지합니다.63] 기저막에 구조적 안정성 제공 [59]. 그러나 노화는 진피-표피 접합부에서 콜라겐 IV 발현을 현저하게 감소시킨다.58,64] 콜라겐 IV의 부족은 흉터 발병을 촉진할 수 있습니다.65]. 따라서 우리의 결과는 ADSC가 함유된 유전자 활성화 스캐폴드의 증가된 기저막 재생 효능이 노인 환자의 치유 향상에 크게 도움이 될 수 있음을 시사합니다. 다른 연구에서도 지방 조직에서 유래한 ECM이 피부 복구를 위한 엄청난 치료 가능성을 가지고 있음을 보여주었습니다.66]. 또한, 라미닌과 콜라겐 IV가 풍부한 조직 공학 이식편도 호흡기 상피 복구에 관심이 있습니다.67].
섬유아세포에 대한 섬유화 촉진 제어 외에도, 우리의 연구는 유전자 활성화 스캐폴드의 ADSC가 흉터 관련 단백질의 2-배 낮은 발현을 발현함을 추가로 보여줍니다. -SMA [68]. 생체 내 영향을 평가하지는 않았지만 국소 -SMA 발현은 개선된 질적 치유에 중요합니다.69]. 블레오마이신과 같은 섬유화제 사용 [70]는 시험관 내에서 ADSC/유전자 활성화 스캐폴드 구조물의 항섬유화 특성을 더 잘 평가하는 한 가지 방법일 수 있습니다. 그러나 우리의 초점은 구조물의 잠정적 치료 가능성을 확립하는 것이었습니다.
ADSC가 함유된 유전자 활성화 스캐폴드가 질적 치유를 향상시킬 수 있다는 또 다른 지표는 유전자가 없는 스캐폴드 그룹에서 고르지 않은 세포외 분비물 대신 섬유질 엘라스틴 매트릭스의 침착입니다. 엘라스틴 침착은 태아의 흉터 없는 상처 치유를 유도하는 주요 활동 중 하나입니다.71]. 그러나 성인 피부는 엘라스틴 침착이 부족합니다.71]. 이와 같이 엘라스틴의 전구체인 트로포엘라스틴은 종종 상처 치유에서 흉터를 제어하기 위해 생체 재료 스캐폴드에 통합됩니다.72]. 종합하면 우리의 발견은 ADSC/ -Klotho 유전자 활성화 스캐폴드 구조는 생체 내에서 강력한 항섬유화 반응을 부여할 수 있습니다.
4. 재료 및 방법
4.1. 유전자 활성화 스캐폴드의 준비
유전자 활성화 스캐폴드는 2-단계 프로세스를 사용하여 개발되었습니다. 첫째, 소 힘줄 1형 콜라겐과 상어 연골에서 추출한 콘드로이틴-6- 황산염(Sigma, UK)의 동결 건조 슬러리로 고체 다공성 콜라겐-콘드로이틴 설페이트 스캐폴드를 제작했습니다. 균일한 기공을 생성하도록 설계된 최적화된 동결 건조 공정을 사용하여 스캐폴드를 생산했습니다.73]. 게시된 프로토콜을 기반으로 [74], 동결건조 스캐폴드는 105℃에서 탈수열(DHT) 처리되었다.◦멸균 및 기계적 개선을 위해 진공 상태에서 C. 이어서 멸균된 스캐폴드를 14 mM N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride 및 5.5 mM N-Hydroxysuccinimide(2.5 몰 비율의 EDC/NHS)(Sigma, UK) 용액으로 화학적으로 가교하여 기계적 안정성을 더욱 향상 [75]. 가교결합된 스캐폴드를 PBS(Gibco, Paisley, UK)로 세척하여 잔여 화학물질을 제거하였다. 스캐폴드가 준비되면 N/P10 비율(질소 대 인산염 비율)의 폴리플렉스는 예정된 부피의 분지형 폴리에틸렌이민(PEI) 용액과 인간 베타-클로토 유전자를 암호화하는 플라스미드 DNA(pDNA)를 혼합하여 준비되었습니다. -Klotho), 중국 베이징 소재의 SinoBiological로부터 입수. N/P10 비율은 N/P10 비율로 제형화된 폴리플렉스가 GLuc(5.76kb) 만큼 큰 플라스미드를 가진 작고 안정적인 양이온 나노입자를 효과적으로 형성할 수 있다는 이전 연구를 기반으로 선택되었습니다.21,23]. 사용하기 전에 플라스미드를 내독소가 없는 물에 희석하여 작업 농도를 얻었습니다.0.5 중µg/µL. 플라스미드는 인간 강화된 즉시-초기 사이토메갈로바이러스를 포함합니다.(CMV3) 프로모터는 인코딩된 높은 수준의 안정적이고 일시적인 발현을 촉진합니다.포유류 세포의 유전자.
플라스미드/PEI 혼합물을 30분 동안 침전시켜 폴리플렉스로 자가 조립했습니다.나노입자. 그런 다음 나노입자를 피펫팅을 통해 스캐폴드에 담가 두었습니다.스캐폴드 측면당 폴리플렉스 용액의 동일한 부피. 총 2µg pDNA는유전자 활성화 스캐폴드를 개발하기 위해 스캐폴드당 사용됩니다.
4.2. 셀 시드 사용 -Klotho 유전자 활성화 스캐폴드
인간 ADSC(iXCells Biotechnologies, San Diego, CA, USA)는 회사에서 공급한 ADSC 성장 배지(Cat no. MD0003)에서 계대 4로 확장되었습니다. 총 5개× 105 ADSC(2.5× 105 측면당)을 유전자가 없는 스캐폴드(대조군,n = 3) 또는 유전자 활성화 스캐폴드(테스트,n = 3). 약 20분 동안 세포를 침전시킨 후, 2 mL의 형질감염 배지 OptiMEM(Gibco, UK)을 첨가하고, 세포화된 스캐폴드를 37℃에서 배양하였다.◦24시간 동안 C. 24시간 배양 후, 세포화된 유전자가 없거나 유전자 활성화된 스캐폴드를 새로운 12-웰 플레이트로 옮기고 2mL의 ADSCs 성장 배지를 공급했습니다. 배지 교환은 14일까지 3-4일마다 1mL의 컨디셔닝 배지(CM)를 수집하고 동일한 부피의 신선한 배지로 교체하여 수행되었습니다. 모든 CM은 다음에 저장되었습니다.−80 ◦C 분석까지.
4.3. qRT-PCR 분석을 통해 결정 -Klotho 유전자 과발현 및 기능 유전자 활성화
표적 유전자의 일시적인 조절을 결정하기 위해, 세포를 무-유전자 또는 유전자-활성화 스캐폴드에 시딩 후 3일(초기) 및 14일(후기)에 수확하였다. 먼저 Qiazol 용해 시약(Qiagen, Germantown, MD, USA)을 사용하여 세포를 용해시켰다. 그런 다음 클로로포름을 첨가하여 세포 용해물을 단백질, DNA 및 RNA 상으로 분리했습니다. RNeasy Kit(Qiagen, Manchester, UK)를 사용하여 RNA를 추출하고 Multiskan Go plate reader(Thermo Scientific, UK)를 사용하여 흡광도를 260 nm로 설정하여 RNA의 품질과 양을 측정했습니다. 그런 다음 RNA를 게놈 DNA 와이프아웃 버퍼(Qiagen, Manchester, UK)와 혼합하고 42℃로 가열하여 게놈 DNA를 제거했습니다.◦C에서 2분 동안. 그 후, 역전사를 수행하여 cDNA를 제조하였다. 복제당 cDNA 복제(n = 3)을 qRT-PCR 플레이트에 로드한 다음 표에 나열된 프라이머를 사용하여 분석을 실행했습니다.1. 유전자가 없는 스캐폴드 상의 세포에 대한 mRNA 발현의 배수 변화는 2−∆∆CT그룹당 평균 3회 복제 방법. 인간 GAPDH(Hs_GAPDH_1_SG, Cat. No. QT00079247)를 하우스키핑 유전자로 사용했습니다.
4.4. ADSC의 분비 인자에 대한 생체활성 분석 -Klotho 유전자 활성화 스캐폴드
4.4.1. Pro-Angiogenic Bioactivity 분석
4.4.2. 피부 섬유아세포 치유 및 성숙 분석
혈관신생 분석 후 인간 성인 피부 섬유아세포(iXcells, Cat no. 10 HU-014)의 스크래치 분석을 사용하여 피부 치유에 대한 CM의 효능을 조사했습니다. 이 연구를 위해 우리는 성숙 중 섬유아세포 상처 봉합에 미치는 영향을 연구하기 위해 14일째부터 노인 CM을 구체적으로 선택했습니다. 총 1× 104 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고 섬유아세포 성장 배지에서 밤새 배양했습니다. 다음날, 웰을 가로질러 200uL 피펫 팁을 수평으로 긁음으로써 단일층에 상처를 생성했습니다. 그런 다음 단층을 PBS로 헹구어 파편을 제거하고 CM을 공급했습니다. 상처 봉합은 스크래치 후 12-16시간 사이에 기록되었습니다. Immunostaining은 섬유아세포에서 pro-fibrotic collagen I(1:100, Novusbio, UK) 및 anti-fibrotic collagen III(1:100, Novusbio, UK)의 발현을 연구하기 위해 사용되었습니다. F-액틴 영상화를 위해 섬유아세포를 로다민(1:800, Abcam, UK)으로 대조염색하였다. 섹션에 설명된 대로 면역염색을 수행했습니다.4.5, 조직 처리 및 파라핀 제거를 제외하고. HUVEC와 섬유아세포 모두 4회 계대에서 사용되었습니다.
4.5. 세포외 매트릭스 단백질의 면역형광 이미징
배양 14일 후, 면역형광법을 사용하여 기질 침착을 검출하기 위해 세포화된 무 유전자 또는 유전자 활성화 스캐폴드를 수확하였다. 샘플 처리는 이전에 설명한대로 수행되었습니다. 간략하게, 먼저 스캐폴드를 PBS로 세척하고 10% 중성 완충 포르말린에 20분 동안 고정시켰다. 그런 다음 고정된 샘플을 탈파라핀화를 위한 표준 프로토콜을 사용하여 처리했습니다. 그런 다음 블록을 7-로 절단했습니다.µm 두께의 슬라이스 및 충전된 슬라이드에 수집됩니다. 그런 다음 절편을 크실렌을 사용하여 탈파라핀화한 다음 에탄올 구배를 줄이면서 절편을 재수화했습니다. 그 후, 세포는 0.2% Tween으로 투과되었습니다.®20 (Sigma-Aldrich, France) PBS에 30분 동안 용액(10분 세척)× 3) 10% NGS(Normal Goat Serum, Invitrogen, Rockford, IL, USA)/5% BSA/0.3M 글리신(투과성 용액으로 제조)을 사용하여 1시간 동안 차단했습니다. 블로킹 후 슬라이드를 PBS로 헹구고 4℃에서 배양합니다.◦표에 나열된 표적 매트릭스 단백질에 대한 항체와 함께 밤새 C2. 다음 날, 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 슬라이드를 각각 2-3분 동안 PBS에서 세 번 헹구었습니다. 그 후, 슬라이드를 Alexa 488-접합 염소 항-마우스 IgG(A32723, Invitrogen, UK) 또는 Alexa 594-접합 염소 항-토끼 IgG(A11012, Invitrogen, UK)에서 1:1로 배양했습니다. 어두운 곳에서 1시간 동안 실온에서 800 희석. 헹굼 단계는 이전과 같이 수행되었으며 DAPI(ab104139, Abcam, UK)가 포함된 마운팅 매체를 사용하여 핵에 대해 대조염색되었습니다. 슬라이드는 형광 현미경(Olympus BX43, 일본)을 사용하여 20℃에서 이미지화되었습니다.× 목적. 2차 항체만 배양한 샘플을 대조군으로 사용했습니다.
이미지 정량화
Image] 소프트웨어(Image, NIH, MD, USA)를 사용하여 발현된 단백질의 양을 반정량적으로 결정하였다. 각 마커에 대해 먼저 다양한 섹션의 예비 이미징을 통해 일정한 임계값을 결정했습니다. 설정된 임계값을 사용하여 이미지의 통합 밀도(염색 영역 x 평균 회색 값)를 결정한 다음 세포 수(DAPI 계산)로 정규화하여 세포당 최종 평균 형광 밀도를 제공했습니다. 평균은 그룹당 최소 3개의 복제로 복제당 8-10개의 임의 이미지에서 정량화되었습니다. 3회 복제/그룹에서 얻은 평균을 그룹 간의 상대적인 발현을 측정하는 데 사용했습니다.
4.6. 통계 분석
모든 결과는 평균 + 표준 편차로 표현됩니다. Unpaired, two-tailed t-test는 일반적으로 그룹 간의 통계적 유의성을 계산하는 데 사용되었으며 여기서 p < 0.05는 유의한 것으로 간주되었습니다.
이 연구는노화 방지 -Klotho 유전자 활성화 식염수제어 제공 ADSC의 재생 능력 활성화. 이 연구의 주요 결과는 (1)줄기세포 다능성 및 항섬유화 반응의 일시적인 향상, (2)혈관신생에 대한 측분비 조절 개선, 섬유화 콜라겐 리모델링피부 섬유아세포에서, 궁극적으로 (3)기저막의 성숙 증가흉터 관련 단백질 발현 조절. 결론적으로 이러한 결과는ADSC가 가득한 -Klotho 유전자 활성화 지지체는 큰 잠재력을 가질 수 있습니다.광범위한 피부 상처를 치료합니다.
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이해 상충:저자는 어떠한 이해 상충도 존재하지 않는다고 선언합니다.
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