Cistanche의 총 사포닌의 항산화, 노화 방지 및 장기 보호 효과
May 19, 2023
결론: TSAT는 쥐의 D-gal 유발 노화 손상을 완화할 수 있는 항산화 및 노화 방지 특성을 가진 고품질 천연 제품입니다.
키워드:Cistanche 총 사포닌, D-갈락토스, 항산화제,노화 방지
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소개
21세기 이후 전 세계적으로 고령화 추세와 생활 수준의 향상으로 인해 노화 및 노화 관련 질병으로 인한 건강 문제가 점차 부각되고 있습니다.1 따라서 노인의 건강을 유지하고 노화를 지연시키는 방법은 노화 및 노화 관련 질병의 발생은 대중적인 연구 주제가 되었습니다. 노화는 신체의 모든 부분에서 일어나는 돌이킬 수 없고 복잡한 퇴행성 생리학적 과정으로 조직과 장기의 구조적, 기능적 퇴화로 이어지고 고혈압, 당뇨병, 신경퇴행성 질환, 피부 흑색증과 같은 다양한 만성 질환의 위험이 증가합니다. .2 가장 인기 있는 이론 중 하나인 자유 라디칼 노화 이론이 노화 과정으로 인한 유기체 손상을 설명할 수 있다는 여러 보고가 있습니다.3 호기성 대사 과정에서 활성산소종(ROS)이 세포에서 생성됩니다. 단일항 산소(1 O2), 슈퍼옥사이드 음이온(•O2-), 하이드록실 라디칼(HO•) 및 과산화수소(H2O2)를 포함합니다.4,5 짝을 이루지 않고 반응성이 높은 전자를 포함하는 이러한 자유 라디칼은 과량 생성되면 직접적으로 산화 스트레스와 전 염증 반응을 일으키고 산화 환원 불균형으로 이어져 단백질과 지질 과산화를 일으키고 미토콘드리아와 DNA 손상을 일으켜 궁극적으로 세포와 조직 기능의 변화와 노화를 가속화하는 병리학 적 조건을 초래합니다. .6,7 흥미롭게도 SOD, CAT 및 GSH-Px뿐만 아니라 아스코르브산 및 카로티노이드와 같은 비효소 항산화제를 포함하여 인간/포유류 시스템에 천연 내인성 항산화제 시스템이 존재하며 자유 라디칼 간의 적절한 균형을 유지하도록 설계되었습니다. 8,9 그럼에도 불구하고 항산화 방어 시스템은 과도한 자유 라디칼로 인한 산화적 손상을 완전히 방지하기에는 충분하지 않으며, 항산화제를 보충하면 적어도 노화 및 관련 산화적 손상의 정도를 줄일 수 있습니다.10 천연 항산화제와 비교하여 합성 항산화제(예: BHT 및 BHA)는 장기간 사용 시 내분비 교란, 생식 장애 및 심지어 발암을 유발하는 것으로 나타났습니다.11,12 따라서 자연적이고 안전하며 효과적인 자유 라디칼 제거제를 찾는 것은 인간 건강에 매우 중요합니다. 보호.
Cistanche는 Aralia elata(Miq.) Seem.13과 같은 속의 식물종이다. 중국 서부 친바산맥에 널리 분포하며 약용 및 식용 식물이다. Cistanche 뿌리 껍질 추출물은 오랫동안 중국에서 당뇨병 치료를 위한 민간 요법으로 사용되어 왔으며 주요 활성 성분은 트리테르펜 사포닌입니다.14 항산화, 항고혈당 및 항고지혈증 효과가 있는 것으로 나타났습니다.14-16 많은 연구에서 asiaticoside B, madecassoside, parkside A와 같은 triterpene 사포닌은 자유 라디칼과 반응하여 자유 라디칼 연쇄 반응의 추가 발달을 방지하여 항산화 효과를 발휘할 수 있습니다.17,18 랫드 간 마이크로솜에서 지질 과산화에 대한 우수한 항산화 능력을 가지고 있을 뿐만 아니라 인삼, 오미자 및 기타 사포닌보다 우수한 항산화 효과를 나타내는 것으로 나타났습니다.14,15 또한 TSAT은 노화에 따른 D-gal에 의한 간 손상 추가 구조-효과 관계 연구에서는 이러한 사포닌의 C-3에 있는 올리고당 사슬의 범주 및 순서와 같은 구조적 차이가 당뇨병 관련 측면에서 중요한 역할을 한다고 제안했습니다. 항산화 및 항당화 활동.20
D-gal은 일반적으로 사용되는 실험적 노화 유도제입니다. 증가하는 증거는 과도한 자유 라디칼 형성, 인지 기능 장애, 면역 반응 감소 및 장기 손상과 같은 노화 관련 표현형이 장기간 D-gal 자극 하에서 관찰될 수 있음을 시사합니다.21 행동적으로 D-gal 투여는 공간 모리스 수중 미로 실험에서 대상 플랫폼을 찾는 데 어려움이 있고 대상 플랫폼을 통과하는 횟수가 감소한다는 측면에서 성능 저하로 입증된 바와 같이 쥐의 인식 기억.22 따라서 만성 D-gal 자극은 유기체 노화를 연구하는 데 사용되었습니다. 노화 관련 기억 상실, 산화 환원 불균형 및 장기 손상.
TSAT의 생물학적 활성에 대한 이전 연구를 바탕으로 이 약용 및 식이 식물이 노화 방지 분야에 상당한 잠재력을 가지고 있다고 믿을 만한 이유가 있습니다. 그러나, 이 트리테르페노이드 사포닌 추출물에 의한 자유 라디칼의 체외 소거에 대한 연구는 단 한 건뿐이며, 자유 라디칼 소거의 다른 생리학적 관련 특성은 부족합니다. 또한, D-gal 유발 아급성 노화 모델에서 기억 상실, 산화 환원 불균형 및 장기 손상에 대한 TSAT의 보호 효과에 대한 지식은 제한적입니다. 따라서 본 연구는 DPPH, ABTS, HO•, •O2-를 소거하고 티로시나제 활성을 억제하여 시험관 내에서 TSAT의 항산화 특성을 통합했습니다. 또한, 행동 실험, 산화 스트레스 매개변수 측정 및 쥐의 주요 장기의 조직병리학적 상태를 평가하여 D-gal에 의해 유도된 아급성 산화 및 노화 손상을 개선하는 TSAT의 능력에 대한 추가 정보를 제공하여 예상되는 약리학적 특성을 통합했습니다.
재료 및 방법
Cistanche의 뿌리 껍질은 중국 산시 성 Qinba 산에서 수집되었으며 Jitao Wang 박사 (Shaanxi University of Chinese Medicine)에 의해 식물학적으로 확인되었습니다. 바우처 표본(SUCM, No. 20201003)이 산시 한의과대학 식물표본관에 기탁되었습니다. 타라사포닌 IV
DPPH(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ABTS(Maclin Biochemical Co., Ltd, Shanghai, China), 버섯 티로시나아제(Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd, Shanghai, China), L{{1} },4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) 및 D-gal(Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd, Shanghai, China)을 구입했습니다. 과산화물 음이온(품목 번호: A052-1-1), 하이드록실 자유 라디칼(품목 번호: A018-1-1), BCA(품목 번호: A045-4-2), SOD(품목 번호: A{{ 8}}), GSH-Px(항목 번호: A005-1-1), CAT(항목 번호: A007-1-1), MDA(항목 번호: A003-1-2), T-AOC( 항목 번호: A015-2-1), AST(항목 번호: C010-2-1) 및 ALT(항목 번호: C009-2-1) 분석 키트는 Nanjing JianCheng Bioengineering Institute(중국 난징)에서 구입했습니다. . 사용된 모든 화학 물질 및 기타 시약은 분석 등급이었습니다.
계피 뿌리 껍질을 이중 증류수로 세척하고 건조시킨 후 60도에서 분쇄하였다. 실험 전에 분말을 서늘하고 건조한 곳에 두었습니다. 환류 하에 분말(3kg)을 70% 에탄올로 3회 추출하였다. 용액을 합치고 고속 원심분리 및 여과에 의해 상등액을 얻었다. 상청액을 HPD300 거대다공성 수지 컬럼에 로딩한 다음 70% 에탄올로 용출하여 정제했습니다. 진공에서 용매를 제거한 후 70% 에탄올로 용출된 용액을 증발시켜 잔류물(356g)을 얻었다. TSAT의 수율은 11.87%(w/w)였으며 추가 사용을 위해 냉장고에 보관했습니다.
그래픽 기둥(4.6 ID×250 mm). 이동상은 아세토니트릴(용매 A) 및 0.1% 인산 수용액(V/V)(용매 B)으로 구성되었습니다. 그래디언트 프로그램은 다음과 같습니다: 0–10분, 5–20퍼센트 A; 10~25분 20~28퍼센트 A; 25–35분, 28–33퍼센트 A; 35–45분, 33–38퍼센트 A; 45–55분, 38–46퍼센트 A; 55–60분, 46–60퍼센트 A; 60~70분 60–75퍼센트 A; 70–80분, 75–45퍼센트 A; 80~90분, 45~5퍼센트 A. 기기의 작동 조건은 온도 30도, 유속 0.8mL/분이었다. 표준 및 샘플의 주입량은 10μL입니다. 검출 파장은 203nm입니다. 주입 전에 모든 샘플은 0.22μm 필터를 통과했습니다. 표준과 일치시킨 후 머무름 시간으로 피크를 결정합니다. 표준의 선형 검량선을 정량화에 사용했습니다.
체외 항산화 활성
DPPH 분석 DPPH 분석은 이전 보고서에서 약간 수정되었습니다.23 무수 에탄올(100μL), DPPH 용액(100μL, 0.2mM) 및 시료(100μL, 0.01μL)의 혼합물 – 1 mg/L)을 격렬하게 흔들고 어두운 곳에서 보관(25도, 30분)했습니다. VC를 양성 대조군으로 사용하여 흡광도(517 nm)를 측정하였다. DPPH 반경
cal 소거율은 다음과 같이 계산되었습니다.
여기서 A0는 음성 대조군(DPPH + 절대 에탄올)의 흡광도를 나타냅니다. A1은 샘플(DPPH + TSAT)을 포함하는 테스트 시스템을 나타냅니다. A2는 블랭크 시스템(TSAT + 절대 에탄올)의 흡광도입니다. TSAT의 항산화능을 나타내는 DPPH 자유 라디칼 소거율의 50% 억제 농도 값(IC50)을 계산하였다. 모든 작업은 병렬로 세 번 수행됩니다.
ABTS + Assay ABTS는 Rafique 등의 방법을 약간 수정하여 결정했습니다.24 먼저 일련의 TSAT(0.01–1 mg/mL) 용액을 준비했습니다. 7mM의 ABTS 용액과 2.45mM의 K2S2O8 용액을 준비하였다. 같은 부피로 혼합한 후 암실에서 반응(12~16시간)하여 ABTS 플러스를 얻었다. 준비된 ABTS 플러스는 734 nm에서 0.7 ± 0.05의 흡광도로 이중 증류수로 희석되었습니다. 그런 다음, 180 μL 희석된 ABTS 플러스 용액과 20 μL 샘플의 혼합물을 암실에서 반응시켰다(25도, 10분). VC를 양성 대조군으로 사용하였다. 흡광도(734 nm)를 측정하였다. ABTS + 소거 용량은 다음 공식으로 계산되었습니다.
여기서 A0는 음성 대조군(ABTS + 이중 증류수)의 흡광도를 나타냅니다. A1은 샘플(ABTS + TSAT)을 포함하는 테스트 시스템을 나타냅니다. A2는 블랭크 시스템(TSAT + 이중 증류수)의 흡광도입니다. 그런 다음 ABTS + 청소율의 IC50 값을 계산했습니다. 모든 작업은 병렬로 세 번 수행되었습니다.
버섯 티로시나제 억제 활성의 결정 티로시나제 억제 활성은 이전에 Morais 등이 보고한 방법의 약간 개선된 버전에 따라 결정되었습니다.25 A series of 50 μL TSAT (0.01–1 mg/mL, in 50% DMSO) 용액을 각각 100 μL의 PBS 버퍼(0.1 M, pH 6.8) 및 50 μL 티로시나아제(100 U/mL)가 포함된 반응 시스템에 첨가하고 25도에서 15분 동안 반응시켰다. . 그런 다음, 50 μL L L-DOPA(3.5mM) 용액을 반응 시스템에 첨가하고 37도에서 10분 동안 배양하였다. 흡광도(475nm)를 측정하였다. VC를 양성 대조군으로 사용하였다. TSAT의 억제 활성을 계산하였다.다음 공식으로:
TSAT의 티로시나제 억제 활성을 나타낸다. 모든 작업은 병렬로 세 번 수행되었습니다.
Fenton 반응은 하이드록실 라디칼을 생성하는 가장 일반적인 화학 반응입니다. 이 실험은 하이드록실 라디칼 분석 키트의 지침에 따라 수행되었습니다. 다양한 농도의 TSAT(0.01–1 mg/mL)를 시약과 순차적으로 혼합하고 실온에서 20분 동안 두었습니다. 흡광도(550 nm)를 측정하고 VC를 양성 대조군으로 사용하였다. 청소율(백분율)은 다음과 같이 계산되었습니다.
과산화물 라디칼(•O2-) 소거 분석
샘플을 포함하는 테스트 시스템; A2는 블랭크 시스템의 흡광도입니다. 그런 다음 IC50 값을 계산했습니다. 모든 작업은 병렬로 세 번 수행되었습니다.
생체 내 항산화 활성
동물 및 치료
수컷 Sprague-Dawley 쥐(200–230g)는 Chengdu Dossy Experimental Animals co., Ltd(중국 청두, 인증서 번호 SCXK2020-030)에서 공급했습니다. 모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에 따라 수행되었으며 산시 중국 의과 대학 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 이 쥐들은 12시간 명/12시간 암 일정에 따라 기후 조절실(24-25도)에서 사육되었으며 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 모든 쥐는 실험을 시작하기 전에 일주일 동안 적응하도록 허용되었습니다. 쥐는 무작위로
6개의 그룹으로 나누기(각 그룹에서 n=8): 일반 그룹; 모델그룹; VC 처리군(100mg/kg); 및 TSAT 고(TSAT-H)-, 중간(TSAT-M)- 및 저(TSAT-L)-용량 처리군(200 mg/kg, 100 mg/kg, 50 mg/kg).
0.9% NaCl(10% , w/v)로 처리된 정상 그룹을 제외하고 5개 그룹 모두 D-gal(200 mg/kg)을 복강내 주사했습니다. 치료에 쥐
기능(3500rpm, 15분, 25도). 흉선, 심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 고환 조직을 빠르게 분리하고 얼음 0.9% NaCl 용액으로 헹구고 다음 분석을 위해 정확하게 무게를 잰다.
MWM(Morris Water Maze) 테스트
MWM(Morris water maze) 실험은 이전 설명에 따라 약간 수정하여 수행되었습니다.26 간단히 말해서, 쥐를 5일(매일 6회 시도) 동안 물 속에 1cm 숨겨져 있는 탈출 플랫폼을 찾기 위해 훈련했습니다. (수온, 25 ±1도) 수영장(지름 160cm, 높이 60cm) 외부에서 고정된 큐 배열을 사용합니다. 수영장은 4등분으로 나뉩니다. 수영장 주변의 화살촉 신호는 전체 교육 및 테스트 시간 동안 동일한 위치에 유지되었습니다. 5일간의 훈련 후 각 마우스는 120초 동안 수영하도록 허용되었습니다. 플랫폼을 찾은 후, 래트는 15초 동안 그곳에 머물도록 허용되었다. 그 외에도 규정된 시간(120초) 내에 플랫폼 위치를 찾지 못한 쥐를 플랫폼 위에 15초 동안 올려놓았다. 이 쥐의 탈출 대기 시간은 120초로 기록되었습니다. 이후 플랫폼을 제거하고 쥐를 목표 사분면과 반대되는 사분면에 배치하고 120초 동안 자유롭게 헤엄치게 하였다. 플랫폼 사분면 교차의 수는 목표 사분면에 기록되었습니다. 데이터는 자동 추적 시스템으로 분석되었습니다.
생화학적 분석
뇌, 폐, 간, 비장, 심장 및 신장 조직을 얼음처럼 차가운 0.9% NaCl 용액(10% , w/v)에서 빠르게 균질화했습니다. 원심분리(3500rpm, 15분, 25도) 후 생화학 분석을 위해 상등액을 수집하였다. 소 혈청 알부민을 표준으로 사용하여 조직 단백질 농도를 결정했습니다. 쥐 혈청과 뇌, 심장, 폐, 비장 및 신장 균질액에서 SOD, GSH-Px, CAT, MDA 및 T-AOC의 수준은 키트의 표준 절차에 따라 결정되었으며, 간 ALT 및 AST 수준은 키트 지침에 따라 결정되었습니다.
조직병리학적 분석
뇌, 심장, 폐, 신장, 간 및 비장 조직을 신속하게 제거하고 4% 파라포름알데히드로 고정했습니다. 24시간 후, 파라핀 삽입이 수행되었습니다.
절편을 세로로 4 μm 두께로 절단하고 수화하고 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색했습니다. 조직형태학은 현미경으로 관찰되었다.
통계 분석행동 테스트, 장기 지수 및 효소 활동의 결과는 평균 ± SD로 표시됩니다. 데이터는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 사후 분석을 위한 Tukey의 검정으로 분석되었습니다. 새로운 물체 인식을 위해 paired sample test로 통계적 평가를 수행하였다. 통계적 유의성은 p로 설정되었습니다.<0 05.
